Protocole expérimental pour la détection cyanobactéries Dans les échantillons liquides et solides avec un anticorps Microarray Chip

Résumé

La présence de toxines cyanobactériennes dans les réservoirs d’eau douce destinée à la consommation humaine est une préoccupation majeure pour les autorités chargées de la gestion de l’eau. Afin d’évaluer le risque de contamination de l’eau, cet article décrit un protocole de détection sur le terrain des souches de cyanobactéries dans des échantillons liquides et solides à l’aide d’une puce à microréseaux d’anticorps.

Résumé

Le réchauffement climatique et de l'eutrophisation font certains écosystèmes aquatiques se comportent comme de véritables bioréacteurs qui déclenchent la croissance des cyanobactéries rapide et massive; cela a la santé pertinente et des conséquences économiques. De nombreuses souches de cyanobactéries sont des producteurs de toxines, et seulement quelques cellules sont nécessaires pour induire des dommages irréparables à l'environnement. Par conséquent, les autorités de l'eau du corps et les administrations ont besoin de systèmes d'alerte précoce rapides et efficaces qui fournissent des données fiables pour appuyer leurs décisions préventives ou curatives. Ce manuscrit rapporte un protocole expérimental pour la détection sur le terrain des souches de cyanobactéries produisant des toxines en utilisant une puce de microréseau d'anticorps avec 17 anticorps (ABS) avec résolution taxonomique (de CYANOCHIP). Ici, un fluorescent immunologique sandwich microarray multiplex (FSMI) pour la surveillance simultanée des 17 souches de cyanobactéries trouve fréquemment floraison dans les écosystèmes d'eau douce, certains d'entre eux les producteurs de toxines, est décrite. Un microréseau multiple répétitions identiques (jusqu'à 24) du CYANOCHIP a été imprimé sur une lame de microscope unique pour tester simultanément un nombre similaire d'échantillons. les échantillons liquides peuvent être testés soit par incubation directe avec l'anticorps (Ab) ou après concentration des cellules par filtration à travers un filtre de 1 à 3 pm. Les échantillons solides, comme les sédiments et les roches du sol, sont d'abord homogénéisés et dispersés par un appareil à ultrasons portatif dans un tampon d'incubation. Ils sont ensuite filtrés (5-20 um) pour éliminer la matière grossière, et le filtrat est incubé avec Abs. Immunoréactions sont révélés par une incubation finale avec un mélange de 17 Abs marqué par fluorescence et sont lues par un détecteur de fluorescence portatif. L'ensemble du processus prend environ 3 h, la plupart de celui-ci correspondant à deux périodes d'incubation de 1 h. La sortie est une image, où des points lumineux correspondent à la détection positive des marqueurs de cyanobactéries.

Introduction

La détection et la surveillance des micro-organismes dans les communautés microbiennes naturelles complexes sont cruciales dans de nombreux domaines, y compris la biomédecine, l'écologie de l'environnement, et l'astrobiologie. Les cyanobactéries sont des micro - organismes procaryotes bien connus pour leur capacité à former des fleurs (prolifération excessive) des cellules dans l' eau douce. Ils sont omniprésents, et de nombreuses espèces sont capables de produire des toxines, ce qui conduit non seulement à un risque potentiel pour la santé humaine, mais aussi à un impact écologique. À cet égard, il est essentiel de développer des méthodes rapides et sensibles pour la détection précoce des cyanobactéries et / ou leurs toxines dans le sol et l' eau. A cet effet, un fluorescent immunologique sandwich microarray multiplex (FSMI) a été développé comme un outil pour les gestionnaires de l'eau afin de les aider à prendre des décisions et, par conséquent, la mise en œuvre des programmes de gestion de l'eau.

Un large éventail de méthodes a été développé pour détecter et identifier cyancellules obacterial et cyanotoxines dans le sol et l'eau, y compris la microscopie optique, la biologie moléculaire et des techniques immunologiques. Ces méthodes peuvent varier considérablement dans les informations qu'ils fournissent. Techniques microscopiques sont basés sur la morphologie des cellules et la détection de la fluorescence in vivo à partir de pigments, tels que les cyanobactéries phycocyanine ou la chlorophylle a ^1. Bien qu'ils soient des méthodes rapides et bon marché pour en temps réel et une surveillance fréquente qui informent sur le type et le nombre de cyanobactéries présentes dans un échantillon, ils ne donnent pas d' informations sur la toxicité potentielle. En outre, ils ont besoin d' un certain niveau d'expertise, estimant qu'il est souvent très difficile de faire la distinction entre les espèces étroitement apparentées ^2. Pour surmonter ces limitations, la microscopie optique doit être accompagnée par les deux essais de criblage biologiques et biochimiques et méthodes physico-chimiques pour l'identification et la quantification des cyanotoxines.

dosages immuno-enzymatiques (ELISA), des essais d'inhibition de phosphate de protéines (LPRP), et des tests neurochimiques chez la souris sont des exemples de tests de dépistage biochimiques pour la détection de cyanotoxines. Alors que les deux premiers sont des méthodes rapides et sensibles, les faux positifs ont été décrits lors de l'utilisation des tests ELISA et ÉPFVP sont limités à trois types de toxines. Le test souris est une technique qualitative avec une faible sensibilité et la précision, et une licence spéciale et de formation est nécessaire. En outre, il ne donne pas d'informations sur le type de toxines présentes dans un échantillon. Cyanotoxines peuvent être identifiés et quantifiés par d'autres méthodes d'analyse, telles que la chromatographie liquide à haute performance (HPLC), la spectrométrie de chromatographie en masse liquide (LC-MS), chromatographie en phase gazeuse (GC), chromatographie-spectrométrie de masse de gaz (GC-MS), ou laser temps désorption / ionisation assistée par matrice de vol (MALDI-TOF). Toutefois, cela est possible uniquement si les normes de référence, qui sont besoined pour déterminer les concentrations de toxines individuelles dans des échantillons complexes, sont disponibles ^{3, 4.} En outre, ces procédés prennent du temps; nécessitent des équipements coûteux, les fournitures et la préparation des échantillons; et doit être exécuté par un personnel expérimenté et spécialisé.

Les méthodes moléculaires à base ont été appliquées depuis des décennies pour détecter, identifier et quantifier les cyanobactéries et cyanotoxines leurs correspondants grâce à l'information de séquence publiée dans les bases de données du génome (par exemple, National Center for Biotechnology Information, NCBI). Parmi ces méthodes sont celles basées sur l'amplification en chaîne par polymérase (PCR), ce qui nécessite la conception d'ensembles d'amorces pour l'amplification de l'ADN et dépendent de la connaissance préalable des séquences d'ADN de différentes espèces de cyanobactéries. Bien que la détection du gène, comme l'opéron phycocyanine, conduit à une identification précise au niveau du genre, certaines espèces ou souches ne sont pas détectés aveccette méthode. Cependant, les gènes codant pour une toxine, tels que ceux appartenant à l'opéron microcystine, faciliter l'identification des toxines dans les échantillons où les producteurs sont rares ^5. Néanmoins, la détection de marqueurs de toxine par PCR ne signifie pas nécessairement une toxicité dans l'environnement. En outre, l'ensemble des amorces développées pour analyser l'ensemble des espèces de producteurs de cyanobactéries et de toxines présentes dans un échantillon est encore incomplète, et d' autres études doivent être réalisées pour identifier des espèces inconnues. D' autres techniques de biologie moléculaire sont basées sur la PCR-non, comme l' hybridation fluorescente in situ (FISH) , et des puces à ADN dans.

Au cours des deux dernières décennies, la technologie des microréseaux a gagné en importance dans de nombreux domaines d'application, en particulier dans la surveillance environnementale. Les puces à ADN permettent une distinction entre les espèces et les analytes ^{4, 6, 7} sup>, ^{8, 9, 10,} mais elles sont considérées comme très laborieuse et prend du temps des tâches qui impliquent plusieurs étapes (par exemple, les performances des puces à ADN, l' extraction de l' ADN, amplification par PCR et d' hybridation). Pour cette raison, les dosages moins consommatrices de temps basées sur des anticorps, tels que les biopuces immunologiques sandwich et compétitives, sont devenus une méthode à haut débit essentiel et fiable pour la détection d'analytes multiples de l' environnement ^{11, 12, 13.} La capacité des anticorps à reconnaître spécifiquement les composés cibles et de détecter de petites quantités d'analytes et de protéines, ainsi que la possibilité de produire des anticorps contre pratiquement toute substance, faire microréseaux d'anticorps une technique puissante pour des fins environnementales. En outre, la possibilité de réaliser des analyses multiples en tant quedosage Ingle, avec des limites de détection variant de ppb à ppm, est l' un des principaux avantages de cette méthode ^14.

Biocapteurs à base d' anticorps se sont révélés être des outils sensibles et rapides pour la détection d'une large gamme d'agents pathogènes et de toxines dans la surveillance environnementale ^{15, 16, 17, 18, 19, 20, 21.} Bien que les méthodes d'ADN impliquent plusieurs étapes, les microréseaux à base d'anticorps ne nécessitent qu'une petite préparation de l'échantillon qui est principalement basée sur une étape de lyse courte dans un tampon de solution appropriée. Ligler Delehanty et ¹⁵ ont rapporté la détection simultanée des protéines bactériennes et des analytes dans des mélanges complexes à base d'un dosage immunologique sandwich d' anticorps capable de détecter une concentration en protéine de 4 parties par milliard d'j 10 ⁴ ufc / ml de cellules. Szkola et al. ²¹ ont développé un microréseau multiplex fiable et pas cher pour la détection simultanée de proteotoxins et de petites toxines, des composés qui pourraient être utilisés dans la guerre biologique. Ils ont détecté des concentrations de toxine ricine, avec une limite de détection de 3 parties par milliard, en moins de 20 min. Récemment, le CYANOCHIP, un biocapteur basé sur un microréseau d'anticorps pour la détection in situ de cyanobactéries toxiques et non toxiques, a été décrite ^22. Cette microarray permet l'identification des cyanobactéries blooms potentiels, surtout dans les milieux aquatiques, qui sont difficiles à identifier au microscope. La limite de détection de la puce est de 10 ^{mars 2 à 10} cellules pour la plupart des espèces, en tournant ce biocapteur dans un outil rentable pour la détection multiplex et l' identification des cyanobactéries, même au niveau de l' espèce. Toutes ces propriétés font l'Antibotechnique de microarray dy, et en particulier la méthode présentée dans ce travail, une méthode plus rapide et plus simple par rapport aux techniques mentionnées ci-dessus.

Ce travail présente deux exemples d'expériences qui utilisent un biocapteur à base de puces à ADN-anticorps pour détecter la présence de cyanobactéries dans des échantillons de sol et d' eau. Il est une méthode simple et fiable basé sur un format de dosage immunologique en sandwich qui nécessite des volumes d'échantillons très petits et la préparation des échantillons très basique. La méthode nécessite un court laps de temps et peut facilement être effectuée sur le terrain.

Protocole

1. Préparation des agents immunogènes

1. Cultivez chaque souche de cyanobactérie dans le milieu de culture correspondante dans les conditions décrites dans le tableau 1.
   NOTE: Le milieu de croissance et de conditions de culture pour chaque souche de cyanobactérie sont énumérés dans le tableau 1. Toutes les souches de cyanobactéries, à l'exception de K17, appartiennent au groupe de Antonio Quesada de l'Université Autonoma (Madrid, Espagne). L'anticorps contre rubescens Planktothrix a été généré à partir d' un échantillon naturel de la fleur monospécifiques de cette cyanobactérie du réservoir Vilasouto (nord de l' Espagne).
2. Quantifier le nombre de cellules en utilisant une chambre de comptage de cellules par microscopie optique pour obtenir environ 10 ⁸ cellules / ml provenant d' une culture en phase de croissance exponentielle tardive ou stationnaire.
3. cellules de récolte à partir de 5 ml de la culture par centrifugation à 2000 xg pendant 5 min.
4. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un bain de 10 ml,e avec 5 ml de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS 1x) pour obtenir environ 10 ⁸ cellules / ml.
5. Homogénéiser et lyser les cellules de la suspension par sonication pendant 5 cycles, 30 s chacune, avec 30 à 60 s pause sur la glace, en utilisant un processeur à ultrasons portatif portable ou en plongeant le tube dans le bain de l'eau disrupteur cellulaire à amplitude maximale (30 kHz).
6. Répétez les étapes 1.3 à 1.5 pour chaque souche de cyanobactérie.
   NOTE: La sonication produit la rupture des cellules et la libération du contenu cellulaire. Tandis que les protéines et les polysaccharides sont de bons immunogènes, des molécules spécifiques, telles que des lipides et des acides nucléiques, ne pas induire une réponse immunogène humoral par eux-mêmes. Par conséquent, elles doivent se lier à des supports, tels que des polysaccharides ou des protéines, afin d'augmenter la complexité moléculaire. En outre, la sonication libère matériel intracellulaire qui peut déclencher la production d'anticorps.

2. Production d'anticorps polyclonaux

1. Préparer la première immdose unogen en mélangeant 0,5 ml du lysat cellulaire obtenu à l'étape ultrasonication 1,5 avec 0,5 ml d'adjuvant complet de Freund. Livrer à l'exploitant d'une installation d'animaux pour la production d'anticorps polyclonaux de lapin.
2. Préparer trois plusieurs doses comme précédemment pour une utilisation ultérieure en tant que rappels de mémoire dans le processus de production d'anticorps en mélangeant 0,5 ml de la même homogénat / lysat obtenu à l'étape 1.5 avec 0,5 ml d'adjuvant de Freund incomplet. Donnez-leur à l'animalerie pour accomplir le processus de production d'anticorps.
3. Répétez les étapes 2.1 et 2.2 pour chaque nouveau procédé de production d'anticorps.
   REMARQUE: Normalement, la production d'anticorps est confiée à des animaleries spécialisées ou des entreprises, parce que les licences et la formation appropriée sont nécessaires pour travailler avec les animaux. Les sociétés fournissent une analyse par immunosorbant lié à une enzyme (ELISA) pour la mesure relative de la quantité d'anticorps spécifiques d'antigènes présents dans l'échantillon de sérum.

3. Anticorps Purification

1. Purifier l'immunoglobuline G (IgG) à la fois la fraction provenant immun et le sérum pré-immun ont été recueillies à l'étape 2 par une protéine Chromatographie d'affinité. Certains kits de purification commerciale, basée sur des systèmes de cartouches, fonctionnent bien; suivez les instructions du fournisseur.
2. Lorsque le kit de purification ne fournit pas un système de dessalage, de changer le tampon après l'élution des anticorps purifiés à 0,1x PBS, soit par dialyse, soit en utilisant des dispositifs de filtration centrifuge avec 100 kDa (ou moins) la taille des pores de la membrane.
3. Déterminer la concentration d'anticorps en mesurant l'absorbance à 280 nm , ou en utilisant des méthodes colorimétriques, tels que ²³ Bradford, Lowry ²⁴ ou de l' acide bicinchoninique (BCA) ^25.
   Remarque: il est important d'éviter d' inclure des groupes amine dans le tampon d'élution (par exemple, des tampons Tris) , car ils sont en concurrence avec l'anticorps pour la liaison à des surfaces solides activés par des groupes époxy. Après purification, il est important de tester l'activité d'anticorps par ELISA.

4. Fluorescence Anticorps Étiquetage

1. Marquer les anticorps purifiés obtenus dans la section 3 par un fluorochrome (par exemple, un colorant fluorescent rouge lointain) par dissolution d' un flacon contenant un colorant du commerce pour le marquage de 1 mg de protéine dans 100 pl de diméthylsulfoxyde (DMSO). Ajouter 2 ul du colorant dissous à chaque préparation d'anticorps à une concentration de 2 mg / mL dans un volume final de 50 ul en mM tampon phosphate salin 50 (pH 8,5).
2. Maintenir les réactions de marquage sous agitation continue pendant 1 h à température ambiante et 1200 tours par minute sur une plate-forme vibrante.
3. Purifier les anticorps marqués par chromatographie d'exclusion de taille (par exemple, en utilisant un gel avec une gamme de fractionnement entre 1,5 et 30 kDa piégés dans une colonne), à la suite des recommandations du fournisseur.
4. Mesurer l'absorbance à 280 nm et à 650 nm dans les éluats et calculer le labeefficacités ling suivantes recommandations du fournisseur.
   REMARQUE: Jusqu'à 50 x 50 pi réactions anticorps-étiquetage peut être fait avec un seul flacon du colorant fluorescent pour le marquage 1 mg de protéine. Il est recommandé de couvrir les tubes avec du papier d'aluminium ou, en variante, d'utiliser des tubes opaques 0,5 mL pour éviter les processus de trempe après l'étape 4.3. Pour les anticorps IgG, l'étiquetage optimale est obtenue avec 3-7 moles de colorant par mole d'anticorps.

5. CYANOCHIP production

1. Les anticorps et les contrôles en solution d'impression
   1. Préparer 30 pi de chaque anticorps purifié dans une solution d'impression par mélange de chaque anticorps à 1 mg / ml dans un tampon d'impression protéine 1x commerciale avec 0,01% (v / v) de Tween 20 (un détergent non ionique), tout en concentrations finales.
      NOTE: En variante, une solution d'anticorps peut contenir 20% de glycerol, 1% (p / v) de saccharose (ou le tréhalose, en tant que conservateur) et 0,01% (v / v) de Tween 20 dans du tampon carbonate (pH 8,5).
   2. Préparer 30 pi de la solution d'impression en tant que contrôles: (a) un tampon d'impression 1x protéique avec 0,01% (v / v) de Tween 20, (b) la protéine A du sérum pré-immun purifié à 1 mg / ml dans un tampon d'impression en protéines 1x avec 0,01% (v / v) de Tween 20, et (c) de la sérum albumine bovine (BSA) à 1 mg / ml dans 1 x tampon d'impression de protéine avec 0,01% (v / v) de Tween 20.
   3. Préparer 30 pi d'un marquage fluorescent, du sérum pré-immun purifié à différentes concentrations (par exemple, de 50 pg / ml à 1 pg / ml) dans 1 x tampon d'impression de la protéine avec du Tween 20, comme à l' étape 5.1.1. Ces échantillons seront utilisés comme marqueurs de cadre fluorescents et par rapport fluorescence quantification après avoir repéré.
   4. Ajouter 30 ul par puits des solutions d'impression préparées dans les étapes 5.1.1, 5.1.2, et 5.1.3 de la plus haute qualité à 384 puits des microplaques pour la fabrication de puces à ADN, tel que le polypropylène.
      NOTE: tampon d'impression en protéines augmente la qualité et la stabilité des anticorps, et Tween 20 homogénéise place morphology et construit le couplage des protéines vers le haut. Il est recommandé de maintenir la microplaque 384 puits à 4 ° C avant utilisation. Entreposer à -20 ° C pendant de longues périodes de temps. Polypropylène a une faible ADN, protéines, extrait de cellules, et à petite molécule intrinsèque de liaison.
2. Anticorps impression sur une lame de microscope
   NOTE: Imprimer les anticorps sur des lames de microscope activées à l'aide de différentes plates-formes de réseau, comme le contact, split-aiguille, ou des dispositifs sans contact, tels que les imprimantes piézoélectriques ou technologies "jet d'encre". Dans ce travail, l'CYANOCHIP a été régulièrement imprimé par contact à l'aide d'un système robotisé (de arrayer) capable de repérer des quantités nL des anticorps à l'échelle um.
   1. Définir les conditions environnementales de la salle d'impression à 20 ° C et 40 - 50% d'humidité relative.
   2. Mettre en place les supports coulissants (par exemple, 75- x 25 mm de lames de verre de microscope époxy-activé) pour effectuer plusieurs arra d'anticorps identiquesys sur chaque diapositive.
   3. Repérez chaque anticorps purifié, y compris les contrôles et le cadre de référence, dans un motif de tache triple; dans ces conditions, les taches sont de 180 - 200 pm de diamètre.
   4. Après l'impression, laissez les lames pendant au moins 30 min à température ambiante pour les laisser sécher, puis les stocker à 4 ° C; pour travailler dans le domaine, les lames peuvent être transportés et stockés à température ambiante pendant plusieurs mois.
      NOTE: Le CYANOCHIP est imprimé dans un format de microréseau spot triple avec 3 x 8 microréseaux identiques par diapositive ou 9 tableaux identiques dans un format de microréseau 1 x 9. Chaque dimension de la matrice ne doit pas être supérieure à la dimension de la chambre de réaction pour un joint d'étanchéité 24 puits (habituellement 7,5 x 6,5 mm dans une chambre d'hybridation 3 x 8).
   5. Avant d'utiliser la puce à ADN pour analyser des échantillons environnementaux, FSMI utiliser afin de déterminer la dilution de travail pour chaque anticorps dans une courbe de titrage. Pour chaque anticorps, utiliser une concentration standard de l'imm correspondantunogen (10 ^{avril 3 à 10} cellules / ml) et des dilutions en série de l'anticorps fluorescent (entre 1: 500 et 1: 32000). La concentration optimale en anticorps correspond à 50% de l'intensité maximale du signal obtenu dans la courbe de titrage. En outre, la sensibilité et la spécificité de chaque anticorps doit être déterminée, comme décrit dans Blanco et al. ^22.

6. Préparation de l'environnement multianalyte Extraits pour le Immunoassay Fluorescent Sandwich Microarray (FSMI)

1. Extrait multianalyte à partir d' un échantillon liquide
   1. Prendre 1 - 100 mL de l'échantillon liquide avec une seringue stérile (par exemple, l' eau de la rive d'un réservoir d'eau); la quantité d'échantillon est fortement dépendante de la concentration potentielle des cibles.
   2. Concentrer les cellules en faisant passer l'échantillon d'eau par une taille de pores de 3 um, 47 mm de diamètre filtre de polycarbonate; une concentration cellulaireentre ^{mars 10 à août 10} cellules / ml est souhaitable pour la détection positive, mais la concentration réelle est inconnue.
   3. Récupérer la biomasse collectée dans le filtre avec 1 ml d'une solution saline tamponnée au Tris modifié, un tampon Tween 20 renforcé (TBSTRR; 0,4 M de Tris-HCl (pH 8), 0,3 M de NaCl et 0,1% de Tween 20), en grattant avec une spatule dans un tube de 15 ml.
   4. Homogénéiser et désagréger en utilisant un processeur à ultrasons portatif, tel que décrit dans l'étape 1.5, ou tout simplement par pipetage de haut en bas plusieurs fois; ce prépare l'échantillon pour analyse par microarray.
2. Extrait multianalyte à partir d' un échantillon solide
   1. Peser à 0,5 g de l'échantillon solide (par exemple, la roche, le sol ou les sédiments) dans un tube de 10 ml et ajouter jusqu'à 2 ml de TBSTRR.
   2. Soniquez par immersion de la sonde sonicateur dans le tube, en plongeant le tube dans le bain d'une corne de sonication puissante de l'eau, ou en utilisant un sonicateur à main. Effectuer au moins 5 x 30 scycles à 30 kHz, l'arrêt pendant 30 s tandis que sur la glace.
   3. Un filtre pour enlever le sable, l'argile et d'autres matériaux grossiers avec une seringue de 10 ml, couplé à un diamètre de 10 à 12 mm, de 5 à 20 um porte-filtre en nylon de taille des pores. Poussez l'échantillon à travers le filtre dans un tube de 1,5 ml. Si les saturent filtre, agiter la suspension dans la seringue et le prendre à une nouvelle; ceci prépare le matériau de filtrat pour le dosage immunologique (étape 7).
      REMARQUE: La capacité tampon de TBSTRR dépend du type d'échantillon. Il est important d'effectuer le dosage immunologique immédiatement après la préparation de l'extrait de l'environnement afin d'éviter les effets de la dégradation enzymatique des analytes. En variante, ajouter des inhibiteurs de la protéase dans l'extrait de l'environnement et de congélation à -80 ° C jusqu'à l'étape suivante.

7. Fluorescent Sandwich Microarray Immunoassay (FSMI)

1. Blocage de la CYANOCHIP
   REMARQUE: Immédiatement avant utilisation, traiter le pMPRIMÉ coulisse pour bloquer tous les groupes époxy libres sur la diapositive et pour éliminer l'excès d'anticorps non liés de manière covalente.
   1. Immerger la puce à ADN dans 0,5 M de Tris-HCl (pH 9) avec 5% (p / v) de BSA sur une surface propre (par exemple, boîte de Petri ou un tube de 50 ml) sous agitation douce à partir d' une plate - forme à bascule pendant 5 min. Vous pouvez également jeter les glisser vers le bas sur un 100 à 200 pi goutte de la solution ci-dessus avec les points de biopuces auxquels elle est confrontée. Laisser pendant 3 - 5 min, puis continuez.
   2. Prenez soigneusement la diapositive à l'aide des pinces en plastique à bout; essayez d'éviter les zones de microréseaux toucher. Éliminer l'excès de liquide en frappant doucement la lame sur une serviette en papier. Immerger dans 0,5 M de Tris-HCl (pH 8) avec 2% (p / v) d'une solution de BSA pendant 30 minutes avec agitation douce à partir d'une plate-forme à bascule.
   3. Sécher la lame en effectuant une courte centrifugation (200-300 g pendant 1 min) en utilisant une microcentrifugeuse commerciale adaptée pour des lames de microscope. Alternativement, sécher la lame par doucement frapper Ontariooa serviette en papier.
2. Incubation de l'extrait d'échantillon multianalyte avec le microréseau
   1. Mettre en place la glissière dans une cassette d'hybridation microarray commerciale avec 24 puits pour plusieurs microarrays; suivez les instructions du fournisseur.
   2. Après l'assemblage coulissant et la cassette, une pipette jusqu'à 50 pi de l'extrait d'échantillon ou d'une dilution de celui-ci dans TBSTRR dans chaque puits de la cassette.
   3. Répétez l'étape 7.2.2 pour chaque échantillon à analyser.
   4. En tant que témoin à blanc, la pipette 50 ul de tampon dans TBSTRR au moins deux puits séparés de la cassette.
   5. Incuber à température ambiante pendant 1 h sous agitation par pipetage toutes les 15 min ou en laissant sous agitation douce. Alternativement, incuber pendant 12 h à 4 ° C.
      REMARQUE: Utilisez d'autres joints d'incubation en fonction du motif de microréseau. Le temps et la température de l'incubation de l'étape 7.2.5 sont des paramètres empiriques qui dépendent normalement de l'affinité de liaison et kinétique de chaque paire antigène-anticorps.
3. La lessive
   1. Retirer les échantillons en plaçant la cassette vers le bas et soigneusement cognant sur un papier absorbant propre.
   2. Laver les puits en ajoutant 150 pi de TBSTRR à chacun, et d'éliminer le tampon, comme ci-dessus.
   3. Répétez l'étape 7.3.2 trois fois plus.
4. Incubation avec des anticorps de détection fluorescents
   1. Ajouter 50 ul d'un mélange d'anticorps contenant les anticorps 17 anti-déformation des cyanobactéries, chacun marqué avec le fluorochrome dans TBSTRR avec 1% (p / v) de BSA. Déterminer la concentration de chaque anticorps fluorescent dans le mélange (0,7 à 2 ng / ml) en réalisant des expériences de titrage de chaque paire antigène / anticorps ^22.
   2. Incuber pendant 1 h à température ambiante, comme décrit dans l'étape 7.2.5 ou pendant 12 heures à 4 ° C.
5. Laver les anticorps fluorescents </ Strong>
   1. Retirez les anticorps non fluorescents, comme dans l'étape 7.3.
   2. Démonter la cassette et immerger la lame dans 0,1x PBS (par exemple, dans un tube de 50 ml) pour un rinçage rapide.
   3. Sécher la lame comme à l'étape 7.1.3.

8. Recherche de Fluorescence

1. Balayer la lame pour la fluorescence au pic de fluorescence d'émission maximale pour le colorant fluorescent rouge lointain dans un scanner à fluorescence. Prendre plusieurs images des micropuces à différents paramètres de balayage, généralement en diminuant la valeur de gain de laser.
   NOTE: Éviter les points saturés (> 65.000 comptages de fluorescence) -Ils sont hors d'échelle et peuvent introduire des erreurs de quantification.

9. Traitement de l'image et de l'analyse des données

1. Utilisez un logiciel commercial pour l'analyse de l'image et la quantification; le logiciel fournit des mesures de l'intensité de fluorescence (FI; médiane ou moyenne de tous les pixels d'un seul point) pour espot ach de l'ensemble microréseau. Soustraire le fond local autour des spots: FI = _spot FI - FI _{fond local.}
2. Sauvegarder les données de FI et les ouvrir à l'aide d'un tableur.
3. Utilisez les valeurs obtenues pour les tableaux blancs que le contrôle négatif pour identifier et éliminer les faux positifs. Appliquer l'équation suivante pour calculer la FI pour chaque tache d'anticorps: FI = _{(échantillon} FI - FI _blanc), où FI _échantillon = _spot FI - FI _{fond local} dans les microarrays exécuté avec des extraits d'échantillons et FI _vide = _spot FI - FI _{fond local} dans les microréseaux vides.
4. Appliquer un seuil supplémentaire de coupure de 2 à 3 fois la moyenne de la FI de l'ensemble microréseau pour minimiser la probabilité de faux positifs; Ceci est particulièrement pertinent pour les images de microréseaux de mauvaise qualité et de faibles rapports signal sur bruit.
5. Créer des parcelles et / ou d'effectuer une analyse plus approfondie que nécessaire.

Résultats

Ce travail décrit un test de dosage immunologique multiplex pour l'identification simultanée des espèces d' eau douce de cyanobactéries les plus pertinentes (tableau 1) en utilisant le microréseau d'anticorps CYANOCHIP. La puce peut être un format 3 x 8 microarray imprimée sur des lames de microscope. Chaque microréseau est constitué d'un ensemble de 17 anticorps imprimés dans un motif de tache triple, leurs anticorps pré-immunitaires correspondants et BSA comme témoins ...

Discussion

Ici, un dosage immunologique en sandwich en utilisant le multiplex fluorescent CYANOCHIP, un micro - réseau 17-anticorps pour la détection et l' identification d'une grande variété de genres de cyanobactéries, est décrite ^22. Ces cyanobactéries représentent les genres benthiques et planctoniques les plus fréquents dans les habitats d'eau douce, certains d'entre eux étant des producteurs de toxines. Récemment, le format de dosage immunologique en sandwich fluorescent a été...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtres de pores de 0,22 mm	de diamètre Millipore	GSWP04700	Pour la préparation d’immunogènes
Microcentrifugeuse Eppendorf 5424R	Fisher Scientific		Pour la préparation d’immunogènes
Tampon phosphate salin (PBS) pH 7,4 (10x)	Thermo Fisher Scientific	70011036	50 mM phosphate de potassium, 150 mM NaCl, pH 7,4
Processeur à ultrasons UP50H	Hielscher		Pour la préparation d’immunogènes
Adjuvant complet de Freund  ;	Immunopotentialisateur	Sigma-Aldrich	F5881
Adjuvant de Freud incomplet	Sigma-Aldrich  ;	F5506	Pour injections de boost Kit de purification d’anticorps
protéine A  ;   ;	Sigma-Aldrich	PURE1A  ;	Pour l’isolement des IgG
Dispositifs de filtrage centrifuge MWCO< 100 kDa	Millipore	UFC510096-96K	Pour l’isolement des tubes de
dialyse	IgG, Sigma-Aldrich	D7884-10FT	Pour l’isolement des colonnes IgG
Illustra Microspin G-50	GE-HealthCare	GE27-5330-02	Pour l’isolement du
Bradford	Sigma-Aldrich	B6916-500 mL	Pour quantifier la concentration d’anticorps
Kit de dosage de la protéine MicroBCA  ;	Thermo Scientific	23235	Pour quantifier la concentration en anticorps
Tampon de mise en réseau de protéines 2x	Whatman (Sigma Aldrich)  ;	S00537	Tampon d’impression ; 30 à 40 % de glycérol dans 1x PBS avec 0,01 % de Tween
20 Tween 20  ;	Sigma-Aldrich  ;	P9416	Détergent non ionique
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich  ;	A9418	Contrôle  ; pour l’impression, le réactif de blocage
Microplaque à 384 puits	Genetix	X6004	Pour l’impression d’anticorps
Robot arrayer pour lames multiples MicroGrid	II TAS arrayer de Digilab		Pour l’impression d’anticorps
Lames de verre à substrat époxy	Arrayit corporation	VEPO25C	Support solide pour l’impression d’anticorps
Alexa Fluor-647 Ester de succinimidyle  ;	Sondes moléculaires	A20006	Fluorochrome
DMSO  ;	Sigma-Aldrich  ;	D8418	Dissolvant fluorochrome
Heidolph Titramax agitateur à plate-forme vibrante	Fisher Scientific		Pour le marquage des anticorps  ;
Illustra Microspin G-50 colonnes  ;	Soins de santé	27-5330-01	Pour la purification des anticorps étiquetés
Tubes bruns de 0,5 mL scellés en toute sécurité	Sarstedt	72,704,001	Pour le stockage des anticorps étiquetés  ;
Spectrophotomètre Nanodrop 1000	Thermo Scientific		Pour quantifier la concentration d’anticorps et l’efficacité du marquage
3 & micro ; m taille des pores polycarbonate 47 mm de diamètre	Millipore	TMTP04700	Pour concentrer les cellules
1 M solution de chlorhydrate de Trizma pH 8	Sigma-Aldrich  ;	T3038	Pour la préparation de TBSTRR ; pour bloquer les lames
Chlorure	de sodium Sigma-Aldrich  ;	S7653	Pour la préparation TBSTRR
20 & micro ; Filtres en nylon M  ;	Millipore	NY2004700	Pour la préparation d’extraits environnementaux
Porte-filtres de 10 à 12 mm	Millipore	SX0001300	Pour la préparation d’extraits environnementaux
Cocktail d’inhibiteurs de protéase	Sigma-Aldrich  ;	P8340	Pour le stockage des extraits environnementaux
1 M Solution de chlorhydrate de Trizma pH 9	Sigma-Aldrich  ;	T2819	Pour bloquer les lames
Heidolph Duomax 1030 Agitateur à plate-forme basculante	VWR		Pour bloquer les lames ; pour les processus d’incubation  ;
VWR Galaxy miniarray microcentrifuge	VWR	C1403-VWR	Pour sécher les lames
Cassette d’hybridation de microarray Multi-Well	Arrayit corporation	AHC1X24	Cassette pour 24 dosages par lame
GenePix 4100A scanner de microarray  ;	Dispositifs		Scanner pour fluorescence
Logiciel GenePix Pro Logiciel	Dispositifs		pour l’analyse et la quantification d’images