Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Mise en place de cellules tétraploïdes proliférative de fibroblastes humains non transformés

6.9K vues

⸱

DOI :

10.3791/55028

⸱

8 janvier 2017

 , 
1Division of Morphological Science, Biomedical Research Center, Saitama Medical University, 2Department of Pathology, International Medical Center, Saitama Medical University

Dans cet article

Résumé

Bien que des cellules polyploïdes prolifératives soient nécessaires pour analyser l’instabilité chromosomique des cellules polyploïdes, la création de telles cellules à partir de cellules humaines non transformées n’est pas facile. Le présent rapport décrit des procédures relativement simples pour établir des cellules tétraploïdes prolifératives exemptes d’une population diploïde à partir de fibroblastes humains normaux.

Résumé

Les cellules polyploïdes (principalement tétraploïdes) sont souvent observées dans les lésions prénéoplasiques des tissus humains et leur instabilité chromosomique a été considérée comme responsable de la cancérogenèse dans ces tissus. Bien que les cellules polyploïdes prolifératives soient nécessaires à l’analyse de l’instabilité chromosomique des cellules polyploïdes, la création de telles cellules à partir de cellules humaines non transformées est plutôt difficile. L’induction de la tétraploïdie par des agents chimiques entraîne généralement un mélange de populations diploïdes et tétraploïdes, et la plupart des études ont utilisé le tri cellulaire activé par fluorescence ou le clonage en limitant la dilution pour séparer les cellules tétraploïdes des cellules diploïdes. Cependant, ces procédures sont longues et laborieuses. Le présent rapport décrit un protocole relativement simple pour induire des cellules tétraploïdes prolifératives à partir de fibroblastes humains normaux avec une contamination minimale par des cellules diploïdes. En bref, le protocole comprend les étapes suivantes : arrêter les cellules en mitose par la démécolcine (DC), collecter les cellules mitotiques après secousse, incuber les cellules collectées avec DC pendant 3 jours supplémentaires et incuber les cellules dans un milieu sans médicament (elles reprennent leur prolifération en tant que cellules tétraploïdes en quelques jours). Selon le type de cellule, la collecte de cellules mitotiques par secousse peut être omise. Ce protocole fournit une méthode simple et réalisable pour établir des cellules tétraploïdes prolifératives à partir de fibroblastes humains normaux. Les cellules tétraploïdes établies par cette méthode pourraient être un modèle utile pour étudier l’instabilité chromosomique et le potentiel oncogénique des cellules humaines polyploïdes.

Introduction

Polyploidy a été observée non seulement dans les tissus des espèces de mammifères spécialisés, mais également dans une variété d'états pathologiques tels que le cancer et les maladies dégénératives. ( La plupart des cellules polyploïdes tétraploïdes) sont souvent observées dans les lésions précancéreuses de tissus humains, tels que l' œsophage 1,2 ou squameuses lésions intra - épithéliales de Barrett du col 3,4, et ont été considérés comme étant la source des cellules aneuploïdes malignes dans les tissus 5 , 6. Bien qu'il soit suggéré que la conversion de tétraploïdes à des cellules aneuploïdes pourrait être un événement crucial dans les premières étapes de la tumorigenèse, les mécanismes impliqués dans ce processus ne sont pas complètement comprises. Ceci est en partie parce qu'aucun modèle in vitro a été disponible , où les cellules humaines polyploïdes non transformées peuvent se propager.

Certains chercheurs ont induit tétraploïdie dans les cellules épithéliales humaines non transformées par la génération de cellules binucléées par inhibiting cytokinesis 7-9. Dans ce procédé, cependant, les cellules diploïdes inutiles doivent être éliminées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) 7,8 ou le clonage par dilution limitante 9. Parce que ces procédures sont laborieuses et pas facile à réaliser, des méthodes plus simples à mettre en place des cellules tétraploïdes non transformées sont souhaitées pour la recherche dans ce domaine.

Dans le présent rapport, nous décrivons un protocole pour établir des cellules tétraploïdes prolifératives de fibroblastes humains normaux ou des fibroblastes humains télomérase immortalisés par des procédures relativement simples. Les procédures utilisent la broche poison démécolcine (DC) pour arrêter les cellules diploïdes en mitose, et les cellules mitotiques recueillies par secouer sont encore traités avec DC. les cellules mitotiques diploïdes traitées avec courant continu pour convertir le temps prolongé dans les cellules G1 tétraploïdes, et ces cellules proliférer les cellules tétraploïdes que, après un arrêt de croissance pendant plusieurs jours après le retrait du médicament. Ce protocole prévoitune méthode efficace pour créer un modèle utile pour étudier la relation entre l'instabilité chromosomique et le potentiel oncogénique de cellules humaines polyploïdes.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Culture cellulaire

  1. Obtenir les cellules pour induire tétraploïdie. À ce jour, il a été confirmé que cette technique peut être appliquée sur les lignées cellulaires de fibroblastes humains TIG 1, BJ, IMR-90 et de la télomérase immortalisation TIG-1 (TIG-HT).
  2. Cultiver les cellules dans du milieu essentiel minimal avec modification α ou tout autre milieu de culture cellulaire approprié pour le type de cellules à étudier additionné de 10% (v / v) de sérum de fœtus bovin inactivé par la chaleur (FBS) par mise en incubation dans un 5% (v / v) une atmosphère de CO2 à 37 ° C. cellules Passage tous les 3 ou 4 jours de ne pas dépasser la densité de subconfluent.
    REMARQUE: Le niveau de doublement de la population (PDL) doit être calculé chaque fois à repiquage pour évaluer la croissance cellulaire et l'âge de la cellule. PDL peut être calculé à partir du nombre de cellules ensemencées dans une boîte (N1) et le nombre de cellules récoltées à côté des passages (N2) à l'aide de la formule suivante (X est la première PDL). PDL = X + (log N1 - log N2) / log 2

2. Induction et Estaétablis- des cellules tétraploïdes à partir de diploïdes Fibroblastes

  1. Provoquer tétraploïdie sans shake-off.
    NOTE: Certaines souches de cellules (par exemple TIG-1) peut devenir presque complètement tétraploïde par un traitement continu avec démécolcine (DC) comme suit.
    1. cellules Passage dans une ou deux boîtes de 100 mm le jour avant le traitement pour induire tétraploïdie. En règle générale, la préparation de 5 x 10 5 à 1 x 10 6 cellules par boîte pour l' induction de cellules tétraploïdes.
    2. Traiter des cellules en croissance exponentielle dans un milieu contenant 0,1 pg / ml à courant continu pendant 4 jours.
    3. Remplacer DC milieu contenant un milieu exempt de drogue et incuber les cellules dans un 5% (v / v) atmosphère de CO 2 à 37 ° C. Les cellules reprennent généralement la prolifération dans 1 semaine.
  2. Provoquer tétraploïdie avec shake-off.
    REMARQUE: La plupart des cellules deviennent un mélange de populations diploïdes ou tétraploïdes à la suite du traitement simple en courant continu décrit ci-dessus (2.1). Par conséquent, certaines modifications de la pROCÉDURE pour éliminer une population diploïde sont nécessaires comme suit (Figure 1).
    1. cellules Passage dans plusieurs T75 Gourde le jour avant le traitement pour induire tétraploïdie. Habituellement, préparer au moins 5 x 10 6 cellules (1 x 10 6 cellules par flacon) pour l' induction de cellules tétraploïdes.
    2. Traiter les cellules en croissance exponentielle avec un milieu contenant 0,1 pg / mL DC pendant 16 - 18 h pour arrêter les cellules en mitose. Le temps requis pour arrêter les cellules en mitose peut dépendre des cellules cibles et devrait être déterminée par des expériences préliminaires pour obtenir autant de cellules mitotiques que possible. Par exemple, les cellules à croissance plus lente devraient être traitées avec DC pour plus de temps que les cellules à croissance rapide.
      NOTE: Si les cellules sont traitées pendant trop longtemps dans cette étape, ils pourraient subir un glissement mitotique et adhérer à la surface de la boîte, ce qui rend impossible la collecte de cellules en mitose par shake-off à l'étape suivante.
    3. Recueillir les cellules en mitose DC-arrêtés par la méthode shake-off, dans which cellules en mitose lâchement adhérées sont collectées par agitation douce de flacons et le lavage avec du milieu puis par centrifugation (300 xg, 5 min). Compter le nombre de cellules par une méthode appropriée dans cette étape.
    4. Réensemencer cellules mitotiques recueillies dans des boîtes de culture de 60 mm et de traiter les cellules avec 0,1 pg / mL DC pendant 3 jours. Graine plus de 1 x 10 6 cellules en mitose par boîte, parce que moins de 10% des cellules peut survivre à ce traitement.
    5. Remplacez DC milieu contenant un milieu exempt de drogue et d'attendre pour les cellules de reprendre la prolifération, qui se produit habituellement dans 1 semaine.
  3. Passage des cellules de manière similaire à des cellules diploïdes d'origine.

3. Examen de l'ADN ploïdie

NOTE: Ceci est une procédure bien établie et un manuel technique devrait être renvoyée à des procédures détaillées et des conseils techniques.

  1. Récolte des cellules (5 x 10 5 - 1 x 10 6) par incubation des cellules avec une solution concontenant 0,05% de trypsine et 0,02% d'EDTA pendant 10 min à 37 ° C et on neutralise la trypsine par un milieu contenant 10% de FBS.
  2. centrifuger les cellules dans le milieu et les laver par remise en suspension dans 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) suivie par une centrifugation (300 x g, 5 min).
  3. Préparer des cellules pour l'analyse de l'ADN par une des deux méthodes suivantes
    1. Procédé d'analyse de cellules non fixées 10
      Remarque: Cette méthode peut être réalisée en utilisant un kit disponible dans le commerce pour l'analyse du cycle cellulaire. Les échantillons préparés avec cette méthode doivent être analysés immédiatement, parce que les cellules ne sont pas fixés dans la procédure et colorées noyaux seront endommagés au fil du temps.
      1. Laver les cellules avec 40 mM de tampon citrate contenant 250 mM de saccharose. traiter ensuite les cellules avec 250 ul de 0,1% (v / v) de Nonidet P40 et 30 pg / ml de trypsine dans 200 pl de 40 mM de tampon citrate contenant 250 mM de saccharose pendant 10 min à température ambiante.
      2. Ajouter 200 pi de 0,5 pg / ml de trypsine inhibitor et 0,1 pg / ml de RNase A dans 40 mM de tampon citrate contenant 250 mM de saccharose, et on incube les cellules pendant 10 min à température ambiante.
      3. Ajouter 200 ul de 0,4 mg / mL d'iodure de propidium (PI) dans un tampon de citrate 40 mM contenant 250 mM de saccharose, et on incube les cellules pendant 10 min à température ambiante pour colorer des noyaux cellulaires.
    2. Procédé pour analyser des cellules fixées
      1. Fixer les cellules avec 80% d'éthanol en mettant en suspension les cellules dans 1 ml de PBS, en ajoutant 4 ml de EtOH à 100%, goutte à goutte tout en mélangeant la suspension de cellules et en le laissant à température ambiante pendant 30 min. Les cellules de cette fixatif peuvent être conservés à -20 ° C pendant plusieurs semaines.
      2. Laver les cellules en les remettant en suspension dans 5 ml de PBS puis par centrifugation (300 x g, 5 min). Traiter les cellules avec 0,5 mg / ml de RNase A et les colorer avec 50 pg / ml d'iodure de propidium (PI) (475 pl de 0,5 mg / ml de RNase A et 25 ul de 1 mg / mL de PI) pendant 30 min à température ambiante.
  4. Analyser le contenu d'ADN de til cellules en utilisant un cytomètre de flux avec un laser de 488 nm et un filtre d'émission de canal rouge (longue passe> 610 nm). Analyser un échantillon de référence préparé à partir de cellules diploïdes d'origine en même temps pour évaluer la ploïdie des cellules cibles.
    1. En variante, ajouter des perles de fluorescence standard pour évaluer le rapport d'intensité de fluorescence des cellules diploïdes par rapport aux billes. Utilisez la «hauteur d'impulsion de largeur d'impulsion par rapport à « l' option de la cytométrie de flux pour distinguer entre les cellules et amas de cellules diploïdes 11 tétraploïdes simples.

4. Examen des Comtes chromosomiques et analyse caryotype

NOTE: Ce sont toutes des procédures bien établies et un manuel technique ou les protocoles du fabricant devraient être soumises à des procédures détaillées et des conseils techniques.

  1. Traiter les cellules en croissance exponentielle avec 0,1 pg / mL DC pendant 4 h pour arrêter les cellules en métaphase.
  2. Préparer des lames chromosomiques.
    1. cellules de récolte (au moins 5 x 10 5 cellules) par trypsinisation et suspendre dans un milieu contenant du FBS.
    2. centrifuger les cellules dans un milieu (300 xg, 5 min) et on traite avec une solution hypotonique (5 ml de 0,075 M de KCl) à 37 ° C pendant 10 min.
    3. Fix et suspendre les cellules dans le fixateur de Carnoy (méthanol: acide acétique = 3: 1).
    4. Étaler des cellules sur une lame de verre en laissant tomber un petit volume (25 - 35 ul) de la suspension cellulaire. Des mesures supplémentaires telles que l'exposition à la vapeur d'eau chaude pourraient être nécessaires pour améliorer le chromosome se propager.
  3. Cellules Stain pour comptage des chromosomes ou l' analyse du caryotype ou fluorescence multicolore hybridation in situ (MFish).
    1. compte chromosomiques.
      1. les cellules tache avec une solution de Giemsa à 5% (ou 5 ug PI / ml contenant 0,5 mg / ml de RNase A pour la microscopie par fluorescence) pendant 15 - 20 min.
      2. photographier numériquement au moins 50 cellules métaphasiques.
      3. Comptez le nombre de chromosomes par cellule en utilisant un softwa d'analyse d'imagere après séparation manuelle de toucher et de chevauchement des chromosomes à l'aide d'un logiciel de retouche photo. Bien que le nombre de chromosomes peut être marqué manuellement, pointage informatisé est recommandé.
    2. analyse du caryotype
      NOTE: Cette analyse doit être effectuée par un technicien qualifié ou une entreprise professionnelle.
      1. Cellules Stain selon une technique G-banding standard de 12.
      2. Analyser les chromosomes de faire Caryogamies standard de 12.
    3. mFISH
      REMARQUE: Cette étape est facultative et doit être effectuée si nécessaire.
      1. Cellules Stain en utilisant des sondes FISH multicolores pour les chromosomes humains selon le protocole du fabricant 13.
      2. Analyser les chromosomes en utilisant un microscope à fluorescence avec des filtres adaptés et d' un logiciel d'analyse mFISH 13.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Dans notre expérience, TIG-1 cellules peuvent être presque complètement tétraploïde par un traitement simple et continu avec 0,1 pg / mL DC pendant 4 jours (figure 2A). En revanche, d'autres souches fibroblastiques, tels que BJ ou IMR-90 et des cellules TIG Ht, est devenu un mélange de diploïdes et les populations tétraploïdes suivant le même traitement, et l'isolement des cellules en mitose par la méthode d'agitation d'arrêt est nécessaire au cours de tr...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Un problème majeur dans l'induction de tétraploïdie à partir de cellules diploïdes par des agents chimiques, soit par des inhibiteurs de la cytokinèse ou par des inhibiteurs de la broche, est que les cellules deviennent souvent un mélange de populations diploïdes ou tétraploïdes et les cellules tétraploïdes doivent être séparés des cellules diploïdes. La plupart des approches communes pour l'isolement d'une population tétraploïde exempte de cellules diploïdes utilisent FACS ou le clonage par dilution limite....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier en compétition.

Remerciements

Nous remercions Mme Matsumoto pour l’assistance technique.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
MEM-&alpha ;Sigma-AldrichM8042-500ML
Trypsine-EDTASigma-AldrichT4174
FBSSigma-Aldrich172012-500ML
Solution de démécolcine (10 &mu ; g/mL dans HBSS)Sigma-AldrichD1925-10ML
BD CycleTES Plus Kits de réactifs d’ADNBD Biosciences#340242Pour l’examen de la ploïdie de l’ADN par cytométrie en flux
Sonde FISH multicolore du chromosome humain 24XCyteMetaSystems#D-0125-060-DIUn ensemble de filtres et un logiciel spécialisés pour l’analyse mFISH sont nécessaires
Système d’imagerie Isis avec logiciel mFISH  ;Unsonde spécialisé MetaSystems
kit de est nécessaire

Références

  1. Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett's esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
  2. Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma. PLoS Med. 4 (2), e67(2007).
  3. Olaharski, A., et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).
  4. Liu, Y., et al. p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy. Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).
  5. Davoli, T., de Lange, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
  6. Fox, D., Duronio, R. Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease. Development. 140, 3-12 (2013).
  7. Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437, 1043-1047 (2005).
  8. Ganem, N., et al. Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation. Cell. 158 (4), 833-848 (2014).
  9. Kuznetsova, A., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).
  10. Vindeløv, L., Christensen, I. Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis. Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).
  11. Darzynkiewicz, Z., Juan, G. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5(2001).
  12. Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).
  13. Liehr, T., et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).
  14. Ohshima, S., Seyama, A. Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts. Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).
  15. Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Front. Oncol. 3, 198(2013).
  16. Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts. Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).
  17. Di Leonardo, A., et al. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).
  18. Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1. Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).
  19. Vogel, C., et al. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy. Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).
  20. Aylon, Y., Oren, M. p53: Guardian of ploidy. Mol. Oncol. 5 (4), 315-323 (2011).
  21. Uetake, Y., Sluder, G. Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a "tetraploidy checkpoint". J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).
  22. Ganem, N., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131, 437-440 (2007).
  23. Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization. Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Traitement la d m colcinem thode de d tachement par agitationarr t mitotiqueanalyse par cytom trie en fluxcomptage chromosomiqueanalyse de la plo die de l ADNprotocole de culture cellulairerecherche sur la canc rog n se
Mise en place de cellules tétraploïdes proliférative de fibroblastes humains non transformés
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.