Mise en place de cellules tétraploïdes proliférative de fibroblastes humains non transformés

Résumé

Bien que des cellules polyploïdes prolifératives soient nécessaires pour analyser l’instabilité chromosomique des cellules polyploïdes, la création de telles cellules à partir de cellules humaines non transformées n’est pas facile. Le présent rapport décrit des procédures relativement simples pour établir des cellules tétraploïdes prolifératives exemptes d’une population diploïde à partir de fibroblastes humains normaux.

Résumé

Les cellules polyploïdes (principalement tétraploïdes) sont souvent observées dans les lésions prénéoplasiques des tissus humains et leur instabilité chromosomique a été considérée comme responsable de la cancérogenèse dans ces tissus. Bien que les cellules polyploïdes prolifératives soient nécessaires à l’analyse de l’instabilité chromosomique des cellules polyploïdes, la création de telles cellules à partir de cellules humaines non transformées est plutôt difficile. L’induction de la tétraploïdie par des agents chimiques entraîne généralement un mélange de populations diploïdes et tétraploïdes, et la plupart des études ont utilisé le tri cellulaire activé par fluorescence ou le clonage en limitant la dilution pour séparer les cellules tétraploïdes des cellules diploïdes. Cependant, ces procédures sont longues et laborieuses. Le présent rapport décrit un protocole relativement simple pour induire des cellules tétraploïdes prolifératives à partir de fibroblastes humains normaux avec une contamination minimale par des cellules diploïdes. En bref, le protocole comprend les étapes suivantes : arrêter les cellules en mitose par la démécolcine (DC), collecter les cellules mitotiques après secousse, incuber les cellules collectées avec DC pendant 3 jours supplémentaires et incuber les cellules dans un milieu sans médicament (elles reprennent leur prolifération en tant que cellules tétraploïdes en quelques jours). Selon le type de cellule, la collecte de cellules mitotiques par secousse peut être omise. Ce protocole fournit une méthode simple et réalisable pour établir des cellules tétraploïdes prolifératives à partir de fibroblastes humains normaux. Les cellules tétraploïdes établies par cette méthode pourraient être un modèle utile pour étudier l’instabilité chromosomique et le potentiel oncogénique des cellules humaines polyploïdes.

Introduction

Polyploidy a été observée non seulement dans les tissus des espèces de mammifères spécialisés, mais également dans une variété d'états pathologiques tels que le cancer et les maladies dégénératives. ( La plupart des cellules polyploïdes tétraploïdes) sont souvent observées dans les lésions précancéreuses de tissus humains, tels que l' œsophage ^1,2 ou squameuses lésions intra - épithéliales de Barrett du col ^3,4, et ont été considérés comme étant la source des cellules aneuploïdes malignes dans les tissus ^{5 , 6.} Bien qu'il soit suggéré que la conversion de tétraploïdes à des cellules aneuploïdes pourrait être un événement c....

Protocole

1. Culture cellulaire

1. Obtenir les cellules pour induire tétraploïdie. À ce jour, il a été confirmé que cette technique peut être appliquée sur les lignées cellulaires de fibroblastes humains TIG 1, BJ, IMR-90 et de la télomérase immortalisation TIG-1 (TIG-HT).
2. Cultiver les cellules dans du milieu essentiel minimal avec modification α ou tout autre milieu de culture cellulaire approprié pour le type de cellules à étudier additionné de 10% (v / v) de sérum de fœtus bovin inactivé par la chaleur (FBS) par mise en incubation dans un 5% (v / v) une atmosphère de _CO2 à 37 ° C. cellules Passage tous les 3 ou 4 jours de ne pas dépasser la dens....

Résultats

Dans notre expérience, TIG-1 cellules peuvent être presque complètement tétraploïde par un traitement simple et continu avec 0,1 pg / mL DC pendant 4 jours (figure 2A). En revanche, d'autres souches fibroblastiques, tels que BJ ou IMR-90 et des cellules TIG Ht, est devenu un mélange de diploïdes et les populations tétraploïdes suivant le même traitement, et l'isolement des cellules en mitose par la méthode d'agitation d'arrêt est nécessaire au cours de tr.......

Discussion

Un problème majeur dans l'induction de tétraploïdie à partir de cellules diploïdes par des agents chimiques, soit par des inhibiteurs de la cytokinèse ou par des inhibiteurs de la broche, est que les cellules deviennent souvent un mélange de populations diploïdes ou tétraploïdes et les cellules tétraploïdes doivent être séparés des cellules diploïdes. La plupart des approches communes pour l'isolement d'une population tétraploïde exempte de cellules diploïdes utilisent FACS ou le clonage par dilution limite........

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
MEM-&alpha ;	Sigma-Aldrich	M8042-500ML
Trypsine-EDTA	Sigma-Aldrich	T4174
FBS	Sigma-Aldrich	172012-500ML
Solution de démécolcine (10 &mu ; g/mL dans HBSS)	Sigma-Aldrich	D1925-10ML
BD CycleTES Plus Kits de réactifs d’ADN	BD Biosciences	#340242	Pour l’examen de la ploïdie de l’ADN par cytométrie en flux
Sonde FISH multicolore du chromosome humain 24XCyte	MetaSystems	#D-0125-060-DI	Un ensemble de filtres et un logiciel spécialisés pour l’analyse mFISH sont nécessaires
Système d’imagerie Isis avec logiciel mFISH  ;	Un	sonde spécialisé MetaSystems

kit de est nécessaire