Article de méthode

Isolement et cytométrie de flux Analyse de Human Endocervical Gamma Delta cellules T

DOI :

10.3791/55038

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6 février 2017

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1Department of Microbiology and Immunology, Miller School of Medicine, University of Miami, 2Division of Infectious Diseases, Miller School of Medicine, University of Miami

Dans cet article

Résumé

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Nous décrivons ici une méthode d’isolement permettant d’obtenir des lymphocytes intra-épithéliales endocervicals humains pour l’analyse des lymphocytes T gamma delta intra-épithéliaux. Ce protocole peut être étendu pour la purification des lymphocytes T gamma delta endocervicaux par billes magnétiques ou par tri cellulaire.

Résumé

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L'appareil reproducteur (FRT) système immunitaire muqueux femelle sert de la première ligne de défense. Une meilleure connaissance de la muqueuse génitale est donc essentiel pour la compréhension de la pathogénicité des différents agents pathogènes, y compris le VIH. delta Gamma cellules (GD) T sont le prototype de cellules «non conventionnelles» T et représentent un relativement petit sous-ensemble de cellules T définies par leur expression de récepteurs de cellules T (TCR hétérodimères) composées de chaînes gamma et delta. Ce qui les distingue des cellules T classiques et bien mieux connus auxiliaires CD4 + et de cellules T cytotoxiques CD8 + qui sont définis par les TCR alpha-bêta. GD cellules T montrent souvent la localisation spécifique des tissus et sont enrichis dans l'épithélium. GD cellules T orchestrent la réponse immunitaire à l'inflammation, la surveillance de la tumeur, les maladies infectieuses, et l'auto-immunité.

Ici, nous présentons une méthode pour isoler de manière reproductible et d'analyser les lymphocytes humains endocervicales intraépithéliale GD T. Nous have des échantillons de cytobrosse endocervicales utilisés par des femmes participant à interagences VIH Étude de l'infection des femmes (WIHS). La connaissance de GD cellules T interactions dans les conditions dans lesquelles il est une insulte à la muqueuse vaginale pourrait être appliquée à toute étude clinique dans laquelle la muqueuse vulnérabilité est abordée, y compris le développement de plus de microbicides.In vaginale, les connaissances sur les réponses des cellules muqueuses GD T a potentiel d'application de GD T immunothérapie à base de cellules dans le traitement de maladies infectieuses.

Introduction

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Nous avons développé une méthodologie de l'aide d'échantillons de pinceau endocervical pour évaluer les cellules GD T intraépithéliale. Le canal endocervical est bordée par une seule couche d'épithélium. Lymphocytes intraépithéliaux représentent les lymphocytes de première ligne résidant dans la couche épithéliale qui peut rapidement initier des réponses immunitaires lors de la rencontre des microbes pathogènes 7, 8. Comprendre les événements immunologiques du compartiment intraépithéliale endocervical est important pour la conception de stratégies efficaces pour prévenir les infections, y compris le VIH.

Notre méthode peut être appliquée à des échantillons endocervicaux humains fraîchement récoltés ainsi que des cellules endocervicales congelés pour explorer davantage le rôle des cellules T GD intraépithéliale chez les femmes infectées par le VIH ou à risque d'infection par le VIH. L'objectif principal de ce protocole est de découvrir des événements immunologiques nouveaux dans le compartiment intraépithéliale endocervical et évaluatles réponses des lymphocytes T e GD comme un marqueur de la muqueuse de la vulnérabilité chez les femmes infectées par le VIH.

Les lacunes importantes dans les connaissances autour de l'immunité de FGT sont partiellement en raison de la difficulté dans la collecte et le traitement des échantillons muqueux avec succès. En outre, l'hétérogénéité complexe des cellules immunitaires de la muqueuse, et leur interconnexion avec l'autre, sont des défis majeurs pour l'identification des mesures cliniquement pertinentes qui reflètent l'état et la capacité du système immunitaire. Nous avons développé une méthode pour obtenir des cellules intraépithéliales hautement purifiées GD T qui peuvent être analysées plus en utilisant des technologies hautement multiplexées, unicellulaires qui peuvent être critiques pour identifier les mécanismes sous-jacents de l'immunité FRT.

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Protocole

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activités d'étude ont eu lieu à l'Université de Miami Unité de recherche sur le VIH, en collaboration avec l'étude des femmes Miami Interagency HIV (WIHS) et le Centre de Miami for AIDS Research (CFAR) Conseil d'examen .Institutional (Université de Miami Miller School of Medicine) l'approbation a été obtenue avant au recrutement et à toutes les procédures d'évaluation ou d'études connexes.

1. Endocervical Brush Collection Sample

NOTE: Les participants ont subi un examen vaginal effectué par MD ou un gynécologue formé et la collecte des lymphocytes intraépithéliaux ont été réalisées en cours d'examen au spéculum en insérant cytobrosse.

  1. Caractéristiques des participants
    1. Recruter les participantes qui sont âgés de 18 à 45 ans, sexuellement actives, pas enceinte et non sur les médicaments contraceptifs ou avec un dispositif intra-utérin.
    2. Avant l'examen vaginal, demandez aux participants sont soumis à un tirage de 10 ml de sang en verttop vacutainers d'héparine pour périphérique de cellules mononucléaires du sang (PBMC) l'isolement. pour servir de contrôle pour l' analyse intraépithéliale endocervical 9.
  2. Collecte des échantillons endocervicales
    1. Insérer un spéculum stérile de taille appropriée dans le vagin sans lubrification. Utilisez un eau chaude pour faciliter l'insertion du spéculum et de la gaze stérile pour nettoyer le mucus. La position du spéculum permet la visualisation complète de l'os et exocol.
    2. Insérez la brosse endocervicale dans le canal endocervical jusqu'à ce que seuls les poils les plus proches de la main sont visibles. Tourner dans le sens horaire de la brosse pour 360 °. Transférer le pinceau dans un tube de 15 ml contenant 5 ml de milieu IMDM.
    3. Immédiatement après la collecte, placez le tube contenant cytobrosse sur la glace. Pour obtenir une viabilité élevée des cellules intraépithéliales recueillies, livrer le cytobrosse au laboratoire et processus dans 1 h.

2. Endocervical cytobrosse Traitement des échantillons

  1. tube Vortex contenant cytobrosse endocervical application 4 courts (10 secondes) coups.
  2. Centrifuger le tube contenant cytobrosse, pendant 10 min à 250 x g.
  3. Retirez délicatement le cytobrosse du tube (ne pas perturber le culot sur le fond du tube) et ajouter 1 ml de milieu de IMDM et placer le tube sur la glace.
  4. Placer le cytobrosse sur le tamis cellulaire de 100 mm au-dessus du tube de 50 ml.
  5. Laver le cytobrosse avec 20 ml IMDM.
  6. Tube à centrifuger pendant 10 min à 250 x g.
  7. Décanter le surnageant et les cellules granulées remettre en suspension dans 1 ml de IMDM et se combinent avec le culot déjà remis en suspension décrite au point 2.3.
  8. Compter les cellules en utilisant un compteur de cellules automatisé 10 ou dénombrer les cellules en utilisant un hémocytomètre en combinant 10 pl de la suspension cellulaire avec 10 pi de colorant bleu trypan. pipeter doucement monter et descendre dix fois pour mélanger les cellules et le colorant. Charge 10 pidu mélange dans l'ouverture de l'une ou l'autre des deux chambres hémocytomètre. Comptez toutes les cellules dans les cinq domaines de la grille. Gardez un décompte séparé des cellules viables et non viables. Déterminer la viabilité des cellules en utilisant la formule suivante:% de cellules viables = cellules non viables totales x 100 cellules / numéro de la cellule.
    Déterminer la concentration subséquente de cellules par ml (et le nombre total de cellules) en utilisant les calculs suivants. Nombre de cellules par ml = x nombre total de cellules comptées (facteur de dilution / nombre de carrés comptés) x 10.000 cellules / ml.
  9. Congeler cellules endocervicales isolées à l'aide de milieu de congélation contenant 10% de DMSO et 90% de FBS.

3. cytométrie de flux

  1. Resuspendre 1-3 x 10 5 cellules endocervicales dans un tampon de 100 ul FACS (PBS contenant 1% de sérum albumine bovine
  2. Ajouter 1 pl / 10 6 , LIVE / DEAD Fixable kit Cell Stain Morte jaune et des anticorps pour des marqueurs de surface aux concentrations décrites dans le tableau 1.
  3. Incuber les cellules pendant 30 min à 4 ° C, à l'abri de la lumière.
  4. Ajouter 1 tampon FACS mL et les cellules et les tubes de centrifugation pendant 5 min à 350 xg
  5. Resuspendre culot cellulaire dans 300 pi 1% de paraformaldehyde.
  6. Préparer des commandes de compensation en utilisant des billes et des anticorps utilisés pour la coloration par addition de 100 ul de tampon FACS et une chute des bourrelets et la même concentration d'anticorps utilisés pour la coloration de l'échantillon.
  7. Acquérir des perles et des échantillons colorés sur un cytomètre de flux, équipé de 405 nm, 488 nm et 635 nm lasers.

4. Endocervical Gamma delta T cellule d'isolement

  1. Isolement des perles magnétiques
    1. Re-suspendre endocervical culot cellulaire (≤10 7 cellules total), décrit dans 2.6, dans 40 pi de tampon inclus dans le kit de microbilles gamma delta TCR référencé dans la table des matières et réactifs.
    2. Suivez les instructions du kit pour deux étapes protocole de coloration: d'abord, l'esprith anti-TCR gamma delta haptène-anticorps et, deuxièmement, avec anti-haptène microbilles-FITC
    3. Après une incubation de 15 min à 4-8 ° C, laver les cellules en ajoutant 1 ml de tampon et centrifuger à 300 g pendant 10 min. Décanter le surnageant en retournant le tube, et appuyez sur sec à l'aide d'un morceau de papier.
    4. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de tampon fourni et préparer la colonne magnétique en le plaçant dans le séparateur magnétique approprié selon le protocole du fournisseur.
    5. Appliquer la suspension de cellules sur la colonne et recueillir des cellules non marquées qui passent à travers et colonne de lavage 3x avec une quantité appropriée de tampon (500 pi). Effectuer les étapes de lavage par addition d'un tampon à trois reprises, à chaque fois une fois que le réservoir de la colonne est vide. Collecter effluent total. Ceci est la fraction de cellules non marquées, negative
    6. Supprimer la colonne forment le séparateur magnétique et la pipette 1 ml de tampon sur la colonne et immédiatement débusquer fraction avec l'étiquette magnétiquementcellules ed en appliquant fermement le piston fourni avec la colonne.
      REMARQUE: isolé des cellules T gamma delta sont déjà colorées par fluorescence pour l'analyse de cytométrie en flux depuis microbilles anti-haptène magnétiquement marqués sont conjugués avec FITC fluorescent de colorant.
  2. cellule tri
    1. Pour le tri cellulaire, étiquette cellules endocervicales avec la viabilité filière et panel d'anticorps tel que décrit dans la section 3.
    2. Mettre en place des portes électroniques sur le live, CD45 + CD3 + et gamma delta cellules positives et effectuer un tri cellulaire.

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Résultats

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Récemment, nous avons analysé les cellules intraépithéliales endocervicales GD T et nous avons été le premier à signaler à propos de la perte de cellules endocervical delta gamma T dans le VIH des femmes infectées 9, 11. Ici, nous décrivons le protocole d'isoler et d'analyser le sous-ensemble de cellules endocervical delta T gamma. Comme on le voit sur la figure 1, les cellules GD T peuvent être facilemen...

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Discussion

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Évaluation de la femme inférieure génitale vulnérabilité de la muqueuse des voies est une composante essentielle des études cliniques portant sur le risque d'acquisition et de la transmission du VIH. Typiquement FGT vulnérabilité à l' infection à VIH est évaluée en mesurant les modulateurs immunitaires solubles dans les sécrétions génitales (cytokines, des chimiokines et des peptides antimicrobiens) 12, 13. Cependant, ces biomarqueurs sont seulement indi...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne sont pas une association commerciale ou autre qui pourrait constituer un conflit d'intérêts (par exemple, stocks pharmaceutiques propriété, de conseil, de membres du conseil consultatif, les brevets pertinents, ou le financement de la recherche).

Remerciements

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Nous remercions les participants à l'étude Miami WIHS pour leur volonté de participer à ce travail. Les données contenues dans ce manuscrit ont été recueillies par Interagency HIV Study des femmes Miami (WIHS). Le contenu de cette publication relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas la position officielle de la National Institutes of Health (NIH). Ce travail a été soutenu par l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses et de l'étude des infections interagences VIH des femmes (WIHS) [subvention numéro U01 AI103397], Institut national des allergies et des maladies infectieuses, National Institutes of Health [numéro de subvention P30AI073961], le Centre national pour l'avancement Sciences translationnelle et l'Institut national sur la santé des minorités et les disparités en santé, Institut national de la santé [numéro de subvention UL1TR000460 et 1KL2TR000461], et l'Institut national de la santé infantile et du développement humain, l'Institut national de la santé [numéro de subvention K23HD074489].

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cytobrush Plus GT  ;(CareFusion, San Diego, CA, États-Unis
IMDM, Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium  ;ThermoFisher Scientific12440061
compteur automatisé de cellules Beckman Coulter (l’analyseur de viabilité cellulaire de la série Vi-CELLBeckman Coulter496178
DMSO, le diméthylsulfoxyde de sodium.Sigma Aldrich  ;D2650
FBS, Sérum de veau fœtalInvitrogen, Gibco26140-079
PBSInvitrogen, Gibco10010023
BSASigma AldrichA-9647
LIVE/DEAD Kit de coloration jaune à cellules mortes fixable  ;LifeTechnologies,L349S9
1 % paraformaldéhydeSigma Aldrich  ;D6148
Cytomètre en flux Fortessa  ;Becton Dickinson
UltraComp eBeadseBioscience01-2222-42
ArC Amine Perles de Compensation Réactive (Life Technologies, Grand Island, NY, USA)Life TechnologiesA10346
Anti-TCR gamma/delta MicroBead Kit  ;Milteny Miltenyi Biotec Inc.130-050-701
Colonne103-042-201
Séparateur4124
MS MACS

Références

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  1. Kaul, R., et al. The genital tract immune milieu: an important determinant of HIV susceptibility and secondary transmission. J Reprod Immunol. 77, 32-40 (2008).
  2. Haase, A. T. Targeting early infection to prevent HIV-1 mucosal transmission. Nature. 464, 217-223 (2010).
  3. Hayday, A. C. gamma][delta] cells: a right time and a right place for a conserved third way of protection. Ann Rev Immunol. 18, 975-1026 (2000).
  4. Nakasone, C., et al. Accumulation of gamma/delta T cells in the lungs and their roles in neutrophil-mediated host defense against pneumococcal infection. Microbes and infection / Institut Pasteur. 9, 251-258 (2007).
  5. Autran, B., et al. T cell receptor gamma/delta+ lymphocyte subsets during HIV infection. Clin Exp Immunol. 75, 206-210 (1989).
  6. Pauza, C. D., Poonia, B., Li, H., Cairo, C., Chaudhry, S. gammadelta T Cells in HIV Disease: Past, Present, and Future. Front Immunol. 5, 687(2014).
  7. Hayday, A. C., Spencer, J. Barrier immunity. Sem Immunol. 21, 99-100 (2009).
  8. Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Rev Immunol. 11, 445-456 (2011).
  9. Strbo, N., et al. Loss of Intra-Epithelial Endocervical Gamma Delta (GD) 1 T Cells in HIV-Infected Women. AJRI. 75, 134-145 (2016).
  10. Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration measurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab Hematol. 10, 109-111 (2004).
  11. Alcaide, M. L., et al. Bacterial Vaginosis Is Associated with Loss of Gamma Delta T Cells in the Female Reproductive Tract in Women in the Miami Women Interagency HIV Study (WIHS): A Cross Sectional Study. PloS one. 11, e0153045(2016).
  12. Masson, L., et al. Defining genital tract cytokine signatures of sexually transmitted infections and bacterial vaginosis in women at high risk of HIV infection: a cross-sectional study. Sex Transm Dis. 90, 580-587 (2014).
  13. Fichorova, R. N., et al. Interleukin (IL)-1, IL-6, and IL-8 predict mucosal toxicity of vaginal microbicidal contraceptives. Biol Reprod. 71, 761-769 (2004).
  14. Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples. JoVE. , (2014).
  15. McKinnon, L. R., et al. Optimizing viable leukocyte sampling from the female genital tract for clinical trials: an international multi-site study. PloS one. 9, e85675(2014).
  16. Dominguez, M. H., et al. Highly multiplexed quantitation of gene expression on single cells. J Immunol Methods. 391, 133-145 (2013).

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Mots-clés

chantillon par brosse endocervicaleisolation par billes magn tiquestri cellulaire activ par fluorescenceTCR gamma deltacellules CD45 positivescellules CD3 positivesexpression du colorant de viabilitdiagramme de diffusion vers l avant et lat rale

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