In Situ Détection et Quantification de la cellule unique de nanoparticules d’oxyde métallique à l’aide de l’analyse par microsonde nucléaire

Résumé

Nous décrivons une procédure pour la détection des éléments chimiques présents in situ dans les cellules humaines, mais aussi leur quantification in vitro . La méthode est bien adaptée à tout type de cellule et est particulièrement utile pour des analyses chimiques quantitatives dans des cellules individuelles après in vitro l’exposition nanoparticules d’oxyde métallique.

Résumé

Micro-analytical techniques basées sur l’imagerie de l’élément chimique permettent la localisation et quantification de composition chimique au niveau cellulaire. Ils offrent de nouvelles possibilités pour la caractérisation des systèmes vivants et sont particulièrement adaptés pour détecter, localiser et quantifier la présence de nanoparticules d’oxyde METALLIQUE en spécimens biologiques et l’environnement. En effet, ces techniques de toutes les exigences correspondantes en matière de (i) la sensibilité (de 1 à 10 µg.g^-1 de masse sèche), résolution spatiale de gamme micromètre (ii) et (iii) multi-éléments détection. Compte tenu de ces caractéristiques, imagerie élément chimique microfaisceaux peut puissamment compléter les techniques d’imagerie courants tels qu’optique et microscopie de fluorescence. Ce protocole décrit comment effectuer une analyse par microsonde nucléaire sur des cellules cultivées (U2OS) exposés à des nanoparticules de dioxyde de titane. Les cellules doivent grandir et être exposés directement dans un porte-échantillon spécialement conçu pour utiliser le microscope optique et dans les étapes de l’analyse par microsonde nucléaire. Plongée-gel fixation cryogénique des échantillons conserve l’organisation cellulaire et la distribution des éléments chimiques. Analyse simultanée microsonde nucléaire (microscopie ionique de transmission, de rétrodiffusion de Rutherford et de particule induite par émission de rayons x) effectuée sur l’échantillon fournit des informations sur la densité cellulaire, la distribution locale des les éléments chimiques, ainsi que le contenu cellulaire des nanoparticules. Il y a un besoin croissant de ces outils analytiques au sein de la biologie, en particulier dans le contexte émergent Nanotoxicologie et nanomédecine pour lesquels notre compréhension des interactions entre les nanoparticules et les échantillons biologiques doit être approfondie. En particulier, comme l’analyse par microsonde nucléaire ne nécessite pas de nanoparticules d’être étiquetés, abondance de nanoparticules est quantifiables jusqu’au niveau des cellules individuelles dans une population de cellules, indépendamment de leur état de surface.

Introduction

Homéostasie cellulaire est déterminée par le contrôle de l’absorption, l’assimilation et la localisation intracellulaire de différents oligo-éléments (ions, métaux, composés inorganiques exogènes). Ces composants sont souvent sous forme de traces, mais néanmoins, peuvent avoir un impact considérable dans la physiologie du système. Ainsi, l’étude de la biochimie cellulaire dans des situations normales et pathologiques/a souligné est une étape-clé vers une compréhension globale des mécanismes métaboliques cellulaires. Par conséquent, le développement des techniques d’imagerie et d’analyses permettant à l’enquête d’abondances chimiques intracellulaires, organisation structurale et leurs fonctions métaboliques associées devient nécessaire. Méthodes très peu sont en mesure de fournir un élément quantitative in situ d’information concernant la nature dans l’ensemble chimique d’un échantillon donné. En dehors des méthodes d’analyse d’échantillons sous la forme de vrac, in situ analyses examiner des échantillons biologiques dans leur intégralité sans perte d’informations de massives et structurelles, afin de préserver leurs composants chimiques (oligo-éléments et ions) et protéines. En outre, comme les nanosciences continuent de développer, imagerie améliorée et les méthodes d’analyse pour la surveillance environnementale à l’échelle cellulaire devra observer et quantifier les interactions et les comportements de nano-objet. ¹

Nanoparticles (NPs) ont été définis en tant qu’objets présentant au moins une dimension du visage dans la gamme 1 et 100 nm. ² en raison de leurs propriétés physicochimiques particulières, NPs sont largement utilisés dans l’industrie. NPs sont employés dans les bio-applications et en nanomédecine. ^{3 , 4} malgré les nombreuses caractéristiques physico-chimiques du NPs, ils peuvent générer des risques d’effets nocifs sur la santé humaine et l’environnement. Ces risques peuvent être induites par l’exposition prolongée et répétée à divers niveaux de concentration et cela n’a pas encore été clairement établie. ^{5 , 6 , 7 , 8} en particulier, le sort de NPs à l’intérieur des cellules et les réponses cellulaires associées sont, à ce jour, pas entièrement décrit. C’est en partie en raison de la rareté des méthodes qui permettent la détection et la quantification du NPs intériorisées dans une seule cellule. ⁹

Les outils analytiques classiques utilisées pour estimer la dose cellulaire des nanoparticules sont microscopies, spectrométrie de masse (MS), couplage inductif plasma MS (ICP-MS)^10,11 et la chromatographie en phase liquide que MS (LC-MS), mais ils ne donnent informations utiles à l’échelle macroscopique. Aucun d’eux ne peut fournir une évaluation précise de la teneur de NPs subcellulaire ni la distribution de NPs sans avoir recours à des méthodes de fractionnement. Une évaluation systématique de la relation dose-effet est donc impossible avec ces méthodes, par opposition aux méthodes basées sur la spectroscopie atomique comme microsonde nucléaire analyse^12,13, microscopie de fluorescence de rayons x synchrotron¹⁴ et spectrométrie de masse à ions secondaires (SIMS). ^{15 , 16} ces méthodes sont particulièrement intéressants car ils complètent les observations faites à l’aide de la microscopie en fluorescence, surtout lorsque NPs ne peut pas être étiquetés avec des molécules fluorescentes et sont ainsi étudiés dans leur état natif. Dans une certaine mesure, même lorsque NPs sont greffés avec des fluorophores, (i) quantification reste difficile parce que ne connaît pas le niveau de marquage par NP et (ii) la modification chimique de la surface de la NP peut modifier sa distribution cellulaire.

Dans cet article, nous nous concentrons sur une méthode basée sur une combinaison de techniques de microsonde nucléaire visant à l’imagerie de la morphologie et la composition élémentaire des spécimens biologiques en majeur, mineur et tracer les concentrations.

Analyse par microsonde nucléaire s’avère particulièrement adapté pour la mesure des éléments chimiques dans les tissus biologiques. La résolution latérale de faisceau (0,3 à 1 µm) et la sensibilité dans la détection de l’élément chimique (de 1 à 10 µg.g poids sec^-1 ) sont bien adaptés pour des études au niveau cellulaire. Microsonde nucléaire techniques sont basées sur la détection de particules (photons, électrons, ions) émise après que le faisceau d’ions (en général fonctionnant aux énergies MeV) interagit avec les atomes présents dans l’échantillon. Les interactions qui se produisent dans les cellules sont principalement : 1) excitation/ionisation des atomes, suivie d’une émission de photons après atomes retournent à leur état fondamental ; et 2) diffusion des particules incidentes conduisant au changement dans l’énergie et de la direction. La mesure de la particule émise énergie allowsthe identification des atomes impliqués dans l’interaction. Pour effectuer le mappage des éléments, le microfaisceaux d’ions est à plusieurs reprises analysé sur la surface de l’échantillon, souvent sur une superficie d’environ 100 par 100 µm² contenant plusieurs cellules. Particules émises sont détectés et leur énergie est enregistré pour chaque position du faisceau. Tri des particules selon la position du faisceau, identifiant ainsi la structure responsable de l’émission de ces particules est le but du traitement des données. Nous décrivons ici précisément une approche basée sur la microscopie par fluorescence et analyse par microsonde nucléaire pour détecter mais aussi de quantifier NPs exogènes à l’échelle cellulaire et subcellulaire, afin d’enquêter sur les conséquences des interactions NP avec la vie systèmes. Nous nous concentrerons particulièrement sur les possibilités offertes par cette méthode en termes in situ la quantification des rejets de dioxyde de titane (TiO₂ NPs) des nanoparticules agrégats au niveau subcellulaire.

Protocole

1. préparation titulaire

1. Préparation et conception du titulaire de l’échantillon
   1. Fabriquer un porte-échantillon en perçant un carré de 5 x 5 mm dans un cadre PEEK épaisseur 1 mm.
   2. Nettoyer en rinçant avec de l’éthanol 70 % (v/v) et gardez en plaques stériles jusqu'à utilisation.
      Roman Un porte-échantillon approprié pour la culture cellulaire et de la manipulation de la cellule est nécessaire. Il doit être conçu pour cell culture, in vitro des observations par microscopie optique et analyse par microsonde nucléaire et d’imagerie. Ce support est constitué d’un coup d’oeil cadre¹³.
2. Préparation des échantillons titulaire
   1. Préparer la solution de Formvar en dissolvant 1 mg de poudre de Formvar dans 100 mL de chloroforme.
   2. Étirer la feuille en polycarbonate sur une ossature métallique afin qu’elle ne présente aucun pli.
   3. Utiliser un embout stérile pour répandre la solution Formvar autour du trou de porte échantillon.
   4. Posez délicatement le porte-échantillon avec de la colle sur la feuille de polycarbonate étiré (un carré de 5 x 5 mm).
   5. Répétez la séquence précédente pour préparer un porte-échantillon pour chaque répétition.
      Roman Le film en polycarbonate (PC) est biocompatible, assez épais et résistant aux différents protocoles et contraintes analytiques.
      Attention- chloroforme est toxique. Éviter toute inhalation, ingestion ou contact avec la peau. Toujours utiliser une hotte de laboratoire chimique fonctionnant correctement et de filtres appropriés.
3. Stérilisation de porte échantillon
   1. Placez le porte-échantillon monté dans une fiole conique avec 50 mL d’éthanol à 70 % (v/v) sous agitation à 180 tr/min et + 37 ° C pendant la nuit, à l’aide d’un incubateur/agitateur.
   2. Rincez le titulaire plusieurs fois dans l’eau distillée stérile.
   3. Air sécher dans des conditions stériles et de les exposer aux rayons ultraviolets (Lampe germicide de biosécurité banc, classe II) pendant 30 min de chaque côté.
   4. Conserver les échantillons dans des plats de 12 puits stériles (titulaire d’un seul échantillon par puits) jusqu’au moment d’utiliser.
      Remarque : Plusieurs détenteurs de l’échantillon peuvent être conservés à température ambiante en plaques de 12 puits secs et stériles scellé avec du parafilm pendant plusieurs jours.

2. la croissance des cellules dans le porte-échantillon approprié.

Mise en garde : Protocole doit être effectué dans un banc de flux laminaire de biosécurité (classe II) à exclure les micro-organismes contaminants. Gérer les antibiotiques (p. ex. pénicilline, streptomycine) avec des gants. Respecter les meilleures pratiques lors de la manipulation de matériel biologique (lignées cellulaires, génétiquement modifiées dérivées des cellules humaines).

Critique: des lignées cellulaires utilisées doivent être vérifiées pour s’assurer qu’ils ne sont pas infectés par Mycoplasma.

1. Transfecter lignée cellulaire U2OS avec plasmide portant Matrix-roGFP ^17,18,19 , à l’aide d’une méthode de transfection conformément au protocole établi par le fabricant.
2. Pour confirmer la transfection avec le plasmide porteur le biocapteur et pour éviter toute perte de plasmide, sélectionner et conserver les cellules transfectées sur le milieu de culture approprié.
3. Visualiser les cellules transfectées par microscopie de fluorescence a subi de la transfection et de confirmer l’expression de la fluorescence et l’affichage d’un réseau mitochondrial réticulaire et tubulaire¹⁹.
   Pause point : Les cellules peuvent être congelés dans l’azote liquide pendant plusieurs années.
4. Utilisez la population de cellules transfectées en cultivant des cellules dans un milieu approprié afin d’obtenir des populations de cellules sub confluentes. La croissance de cellules à 37 ° C, 5 % (v/v) de CO₂ dans une atmosphère saturée d’eau.
5. Graine de cellules à une concentration, telles qu’elles sont à la confluence de 80 % le jour de la fixation. En règle générale, une concentration de 500 cellules / µL pourrait être utilisée. Récolter les cellules à l’aide de 400 µL de trypsine-EDTA 0,25 % (v/v) et maintenir pendant 3 min à 37 ° C. Arrêter l’action de la trypsine avec 1 mL de milieu de culture. Les cellules de granule par centrifugation pendant 5 min à 230 x g et + 4 ° C, puis enlever le surnageant et ajouter le volume souhaité de milieu de culture frais.
   Remarque. Le protocole s’applique à tous les types cellulaires et le nombre de cellules ensemencées dépend de la taille de la cellule et sur le temps de doublement cellulaire.
   Mise en garde : Éviter de soumettre la trypsine, antibiotiques et sérum aux cycles de gel-dégel répétés. Gardez-les stérile. Diviser la solution en aliquotes et congelez-les à −20 ° C. Stocker les aliquotes jusqu'à la date d’expiration. Rincez soigneusement le culot cellulaire afin de supprimer complètement la trypsine. Traces de trypsine résiduelle vont retarder et diminuer l’efficacité de l’électrodéposition.
6. Compter les cellules et effectuer une dilution avec milieu de culture complet frais maintenu à 37 ° C afin d’obtenir une suspension de cellules avec 500 cellules / µL.
   Remarque : La concentration de la suspension cellulaire doit être adaptée en fonction du type cellulaire, pour une baisse de 40 µL sur plaque.
7. Plaque d’une baisse de 40 µL vers le centre de la feuille de polycarbonate. Placer soigneusement l’échantillon de 2 h à + 37 ° C, 5 % (v/v) de CO₂ dans une atmosphère saturée d’eau.
   Critique: Une fois que l’échantillon est placé dans un incubateur, limiter autant que possible tout mouvement mécanique afin de favoriser la fixation des cellules rapide. Selon le type de cellule, il pourrait être nécessaire d’incuber les cellules plus de 2 h pour une efficacité optimale platting. Vérifiez que l’atmosphère de la couveuse est bien saturé pour empêcher l’évaporation des gouttes.
8. Vérifiez que les cellules sont bien attachés sur la feuille en polycarbonate à l’aide d’un microscope optique. Doucement, ajouter 2 mL de milieu complet frais et garder pendant 24 h.

3. nanoparticules préparation et exposition

NOTE : Fluorescent modifiés colorant TiO₂ NPs ont été conçues, synthétisé et chimiquement modifiées à l’isothiocyanate de tétraméthyl rhodamine (TRITC). ^{20 , 21} cette modification de surface permet de nanoparticules détection, suivi et localisation in situ et en cellulo dans les cellules vivants ou fixes ou dans les organismes multicellulaires. ^{12 , 13 , 18}

Mise en garde : Nanomatériaux et nanoparticules doivent être manipulés avec soin. Éviter toute inhalation, ingestion ou contact avec la peau. Pour empêcher la diffusion dans l’air, nanoparticules sont maintenues dans la solution (eau ultrapure).

1. Préparer une suspension de 1 mg.mL⁻¹ de^TiO₂ NPs dans de l’eau ultrapure. Disperse les TiO₂ NPs utilisant des impulsions intenses 1 min sonication à ta (750 W, 20kHz, amplitude : 30 %) à l’aide d’un générateur d’ultrasons et une microsonde conique dédiée.
2. Diluer TiO₂ NPs à la concentration voulue dans le milieu de culture afin d’obtenir une suspension de l’exposition de 4 µg.cm⁻² (concentration finale). Remplacer le moyen avec le volume approprié de moyennes NPs contenant des cellules et mélanger doucement pour une répartition homogène de la TiO₂ NPs. Prepare cellules témoins de même sans l’ajout de TiO₂ NPs.
3. Incuber les populations de cellules pendant 24 h à 37 ° C, 5 % (v/v) de CO₂ et une atmosphère saturée d’eau.

4. microscopie de fluorescence et de fixation paraformaldéhyde.

1. Préparer une solution fraîche de paraformaldéhyde (PFA, 4 % p/v) stockées dans la Saline de tampon Phosphate (PBS, pH 7,4).
   1. Dissoudre 4 g de poudre PFA dans 100 mL de PBS. Chauffer la solution à 65 ° C en remuant à l’aide d’un aimant et un agitateur magnétique dans une hotte de laboratoire. Augmenter le pH en ajoutant 1 M NaOH une goutte à la fois jusqu'à ce que la solution efface. Laisser refroidir la solution à température ambiante et ajuster le pH à 7,4. Utiliser la solution fraîchement préparée immédiatement ou conserver à + 4 ° C et protéger de la lumière.
      Remarque : Des solutions PFA pré-faites pourraient être utilisées mais une préparation extemporanée de l’IFP garantit la meilleure qualité de fixation et de conservation à long terme des échantillons fixes.
      Mise en garde : PFA est toxique ; éviter toute inhalation, ingestion ou contact avec la peau. Toujours utiliser une hotte de laboratoire chimique fonctionnant correctement et de filtres appropriés.
2. Une fois, le temps d’incubation est écoulé, retirez le milieu de culture cellulaire contenant le TiO₂ NPs. Rincer les populations de cellules une fois avec le milieu de culture frais et une fois avec du PBS (2 mL). Retirer les PBS, rincer rapidement à une partie aliquote de l’IFP fraîche et froide (4 % p/v, + 4 ° C).
   1. Ajouter PFA (2 mL, 4 % p/v, + 4 ° C). Incuber 15 min à température ambiante.
   2. Retirer la PFA, rincer les cellules avec du PBS (2 mL, 3 fois, 5 min) sous agitation.
      Pause point : Ces fixes chimiquement des échantillons peuvent être utilisés pour la procédure de « plongeon-gel » après la fluorescence imaging (passez à l’étape 5) ou utilisés uniquement pour la fluorescence imaging (passez à l’étape 4.3).
3. Colorent le noyau avec Hoechst³³³⁴² en incubant les cellules pendant 10 min dans du PBS. Hoescht³³³⁴² est utilisé à une concentration finale de 500 nM. Après incubation, enlever la solution et rincer avec du PBS.
   Mise en garde : Hoechst³³³⁴² est perméant cellule et peuvent être toxiques. Eviter le contact direct et utilisez des gants lors de préparation et d’utilisation de Hoechst³³³⁴².
   Critique: veiller à ce que le Hoechst³³³⁴² solution de coloration est fraîchement préparés et maintenus dans des conditions stériles.
4. Processus de correction d’échantillons pour in situ et imagerie cellulaire unique à l’aide de la microscopie de fluorescence (Figure 1).

5 « déshydratation et Fixation plongée-gel »

1. Préparer une plaque de transfert en aluminium en refroidissant dans l’azote liquide. Magasin la plaque dans une boîte remplie d’azote liquide et maintenir la surface de la plaque au-dessus du liquide dans la vapeur d’azote.
   Remarque : La plaque de transfert peut être faite de toute pièce métallique (ici, nous avons utilisé en aluminium) qui peut être refroidi à la température de l’azote liquide, et qui peut entrer dans le compartiment de mesure lyophilisateur.
   Critique: La boîte doit être fermée autant que possible afin d’éviter le dépôt de vapeur d’eau sur la surface de la plaque froide. L’exemple stockée sur la plaque lors de la préparation ne devrait pas être couvertes par l’azote liquide.
2. Rincer les cellules une fois dans le milieu de culture et ensuite deux fois plus, brièvement, dans l’eau stérile et ultra-pure pour obtenir débarrasser de toute trace d’autres sels extracellulaires.
   Critique: Veiller à ce que les médias sont fraîchement préparés et maintenus dans des conditions stériles. Faire chauffer tous les médias à 37 ° C avant d’être utilisé. Le rinçage doit être très brève (quelques secondes) et l’excès de liquide sur les échantillons retiré aussi rapidement que possible.
3. Plongée-gel les cellules à-150 ° C dans le liquide refroidi à l’azote 2-Méthylbutane pendant 30 s et le lieu sur l’aluminium plaque de transfert. Conserver les échantillons ici lors de la préparation de tous les autres échantillons. Lorsque les échantillons sont tous cryofixés, transférer tout-at-once en plaçant la plaque de transfert dans un lyophilisateur.
   Critique: Le processus global de la cryofixation ne devraient pas durer plus de 20 min afin d’éviter des modifications structurelles pour apparaître dans les échantillons stockés temporairement dans la boîte de transfert.
4. Lyophiliser les échantillons en utilisant les séquences suivantes : 1) effectuer une dessiccation primaire pendant 12 à 24 h (-99 ° C, 10^-3 mbar) à basse pression et basse température, puis 2) effectuer une phase de dessiccation secondaire pendant au moins 24 h, augmentant la température de la plaque à + 40 ° C, tout en gardant la pression basse (+ 40 ° C, 10^-3 mbar).
   Mise en garde : Azote liquide est très froid et peut endommager gravement engelures ou œil au contact. Utiliser des contenants à banc adapté pour le transport et porter un équipement de sécurité (gants cryogéniques, protection oculaire et faciale).
   Attention : 2-Méthylbutane est extrêmement inflammable. Une contamination nocive de l’air peut être atteint assez rapidement sur l’évaporation de cette substance à + 20 ° C. Éviter toute inhalation, ingestion ou contact avec la peau. Utilisez la respiration et lunettes de protection et des gants de protection. Toujours utiliser une hotte de laboratoire chimique fonctionne correctement. Peut être conservé à + 4 ° C.
   Critique: Utiliser un thermomètre approprié (-150 ° C) pour surveiller les températures 2-Méthylbutane lors de la session « Plongeon-gel ». Le 2-Méthylbutane doit être conservé au frais dans une phase liquide. Transférant cryofixés échantillons à l’atmosphère ambiante peut provoquer des dommages cellulaires en raison de l’augmentation de température ou de la vapeur d’eau de condensation sur la surface de l’échantillon. En conséquence, le transfert doit se faire aussi vite que possible (30 s)
   Pause point : Après la cryofixation, les échantillons peuvent être conservés à température ambiante pendant plusieurs jours dans des conditions stériles et secs (protégées contre la poussière et l’humidité). Soigneusement gérer les échantillons avec une pince fine et placez-les dans une assiette de 12 puits stérile scellée avec du parafilm. Déshydratant peut être utilisé pour sécher l’atmosphère.

6. nucléaire analyse par microsonde

Remarque : L’analyse par microsonde nucléaire a été réalisée sur la ligne de microfaisceaux de AIFIRA (Applications Interdisciplinaires des Faisceaux d'Ions en Région Aquitaine) en utilisant des techniques d’analyses complémentaires ion beam émission de rayons x induite par particules (µ- PIXE) et microscopie ionique Transmission (µ-STIM). L’installation est issue d’un accélérateur de particules 3,5 MV offrant des faisceaux d’ions légers dans la gamme d’énergie de MeV. ^{22 , 23}

Pause point : AIFIRA est une installation de faisceau d’ions hébergée par l’Université de Bordeaux qui offre un accès aux équipes nationales et internationales après évaluation scientifique de l’expérience proposée.

1. Monter les détenteurs d’échantillon coup d’oeil sur une plaque ajourée à l’aide de ruban adhésif double-face.
2. Placer la plaque à l’échantillonnage dans un plan vertical perpendiculaire à la direction du faisceau.
3. Fermer la chambre d’analyse et vide la chambre d’analyse.
4. Microscopie ionique Transmission (µ-STIM)
   NOTE : STIM est utilisé pour enregistrer des cartes de densité des cellules après conversion en masse cellulaire, de perte d’énergie en profitant du fait que la perte d’énergie est proportionnelle à la densité surfacique de sample (exprimée en µg.cm^-2).
   1. Utiliser un microfaisceaux d’hélium (He⁺) de 2 MeV comme une sonde avec une taille dans le plan focal d’environ 300 nm de diamètre et à la faible maîtrise (2000 ions.s^-1). Mesure l’énergie des ions transmises avec un détecteur silicium planaire (détecteur de PIPS, 25 mm², 11 résolution d’énergie de keV @ 5,4 MeV), placé derrière l’échantillon dans l’axe du faisceau.
5. Particule induit par les émissions de rayons x (µ-PIXE) et de la rétrodiffusion de Rutherford (µ-RBS).
   Nota : µ-Pixe et µ-RBS analyses donnent la répartition spatiale et la quantification des éléments chimiques avec une résolution de micromètre subsidiaire.
   1. Utilisez un microfaisceaux de proton (H⁺) 1,5 MeV (50-150 pA), porté vers le bas pour un diamètre de 1 µm et analyse sur les mêmes cellules d’intérêt repéré par STIM de 4 à 8 heures et environ 100 x 100 µm².
   2. Recueillir induites photons des rayons x émis par les atomes présents dans l’échantillon (plus lourd que Na) par un détecteur à semi-conducteurs si (Li) à haute résolution (résolution en énergie eV 145, @Mn-Kα) positionnés à 45 ° de l’axe du faisceau entrant. L’énergie des photons détectés permet d’identifier la nature des émetteurs (Z de l’élément, par exemple) et l’intensité des rayons x pour déterminer la concentration de l’élément.
   3. Collecter simultanément éparpillés à l’arrière des protons à-135 ° avec un détecteur silicium (détecteur partiellement appauvri, 25 mm², 11 keV FWHM @ 5,4 MeV) pour mesurer le nombre total de particules incidentes et de normaliser les intensités des rayons x.
      Critique: Une collection de normes d’étalonnage certifié pour la quantification de la concentration atomique est utilisée pour calibrer la réponse du détecteur rayons-x. Matériaux de référence sont une collection de couches minces atomiques déposés sur 6,3 µm épaisses feuilles de Mylar. Émis vont d’énergies des rayons x de 0,6 (Li, K line) à 20,2 keV (Rh, K line).

7. analyse de données

1. Reconstruire les cartes élémentaires chimiques en utilisant le plugin de IBA-J pour ImageJ. ²⁴
   Remarque : Un logiciel dédié sous la forme d’un plugin d’ImageJ a été développé pour traiter les données d’analyse brute microsonde nucléaire. Données brutes correspondent à une liste d’événements provenant de faisceau de particules interaction avec les cellules qui y sont enregistrées ainsi que la position du faisceau comme une séquence chronologique.
   1. Utiliser le plugin IBA-J pour trier les événements selon leur type : transmis énergie ionique (STIM), rétrodiffusé énergie ionique (RBS) ou l’énergie des photons des rayons x (PIXE). Ensuite, traiter séparément chaque type de données.
   2. Calculer la carte STIM de la densité de la zone
   3. Calculer la moyennes spectres d’énergie de photons des rayons x et définir pour chaque élément chimique d’intérêt une fenêtre d’énergie afin de récupérer la distribution spatiale de l’élément.
   4. Définir des zones d’intérêt (ROI) (p. ex. les cellules individuelles, structure dense, agrégats, etc..) et calculer les spectres de rayons x correspondants.
2. Analyser les spectres correspondants de RBS afin de calculer le nombre total de particules incident²⁵.
3. Ajustement des spectres de rayons x à l’aide du logiciel de Gupix²⁶ afin de déterminer la concentration de l’élément pour chaque ROI.
   Remarque : Limite de détection (LD) pour la méthode est dans la gamme 1 à 10 µg.g^-1 en masse sèche selon le numéro atomique des éléments (LOD diminue avec Z).

Résultats

Culture cellulaire et imagerie de fluorescence de TiO fluorescent étiqueté ₂ NPs

Nous avons conçu un porte-échantillon adapté à la culture de cellules, cellules de manutention ainsi qu’analyse multimodale. Plus précisément, il était important que le titulaire autorisé microscopie optique systématique comme bien comme nucléaire imagerie et analyse par microsonde. Ce po...

Discussion

Les auteurs décrivent une méthode fournissant des informations utiles au-delà de ce qui est possible avec d’autres techniques d’imagerie, notamment au niveau subcellulaire. Outre sa capacité d’imagerie, analyse par microsonde nucléaire offre aussi des possibilités de dosage d’éléments chimiques entrant dans la composition d’un échantillon biologique. Dans le présent travail, nous avons étudié des populations de cellules humaines et axé vers le bas pour l’analyse d’une région choisie d’intérêt basé sur une seule cellule e...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Culture cellulaire
U2OS	ATCC, LGC STANDARDS	ATCC HTB-96
Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine	Dominique DUTSCHER	L0211-500
FBS 500 mL	Dominique DUTSCHER	500105U
Pénicilline/Streptomycine  ;	ThermoFisher Scientific	11548876
L-Glutamine 200 mM, 100 mL  ;	Invitrogen	25030024
Geneticin 20 mL	ThermoFisher Scientific	10092772
Trypsine-EDTA 0,25 % (v/v)  ; 500 mL	ThermoFisher Scientific	11570626
Viromer Red	Lipocalyx	VR-01LB-01
Matrix-roGFP Plasmid	AddGene	#49437
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H3570	Manipuler avec précaution
NPs preparation
TiO2 P25 AEROXIDE	Degussa/Evonik
Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC)	SIGMA-ALDRICH	T3163	Modification de surface des NPs
Preparation d’échantillons
Feuille polycarbonate	Goodfellow	CT301020
Support de polyéther éther cétone (PEEK)	Matechplast	A-239-4047
Éthanol, absolu ACS	SIGMA-ALDRICH	02860-6x1L
Chlorform, anhydre, 99 %	SIGMA-ALDRICH	372978-1L  ;	Attention toxique
Formvar 100 g	Agar Scientific	AGR1201	Nocif. Utilisation dans une concentration de 10 & micro ; g par mL de chloroforme
NaOH	SIGMA-ALDRICH	S5881-500G
Fixation de l’échantillon
Poudre, 95 % Paraformaldéhyde	SIGMA-ALDRICH	158127-500G	Attention toxique. Utilisation en solution à 4 % dans le
PBS PBS (pH 7,4, sans Ca2+ et Mg2+)	ThermoFisher Scientific	11503387
Prolong Gold Réactif Anti-Fade	ThermoFisher Scientific	P36934
Triton X-100	SIGMA-ALDRICH	93443	Nocif
Cryofixation d’échantillons
Liquide azote	air liquides
Méthylbutane nocif >=99 %	SIGMA-ALDRICH	; M32631-1L	Attention toxique
Plaque de transfert en aluminium	Fait
Eau distillée et désionisée	Fait		Produit en laboratoire à l’aide du système Barnstead Smart2Pure
Parafilm	VWR	52858-000
Equipment
Barnstead Smart2Pure	ThermoFisher Scientific	50129870
Banc de biosécurité, classe II	ThermoFisher Scientific	MSC-Advantage
TC20 compteur automatisé	de cellules Biorad	145-0102SP
Lames de comptage 2 puits	Détecteur Biorad	1450016
PIPS, 25 mm2, résolution d’énergie 12 keV @5,5 MeV	Canberra  ;	PD25-12-100AM
Détecteur à semi-conducteurs haute résolution Si (Li), résolution de 145-eVénergie, @Mn-K&alpha ;	Oxford Instruments
Détecteur d’électrons secondaires (SED) de type Everhart-Thornley  ;	Orsay Physics	1-SED
Étalon d’étalonnage XRF Sodium ou chlore sous forme de	micromatière	34381
Étalon d’étalonnage XRF Magnésium sous forme	micromatière	34382
Étalon d’étalonnage XRF Aluminium sous forme d’Al métal	Micromatière	34383
Étalon d’étalonnage XRF Silicium comme	micromatière	34384
Étalon d’étalonnage XRF Soufre sous forme de CuSx	Micromatière	34385
Étalon XRF Calcium sous forme de CaF2	Micromatière	34387
Étalon XRF Titane sous forme de Ti métal	Micromatière	34388
Étalon XRF Fer sous forme de métal	Fe Micromatière	34389
Sonicateur 750W	Sonics Matériaux	11743619
Microsonde 3MM	Bioblock scientific	220-05
Lyophilisateur sous vide	Elexience	EK3147
Microscope optique Zeiss AxioObserver Z1	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	431006-9901
Platine motorisée xy	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objectif	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objectif	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	420781-9910
Jeu de filtres Zeiss 02	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	488002-9901
Jeu de filtres Zeiss 38HE	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	489038-9901
Jeu de filtres Zeiss 31	Carl Zeiss MicroImaging, GmbH	000000-1031-350
Hotte chimique	Erlab	Captair SD321
Accélérateur de particules	HVEE	singletron
Software
ImageJ software	National Institutes of health, USA	ImageJ 1.51
SimNRA software	Max-Planck-Institut fü ; r Plasmaphysik, Allemagne	SIMNRA 6.06
Logiciel Gupix	Université de Guelph, Canada	GUPIXWIN 2.2.4