L'utilisation d'un TMEM184A GFP-tagged Construct pour Confirmation de Heparin Receptor Identity

Résumé

Un TMEM184A codant pour la construction d'une étiquette de la GFP à l'extrémité carboxy-terminale conçu pour l'expression eucaryote, a été utilisé dans des essais visant à confirmer l'identification de TMEM184A comme récepteur d'héparine dans les cellules vasculaires.

Résumé

Lorsque de nouvelles protéines sont identifiées par l'isolement et l'analyse bioinformatique basée sur l'affinité, ils sont souvent en grande partie non caractérisés. Des anticorps dirigés contre des peptides spécifiques de la séquence prédite permettent des expériences de localisation. Cependant, d'autres interactions possibles avec les anticorps ne peuvent souvent pas être exclus. Cette situation a permis d'élaborer une série de tests qui dépendent de la séquence protéique. Plus précisément, une construction contenant la séquence de gène couplé à la séquence codant pour la GFP à l'extrémité C-terminale de la protéine a été obtenu et utilisé à ces fins. Des expériences pour caractériser la localisation, l' affinité du ligand, et le gain de la fonction ont été initialement conçues et réalisées pour confirmer l'identification des TMEM184A comme un récepteur d'héparine ^1. En outre, la construction peut être utilisé pour des études portant sur la membrane des questions de topologie et des interactions protéine-ligand détaillés. Le présent rapport présente arange de protocoles expérimentaux basés sur la construction GFP-TMEM184A exprimé dans les cellules vasculaires qui pourraient facilement être adapté à d'autres nouvelles protéines.

Introduction

L'identification des protéines candidates pour de nouvelles fonctions dépend souvent des protocoles d'isolement basées sur l'affinité suivie par une détermination de séquence partielle. De récents exemples de protéines nouvellement identifiées comprennent la protéine transmembranaire 184A (TMEM184A), un récepteur d'héparine identifié après les interactions d'affinité d' héparine ¹ et TgPH1, une protéine de domaine pleckstrine qui se lie phosphoinositide PI (3,5) _P2 ^2. Autre nouvelle identification des protéines implique une analyse de séquence directe de peptides tel que , par Vit, et al. qui a utilisé des peptides transmembranaires pour identifier les produits de protéines à partir de gènes précédemment non caractérisés ^3. De même, l' identification de nouvelles séquences de protéines peut être réalisée en utilisant la bioinformatique à la recherche de familles de protéines précédemment caractérisées telles que l' identification de nouvelles protéines 4TM ^4. L'examen des séquences de gènes de la famille des aquaporines a alainsi cédé l'identification de nouveaux membres avec de nouvelles fonctions ^5. Après l'identification, l'analyse de la fonction des protéines est typiquement une étape suivante qui peut parfois être examinée à l'aide d'un dosage spécifique de la fonction de la protéine comme dans le cas d'aquaporine.

Lorsque cela est possible, la fonction d'une protéine nouvellement identifiée peut être examinée avec enzymatique spécifique ou des tests de fonction similaires in vitro. Étant donné que de nombreuses fonctions nouvelles protéines dépendent des interactions complexes qui se produisent uniquement dans des cellules ou organismes intacts, dans des essais in vitro ne sont pas toujours efficaces. Cependant, les dosages in vivo doivent être conçus de telle sorte qu'ils dépendent de la séquence du gène. Dans la culture cellulaire, et / ou des organismes modèles simples, knockdown peut apporter la preuve pour l'identification de protéines / fonction ^6. Avec de nouvelles protéines identifiées comme indiqué ci-dessus, il est souvent insuffisant pour simplement renverser une protéine pour confirmer la fonction, und la conception des tests fonctionnels in vivo qui dépendent de la séquence du gène devient important pour la caractérisation de nouvelles protéines.

L'identification récente de TMEM184A comme un récepteur d'héparine (qui module la prolifération dans le muscle lisse vasculaire et des réponses inflammatoires dans les cellules endothéliales) utilisant la chromatographie d'affinité et MALDI MS ^{1, 7} a été l'occasion de développer une collection d'essais après knockdown a abouti à des résultats cohérents avec l'identification . Une étude récente a confirmé que l' héparine interagit spécifiquement avec plusieurs facteurs de croissance, leurs récepteurs, les composants de la matrice extracellulaire, des récepteurs d'adhésion cellulaire et d' autres protéines ^8. Dans le système vasculaire, l' héparine et l' héparane sulfate protéoglycanes (contenant du sulfate d' héparane des chaînes de structure similaire à l' héparine) interagissent avec plusieurs centaines de protéines ^9. Pour confirmer fonctionnellement that TMEM184A a été impliqué dans l'absorption d'héparine et de liaison, les techniques qui employaient la construction de gène pour TMEM184A ont été développés. Le présent rapport comprend une collection de tests basés sur une GFP-TMEM184A construire pour une utilisation à confirmer l'identité du TMEM184A comme un récepteur de l'héparine.

Protocole

1. Conception d'une construction GFP-protéine

1. Achat, ou de la conception et de la construction, une construction de GFP-tagged basé sur la protéine en question.
   NOTE: Pour une construction acheté, des vecteurs standards sont disponibles auprès des laboratoires commerciaux qui incluent certaines ou toutes les suggestions suivantes: Pour une protéine membranaire, sélectionner un emplacement de C-terminale de la GFP, car il est moins susceptible d'interférer avec le trafic de protéine membranaire. Considérons une extension entre le gène d'intérêt et de la GFP, s'il y a des raisons de croire que l'extrémité C-terminale de la protéine en question est compacte pliée dans un domaine de la protéine. Sélectionnez la construction pour l'expression générale de cellules eucaryotes, mais permettent de construire la production dans des systèmes bactériens. Inclure un site de clivage (par exemple, pour la protéase TEV), par lequel la GFP peut être enlevé si on le souhaite pour certaines expériences dans lesquelles la GFP pourrait interférer avec l'activité de la protéine. Ajouter d'autres inserts, comme une étiquette supplémentaire pour la localisation ou affinitéinteractions (par exemple, His6). Cela n'a pas été nécessaire pour les essais décrits ici, mais peut faciliter d'autres dosages, ou être utiles directement adjacent au gène, avant la GFP, si le retrait de la GFP est souhaitée.

2. GFP-TMEM184A Expression dans les cellules vasculaires

1. Endothélial de culture ou des cellules musculaires lisses vasculaires à 0,2% de gélatine revêtues de tissus boîtes de culture comme indiqué précédemment ^{1, 6, 7.}
2. Ajouter la solution de culture de cellules de 5 ml de trypsine (0,5% p / v) à un rinçage à 100 mm, ou plus, Antenne confluentes de cellules. Incuber à 37 ° C jusqu'à ce que les cellules sont libérées seulement à partir de la plaque, et transférer les cellules dans un tube en polypropylène de centrifugation stérile.
3. Ajouter un inhibiteur de trypsine (par exemple d' un volume égal de milieu de culture ordinaire), tel qu'il est utilisé dans la culture de routine, à la solution de cellules / trypsine pour limiter l' activité de la trypsine. Sédimenter les cellules pendant 5 min à envirdiatement 600 xg (ou vitesse appropriée et le temps juste pour sédimenter les cellules pour la culture de tissus standard). Aspirer le surnageant.
4. Resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon d'électroporation HeBS (solution saline tamponnée au HEPES), ce qui limite la quantité de cellules temporelles sont dans le culot ou une suspension. Placez la suspension de cellules sur la glace et réaliser les étapes restantes sur la glace.
   NOTE: Pellet peut être lavé une fois avec HeBS avant resuspension.
5. Ajouter un volume suffisant de GFP-étiqueté TMEM184A plasmide dans les cellules pour obtenir une concentration finale de 20 pg / ml d'ADN. Utiliser un protocole identique pour une construction de GFP.
6. Placer environ 0,4 ml de la solution de cellules dans HeBS dans une cuvette d'électroporation. Pré-refroidir les cuvettes avant utilisation.
7. Électroporation les cellules en utilisant les conditions suivantes: Exponential Decay, 500 mF, ∞ ohm, et 170 V.
   REMARQUE: La tension d'un type cellulaire donné doit être optimisée. Des études préliminaires avec endothéliale et cel musculaires lissestypes de l ont été accomplies avec une construction GFP-vinculine pour déterminer la valeur de tension optimale indiquées ici, par exemple ^10.
   1. Pour optimiser l'électroporation, commencer avec les recommandations du fabricant de l'équipement (qui comprennent les conditions pour certains types de cellules standard). Utilisez la construction désirée ou une protéine fluorescente de contrôle construisent similaire en taille et caractéristiques de fluorescence à la construction souhaitée.
      NOTE: Petit acides nucléiques semblent entrer dans les cellules plus facilement que les grandes constructions, donc une construction avec seulement une protéine fluorescente peut être plus facile à exprimer qu'une plus grande.
   2. En utilisant la microscopie à fluorescence pour déterminer la viabilité cellulaire, le pourcentage de cellules dans lesquelles la construction fluorescente est exprimée après 24 et 48 h, et l'intensité de l'expression.
      REMARQUE: Diminuer la tension et / ou le temps légèrement si la survie est faible. Visez le temps le plus court possible entre la libération de cellules de la surface de la culture et de retourles cellules de la culture afin d'améliorer la survie. Une légère augmentation dans le temps ou une seconde impulsion peuvent améliorer l'absorption de construction si la survie est élevée et d'expression est faible. Les conditions optimales et l'expression varient entre les types de cellules. Si le pourcentage de cellules exprimant le produit d'assemblage est élevé, mais l'intensité est faible, ce qui augmente la concentration de l'ADN et le suivi des cellules transfectées avec le temps pour une intensité optimale, qui va varier en fonction de la demi-vie des protéines, ainsi que l'expression peut améliorer l'intensité. intensité de fluorescence peut être agrandie pour certains essais, le cas échéant, par une coloration par immunofluorescence de la GFP avec des anticorps anti-GFP
8. Après l'électroporation, les cellules des graines en six 30 mm puits de culture tissulaire avec des lamelles couvre-objet pour l'imagerie ou dans des boîtes de culture de tissus. La culture des cellules en utilisant les procédures de culture cellulaire standard.
9. En option: Remplacer le milieu de culture après 24 h pour éliminer tout tampon d'électroporation HeBS.

3. Visualisation de la GFP-TMEM184A Localisation

1. Rincer les cellules avec du PBS et agitation douce après culture pendant au moins 24 h. Limiter l'exposition à la lumière vive pour éviter la décoloration GFP.
2. Fixer les cellules avec 4% de paraformaldehyde (PFA) dans du PBS pendant 15 min à température ambiante sous agitation douce. Évitez d'utiliser des réactifs contenant du méthanol qui peut perméabiliser les cellules. La fixation avec du methanol peut être utilisé s'il est pas nécessaire d'évaluer les interactions ligand.
   Attention: paraformaldéhyde est toxique. Porter un équipement de protection individuelle approprié. Utilisation dans une hotte, avec soin, et jeter correctement.
3. Rincer avec du PBS comme ci-dessus. Pour l'anticorps à base de coloration, voir 3.6 ci-dessous.
4. Mont à lamelles de diapositives à l'aide Mowiol ou tout autre support de montage approprié.
5. Les diapositives d'images en utilisant un microscope confocal à fluorescence ou avec les jeux de filtres appropriés pour la GFP spectres d'excitation et d'émission. La microscopie confocale est préférée en raison de la capacité de séparer des échantillons dans le plan z. Enregistrer des images en niveaux de gris pour qudes fins de antitation au format TIF (en plus des images pleines de couleurs pour les illustrations).
6. A titre de comparaison avec WT TMEM184A exprimé par les cellules, d' autres cellules pour préparer immunofluorescence en utilisant des anticorps primaires préparées à un peptide (s) à partir de la séquence de TMEM184A, par exemple ^1. L'identification de la GFP TEMEM184A peut également être accomplie en utilisant des anticorps contre la GFP. Évaluer les deux échantillons de cellules par des techniques de microscopie identiques.

4. rhodamine-Heparin Binding et colocalisation avec des cellules GFP-TMEM184A-transfectées

1. Traiter les cellules GFP-TMEM184A exprimant avec 100 pg / mL rhodamine-héparine ajouté au milieu de culture, et permettre à des cellules à incuber pendant une période de temps spécifique, généralement moins de 10 min pour les cellules A7r5. Rincer et fixer comme dans 3.1 et 3.2.
   NOTE: Le temps optimal et la concentration de ligand dépend de la réponse des cellules, l'intensité de fluorescence du ligand et de l'image d'intensité obtenues. Ce concentration de l' héparine a été utilisée , car elle se traduit par une réponse de plus de 50% dans d' autres dosages ^11. Cette concentration peut être visualisé en utilisant des techniques de microscopie par fluorescence standard, de sorte qu'il n'a pas été nécessaire de l'augmenter. Dilution de rhodamine-héparine avec des résultats de l'héparine non marqués en fluorescence plus faible dans les cellules, est donc plus difficile à l'image et à quantifier.
2. Pour quantifier la liaison en raison de la GFP-TMEM184A transfection rhodamine-héparine, préparer des cellules identiques sans transfectées GFP-TMEM184A.
3. Imager les cellules en utilisant un microscope confocal à la GFP appropriée (488 nm) et de rhodamine (543 nm) excitation et d'émission (500-530 nm pour la GFP et supérieure à 560 nm pour la rhodamine) valeurs pour déterminer la co-localisation. Obtenir des images d'au moins 50 cellules à partir d'au moins trois expériences distinctes pour obtenir des statistiques. Maintenir des paramètres identiques dans les expériences, et d' employer un échantillon témoin (s) (par exemple, les cellules transfectées sans traitement) eà peut être utilisé pour normaliser les données pour l'analyse des expériences multiples.
4. Examiner les images à l'aide d'un programme d'ordinateur pour déterminer la liaison / absorption dans chaque cellule pour la quantification de la liaison par rapport rhodamine.
   REMARQUE: les images TIF devraient être employés comme ils sont pratiques pour l'analyse et peuvent être converties en échelle de gris dans de nombreux programmes informatiques si elles ne sont pas initialement enregistrées dans ce format. Image J (freeware) a été utilisé dans la présente analyse et permet la zone et l'intensité du pixel à mesurer pour une zone définie par l'utilisateur dans une image.
   1. Utilisez un outil à main levée pour faire le tour d'une cellule à l'intérieur d'une image fluorescente et utiliser l'outil de mesure pour déterminer l'intensité dans cet espace.
      NOTE: Ces mesures fournissent les informations nécessaires pour calculer l' intensité totale pour une zone définie par l' utilisateur (cellule entière, noyau, etc.) fournissant un moyen de comparer les différentes cellules avec des géométries différentes. Moyenne intensité sur une surface de fond peut être rapporté, et qui facilitents collection d'intensité de fond pour l'analyse.
   2. Exporter vers une feuille de calcul pour calculer l'aire multipliée par l'intensité et la soustraction de fond pour la même quantité de surface. Moyenne, la fluorescence / cellule pour les cellules assez / expérience pour obtenir une signification statistique.

5. Fluorescence Resonance Energy Transfer de GFP TMEM184A à la rhodamine Héparine

1. Préparer les cellules transfectées et incuber avec 200 pg / mL ligand de rhodamine-étiqueté comme en 3.1. A noter que le temps d'incubation avec le ligand fluorescent est le type cellulaire dépendante. Fixer avec PFA seulement, et monter des diapositives pour l'imagerie.
2. Tout d'abord, exciter à 405 nm et de l'image pour l'émission de rhodamine (566-685 nm; FRET). Deuxièmement, exciter à 488 pour la GFP (image au 493-530), et le troisième, exciter à 561 pour rhodamine (image au 566-685). Contrôles sans GFP-TMEM184A ou sans rhodamine-héparine sont critiques.

6. cellules vivantes Imaging de rhodamine-Heparin Uptake

1. Graine de la GFP-TMEM184A cellules transfectées dans des plats individuels conçus pour l'imagerie des cellules vivantes et traiter comme dans le protocole 3.
   NOTE: Le nombre de cellules nécessaires dépend du type de cellule et de la densité désirée. Afin de minimiser la quantité de temps les cellules sont en suspension, ne pas compter les cellules. cellules de semences à partir d'un plat de confluentes 100 mm en six 35 mm plats en direct d'imagerie pour obtenir des cellules proches de la confluence en 48 h.
2. Au bout de 48 heures, remplacer le milieu par du milieu de culture sans rouge de phénol.
3. Transférer une boîte de cellules à un microscope confocal à une étape de réchauffement pour maintenir la température et de focaliser le microscope.
4. Pipet 100 pg / mL rhodamine-héparine dans le plat et mélanger délicatement.
5. Immédiatement commencer l'enregistrement des images en direct. En l'absence de l'absorption cellulaire de l'héparine se produit dans la région en vue de déplacer le plat légèrement pour identifier les cellules avec au moins une vésicule contenant l'étiquette verte de la rhodamine.
   NOTE: excitation imagerie et d'émission spécifiques sont lescomme pour le protocole de l'héparine d'absorption (section 5). La période de temps entre les images était d'environ 16 s. Les conditions de l'expérience et le microscope typiquement déterminer la vitesse à laquelle les images peuvent être obtenues.

7. Isolation de la GFP-TMEM184A et GFP de cellules cultivées

1. Après avoir enlevé le milieu de culture et le rinçage avec du PBS, ajouter 2 ml de 0,2% (p / v) de CHAPS 1 x PBS avec des inhibiteurs de protéase à une plaque de 150 mm de cellules exprimant la GFP TMEM184A ou GFP (pour les essais de liaison de contrôle). Grattez les cellules de la boîte, placer la solution cellules / CHAPS dans un tube de 15 ml de polypropylène sur la glace, et bien mélanger en tapotant. Terminez toutes les étapes de la lumière pour assurer la balise GFP est blanchie pour l'essai de liaison ci-dessous.
2. Pour se lier spécifiquement GFP TMEM184A (ou un contrôle approprié de la GFP), ajouter un anticorps anti-GFP biotinylé 2 pg / ml à la solution et on incube pendant une nuit à 4 ° C avec balancement.
3. Ajouter 500 uldes billes de streptavidine-agarose à au moins 5 ml de 0,2% de CHAPS / PBS et centrifuger à environ 600 xg pendant 3 à 5 min. Retirer le surnageant. Répétez deux fois avec CHAPS frais / PBS à chaque fois. Ajouter des perles à la solution d'anticorps et de cellules et incuber pendant une nuit à 4 ° C avec une bascule pour permettre aux billes de se lier à l'anticorps anti-GFP biotinylé lié à la GFP ou GFP-TMEM184A.
4. Pellet les perles par centrifugation (comme dans 7.3) et retirer le matériau non lié. Ajouter des inhibiteurs au moins 5 ml 0,2% CHAPS / PBS / protéase à laver. Répéter le lavage et la centrifugation au moins 3x pour éliminer efficacement toute protéine non liée.
5. Après avoir retiré le dernier lavage, l'incubation des perles avec 1 ml de glycine 0,2 M / 0,2% de CHAPS dans PBS (pH à 2,0 en utilisant du HCl) sur de la glace pendant 3 minutes pour dissocier la liaison anticorps-GFP (résultant en libre-GFP TMEM184A ou sans GFP). Mélanger doucement en appuyant sur toutes les 30 s.
6. Centrifuger à environ 600 x g et transférer le surnageant contenant le p purifiérotein dans un nouveau tube de 15 ml suivie d'une neutralisation immédiate avec du bicarbonate de sodium à 5 ml de 1 M (amener le pH à 7).
7. Concentrer l'échantillon à l'aide d'une coupure de concentrateur centrifuge 10.000 Dalton poids moléculaire (utiliser la vitesse de centrifugation recommandée par le fournisseur). Lorsque le volume atteint environ 0,5 ml, ajouter 0,2% de CHAPS / PBS. Continuer à se concentrer et ajouter plus de 0,2% de CHAPS / PBS jusqu'à au moins dix volumes (fois le volume de l'échantillon de départ) de 0,2% CHAPS / PBS ont été ajoutés.
8. Afin de déterminer une estimation de la quantité de GFP isolée ou de la protéine GFP-étiquetée, obtenir une lecture d'absorbance à 280 nm et de le comparer à une courbe étalon préparée à partir de sérum-albumine bovine ou une autre protéine de contrôle dans le même tampon.
   NOTE: En raison des différences de coefficient d'extinction, cette concentration est une estimation, mais peut fournir une concentration approximative de protéines pour faciliter l'analyse sans perdre de l'échantillon. la concentration de protéines précise peut être dissuaderminées en utilisant un dosage des protéines de Lowry micro assurant pour préparer la protéine standard dans le même tampon que celui de l'échantillon. Une analyse plus poussée de la protéine isolée peut être réalisée par transfert de Western de la protéine isolée (par détection d'anticorps pour la GFP) et la comparaison avec le poids moléculaire prédit. En variante, l'utilisation des anticorps TMEM184A devrait se traduire par une bande de la taille prédite de la construction, mais il pourrait également se traduire par une bande WT TMEM184A si dimères (ou des oligomères d'ordre supérieur) sont présents dans l'échantillon. Une estimation de la pureté peut être obtenu par coloration d'un transfert pour la protéine totale dans l'échantillon isolé contre la protéine totale à partir d'une aliquote du matériau de départ.

8. in vitro Heparin Binding Assay

1. Préparer une plaque d'avidine noir à 96 puits par lavage avec 200 ul de 0,2% de CHAPS / PBS trois fois pendant 5 minutes avec agitation. Préparer une plaque non revêtu de 96 puits noir identiques utilisant le même procédé de lavage. Préparer unmise en page pour les échantillons expérimentaux (en triple exemplaire) à suivre au cours de l'essai. Inclure des puits pour des concentrations standard d'héparine, le contrôle des tampons, et des puits avec des échantillons de GFP sans héparine pour confirmer le blanchiment de la GFP.
   NOTE: Si l'isolement ou les interactions ligand tampons optimisés sont différentes pour la protéine en question, faire toutes les préparations de la plaque et laver avec le système tampon optimal.
2. Ajouter 100 ul de 60 pmol / puits anticorps biotinylé anti-GFP dans tous les puits de la plaque revêtue d'avidine, où la liaison est désirée GFP. La quantité d'anticorps est suffisante pour saturer tout l'avidine à haute affinité dans les puits.
   1. Ajouter tampon seulement à tous les puits utilisés à des fins de contrôle (pas GFP ou GFP-TMEM184A de liaison souhaitée). Sceller les puits avec un couvercle de la plaque pour empêcher l'évaporation. Incuber pendant 2 heures à température ambiante, sous agitation.
      NOTE: Les volumes ajoutés à des puits et des temps d'incubation sont basées sur les recommandations du fournisseur.
3. Laver tous les puits trois foispendant 5 minutes avec 200 ul de 0,2% de CHAPS / PBS.
4. Ajouter 100 pi de 5 nmol / puits GFP-TMEM184A ou GFP dans les puits appropriés de la plaque de avidine revêtue et incuber pendant 1 h à température ambiante sous agitation. Laver à nouveau comme dans 8.3.
   Remarque: Cette concentration de la protéine a été choisie pour assurer que tous les sites ont été saturés avec un excès GFP ou GFP TMEM184A. Il est important de veiller à ce que la même quantité de protéine est liée à chaque puits. Des quantités plus faibles de protéines peuvent également saturer les sites, une possibilité qui pourrait être examinée en évaluant la protéine non liée restant après incubation de plusieurs concentrations de protéines avec la plaque et en comparant la protéine non liée et des essais de liaison de ligand.
5. Préparer diverses concentrations d'héparine marquée à la fluorescéine, par exemple, 10, 25, 50, 75, 100, 200 pg / ml, de 0,2% de CHAPS / PBS. Pour ce faire, et tout le travail restant dans l'obscurité.
   NOTE: Avant de préparer les concentrations, les concentrations spécifiques pour d'autres ligands doivent être déterminées pour le protein cible en question. La concentration la plus faible doit être détectable dans le lecteur de plaque. Par conséquent, il est important de déterminer d'abord la plage qui peut être détectée avec précision dans le système de tampon utilisé. Ensuite, déterminer la gamme nécessaire pour obtenir mesurable de liaison. Les concentrations de fluorescéine héparine inférieure à 10 pg / ml n'a pas enregistré de manière cohérente dans le lecteur de plaque dans les conditions tampons utilisées. De même, si la rhodamine héparine tel que celui utilisé dans les autres essais, peut être visualisé dans le lecteur de plaque, dans les conditions de tampon et aux concentrations nécessaires pour la liaison, les lectures de fluorescence pour les normes ne sont pas reproductibles différent à celui fluorophore.
6. Ajouter 100 pi de fluorescéine-héparine à des puits d'essai appropriées dans les plaques standard et de concentration des puits revêtues d'avidine à la fois dans la plaque non-revêtu avidine revêtu et. Incuber pendant 10 min à température ambiante sous agitation. Gardez les plaques dans l'obscurité (ou une feuille couverte).
7. L'utilisation d'une plaque reader, enregistrer l'émission de fluorescence initiale de l'héparine dans les puits de contrôle des deux plaques et la fluorescence initiale d'émission (au total) de puits avec immobilisée GFP GFP TMEM184A ou dans la plaque d'avidine. Si nécessaire, ajuster le gain de l'instrument pour assurer la détection de l'héparine fluorescente entre les concentrations les plus élevées le plus bas et.
   REMARQUE: Assurez-vous que le lecteur de plaque lit puits d'en haut et se lit à l'emplacement optimal dans les puits si cela est réglable. Pour l'étude en question, l'emplacement optimal est d'environ 75% par les puits. Information disponible avec le lecteur de plaque doit fournir des suggestions qui sont uniques au lecteur de plaque en question pour la lecture des analyses de l'échantillon lié dans des plaques noires.
8. Retirer l'héparine fluorescent non lié de puits avec immobilisée GFP-TMEM184A ou GFP et la placer dans les puits correspondants de la plaque non-enduit noir. Immédiatement lire l'émission de fluorescence.
9. Ajouter 100 pi frais 0,2% CHAPS / PBS retour into puits à partir duquel l'héparine fluorescéine a été éliminé, et lire une émission de fluorescence.
10. Répétez les étapes 08.08 à 08.09 3x.
    NOTE: Ces lectures de la plaque revêtue indiquent l'héparine fluorescéine restant dans les GFP ou la GFP-TMEM184A puits. Si la fluorescence importante se trouve dans le troisième échantillon non lié, un lavage supplémentaire devrait se produire. Si la fluorescence continue à être retiré dans chaque lavage, la liaison de ligand pourrait être faible affinité, et les conditions devraient être réévalués. La lecture finale constitue la lecture de l'héparine liée.
11. Enregistrer une émission de fluorescence des désinstallés, non consolidés, des échantillons de la plaque non revêtu, l'obtention des numéros pour chaque lavage. Ce sont les lectures "non liés".
12. Utilisez la valeur totale de l'héparine d'émission obtenus dans 8,7 pour confirmer les niveaux corrects de l'héparine ajoutée à chaque puits. Soustraire fond lectures moyennes des valeurs.
    NOTE: Wells sans fluorescéine-héparine servir comme fond due à l'anticorps, la GFP et de tampon. Etalemente le fond répète pour obtenir la valeur d'arrière-plan. fond Soustraire lectures moyennes des lectures liés et non liés pour obtenir des valeurs réelles.
13. Employez un terrain d'émission par rapport à la fluorescéine-héparine ajoutée totale pour déterminer l'ampleur des émissions par rapport à quantité d'héparine.
    REMARQUE: seul anticorps, ou l'anticorps et l'antigène ont donné lieu à une certaine extinction de la fluorescence. Par conséquent, l'héparine total a été déterminé en fonction de l'héparine ajoutée totale comme indiqué dans 8.7.
14. Tracer l'héparine liée corrigée par rapport à l'héparine ajoutée pour les triplicats tant dans le cas GFP-TMEM184A et le cas de la GFP.
15. Déterminer le ligand libre en ajoutant les lectures non consolidées de tous les lavages pour une concentration spécifique.

Résultats

Bien qu'en théorie, la transfection d'une construction d' ADN dans des cellules peut être réalisée avec des réactifs de transfection lipophiles, les rapports précédents indiquent une transfection plus efficace de la GFP dans les cellules endothéliales construit en utilisant une électroporation ^12. Le protocole fourni ici typiquement obtenu GFP dans la construction d'expression supérieure à 80% des cellules endothéliales primaires et dérivées des ce...

Discussion

Les protocoles présentés ici ont été conçus pour fournir une preuve de confirmation pour l'identification de TMEM184A en tant que récepteur de l' héparine dans des cellules vasculaires ^1. techniques Knockdown sont couramment utilisés comme un mécanisme permettant de confirmer l'identification de nouvelles protéines. Cependant, une certaine perte fonctionnelle après l'effet de choc est en général pas suffisamment de preuves qu'une protéine candidate est en fait le récepteur app...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
GFP-TMEM184A construct	OriGene	RG213192
Rhodamine-Héparine	Creative PEGWorks	HP-204	Sensible à la lumière
Fluorescéine-Héparine	Creative PEGWorks	HP-201
Mowiol	EMD Sensible à la Lumière Millipore	475904-100GM
Paraformaldéhyde (PFA, sans méthanol)	Thermo Sci Pierce Biotech, disponible auprès de Fisher Scientific	PI28908 chez Fisher	Utilisation dans les
plaques de neutravidine Reacti-bind de hotte (boîtes noires à 96 puits recouvertes d’Avidin)	Thermo Sci Pierce Biotech, par l’intermédiaire de Fisher Scientific	PI15510 chez Fisher	Faites attention à la durée de conservation
des plaques noires à 96 puits	Corning Life Sciences Plastic, achetée auprès de Fisher Scientific	064432 chez Fisher
A7r5 Cellule musculaire lisse vasculaire ligne	ATCC	CRL 1444	Peut être échangé en MEM medium1
BAOEC cellules endothéliales aortiques bovines	Cell Applications, Inc.	B304-05	La culture, telle que recommandée initialement, peut être remplacée dans un milieu MEM pour la poursuite de la culture1,7
BAOSMC Cellules musculaires lisses de l’aorte bovine	Cell Applications, Inc.	B354-05	La culture telle que recommandée initialement, peut être remplacée dans un milieu MEM pour la poursuite de la culture1
RAOEC cellules endothéliales aortiques de rat	Cell Applications, Inc.	R304-05a	La culture, telle que recommandée initialement, peut être remplacée dans un milieu MEM pour une culture continue7
Biotinylated anti-GFP	Thermo Sci Pierce Biotech, par l’intermédiaire de Fisher Scientific	MA5-15256-BTIN
Billes recouvertes de streptavidine	Sigma	S1638
HeBS	Disponible chez Bio-Rad		Peut être préparée en laboratoire. Le pH est de 6,8
TMEM184A anticorps contre l’anticorps N-terminal	Santa Cruz Biotechnology	sc292006	Seul connu TMEM184A anticorps contre la région N-terminale.
TMEM184A anticorps dirigés contre l’extrémité C-terminale	obtenu auprès de ProSci Inc, Poway, CA  ;	Pro Sci 5681	ProSci utilisé dans les anticorps Figure 1
GFP	Santa Cruz Biotechnology	sc9996	Utilisé dans les anticorps Figure 5
Secondaires, marqués avec TRITC ou Cy3	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA	711 025 152 (anti-âne anti-lapin, TRITC) 715 165 150 (âne anti-souris, Cy3)	Réactivité croisée minimale pour minimiser toute coloration non spécifique.
CHAPS	Acheté chez Sigma	C5849	Notez que ce numéro de catalogue spécifique n’a plus été fabriqué.  ; Le fournisseur fournira des informations concernant le remplacement.
Imagerie en direct Boîtes de 35 mm	MatTek (Ashland MA)	P35G-1.0 &ndash ; 20 mm - C
Microscope confocal	Zeiss	LSM 510 Meta avec un objectif à immersion dans l’huile 63X	Utilisé pour les images et l’imagerie en direct dans les Figures 1, 2 et 3
Microscope confocal	Nikon	C2+ confocal avec un objectif à immersion dans l’huile 60X	Utilisé pour les images en Figure 5
Microscope confocal	Zeiss Zeiss	LSM 880 avec un objectif à immersion dans l’huile 63X	Utilisé pour les images en Figure 2C
Electroporation Equipment	Bio-Rad	Gene Pulser X-Cell System
Cuvettes d’électroporation	Disponible auprès de MidSci	EC2L	Peut également être obtenu auprès du fournisseur d’équipement
Lecteur de plaques	TECAN	TECAN Infinite® ; m200 Pro Lecture	au milieu des puits plutôt qu’à la surface.
Programme d’ordinateur pour la mesure de l’intensité de la coloration	Image J	https://imagej.nih.gov/ij/ Programme et information disponibles en ligne	Tout programme approprié peut être utilisé. Voir https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html pour plus de détails.   ;
Culture cellulaire trypsine solution	Sigma	T4174	achetée en solution 10x