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Article de méthode

Un système de détection de tumeur modèle et tumeur murine Orthotopique vessie

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DOI :

10.3791/55078

⸱

12 janvier 2017

 ,  , 
1Department of Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, National University Health System, 2Department of Urology, National University Hospital

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la génération de tumeurs de la vessie orthotopique de souris femelles de souris C57BL / 6J et le contrôle de la croissance tumorale.

Résumé

Ce protocole décrit la génération de tumeurs de la vessie chez des souris C57BL / 6J femelles en utilisant la lignée cellulaire de cancer de la vessie murin MB49, qui a été modifiée pour secréter de la prostate humain de l'antigène spécifique (PSA) et la procédure pour la confirmation d'implantation de la tumeur. En bref, les souris sont anesthésiés à l'aide de drogues injectables et sont faits pour mettre en position dorsale. L'urine est libérée de la vessie et de 50 pi de poly-L-lysine (PLL) est lentement instillée à un débit de 10 pl / 20 s en utilisant un cathéter 24 G IV. Il est laissé dans la vessie pendant 20 minutes en bouchant le cathéter. Le cathéter est retiré et PLL est libéré par une légère pression sur la vessie. Ceci est suivi par l' instillation de la lignée cellulaire de cancer de la vessie de souris (1 x 10 5 cellules / 50 ul) à un débit de 10 pl / 20 s. Le cathéter est bouché pour empêcher l'évacuation prématurée. Après 1 h, les souris sont ravivées avec un médicament d'inversion, et la vessie est annulée. Le taux d'instillation lente est important,car il réduit reflux vésico-urétéral, ce qui peut provoquer des tumeurs de se produire dans les voies urinaires supérieures et dans les reins. La lignée cellulaire doit être bien remis en suspension pour réduire l'agglutination des cellules, car cela peut conduire à des tailles de tumeur inégale après l'implantation.

Cette technique induit des tumeurs avec une grande efficacité. La croissance des tumeurs est contrôlée par la sécrétion urinaire de PSA. la surveillance du marqueur PSA est plus fiable que les ultrasons ou l'imagerie par fluorescence pour la détection de la présence de tumeurs de la vessie. Tumeurs chez les souris atteignent généralement une taille maximale ayant un impact négatif sur la santé d'environ 3 - 4 semaines, si non traitée. En surveillant l'évolution de la tumeur, il est possible de différencier les souris qui ont été guéris de ceux qui ne sont pas implantés avec succès des tumeurs. Avec seulement une analyse du point final, ce dernier peut être à tort, supposé avoir été guéri par thérapie.

Introduction

Le but de cette méthode est de générer des tumeurs de la vessie murin orthotopique et de suivre les tumeurs implantées aussi précisément que possible, de sorte que les souris sans implantation de la tumeur ne sont pas pensé pour avoir été durcie à l'analyse du point final. Dans l'ensemble, la méthode indiquée réduira la nécessité d'un grand nombre de souris pour l'analyse expérimentale et assurer une plus grande précision dans la détermination des résultats thérapeutiques.

Le développement d'un modèle orthotopique de cancer est important, car les cellules tumorales implantation sous-cutanée ne récapitulent pas l'environnement de la maladie clinique ou permettent le développement de stratégies thérapeutiques. L'architecture de la vessie permet à l'instillation de thérapies contre le cancer de la vessie directement dans la vessie avec des effets systémiques minimales. Ainsi, les modèles animaux qui récapitulent cet environnement, comme un modèle orthotopique, sont importantes pour évaluer de nouvelles thérapies. Les conclusions tirées de tout dispositif expérimental sont dependent sur les limites du modèle.

Plusieurs techniques ont été mises au point pour la production de tumeurs de la vessie orthotopique chez la souris. Ceux-ci se fondent sur d'endommager la couche de glycosaminoglycanes de la vessie, permettant aux cellules tumorales à implanter. Les techniques utilisées comprennent électrocoagulation, qui se traduit par un point de dégâts dans la paroi de la vessie unique, conduisant au développement de la tumeur sur un site dans la vessie 1,2. Cependant, le taux d'implantation de la tumeur à l'aide électrocoagulation de réussite est dépendante de l'opérateur variant de 10 - 90% et comprend le danger que la paroi de la vessie est percé, ce qui conduit à développer des tumeurs dans la cavité péritonéale. Cautérisation chimique est effectuée en utilisant du nitrate d' argent, ce qui endommage la paroi de la vessie 3. De même, l' acide a été utilisé pour endommager la paroi de la vessie 4. Trypsine a également été utilisé pour endommager la vessie et 5. Ces procédés peuvent entraîner l'apparition de plus d'une tumeur de la vessie.En outre, il existe un risque de dommages importants à la vessie si les produits chimiques sont laissés en contact avec la paroi de la vessie pendant trop longtemps. La méthode développée par Ninalga et al. utilise la poly-L-lysine chargée positivement (PLL) 6 molécules à recouvrir la paroi de la vessie; ce qui permet les cellules tumorales chargées négativement à coller à la couche de glycosaminoglycanes de la vessie. Ce procédé conduit généralement à plus d'une tumeur en développement dans la vessie, mais l' implantation des tumeurs est à 80 - 100% 4,7. Techniquement, il est aussi la procédure la plus simple à réaliser. Pour garantir que les tumeurs qui se développent sont assez même taille, il est important que les cellules tumorales ne sont pas regroupés dans les grandes touffes avant l'implantation.

Afin d'évaluer l'efficacité thérapeutique, il est préférable d'effectuer cette étude sur des souris avec des tumeurs assez de taille similaire. Ainsi, un système de détection qui permet de quantifier la bonne taille de la tumeur rapidement après l'implantation est importante. Plusieurs stratégies ont abeillen utilisé pour évaluer les tumeurs. Ceux - ci comprennent l' imagerie par résonance magnétique (IRM) 8-10, la fluorescence 11, bioluminescence 12,13, ultrasons 14, et le dosage immuno-enzymatique (ELISA) 15,16. Tandis que l'IRM et les ultrasons ne nécessitent pas de modifications des cellules tumorales, il existe un besoin d'un équipement et d'agents de contraste pour l'IRM sensibles. Les dosages par fluorescence, luminescence- et à base d'ELISA nécessitent une modification des cellules tumorales pour exprimer des protéines marqueurs qui peuvent être détectés par ces méthodes. Pour la fluorescence, un substrat est nécessaire pour la détection de l'activité de la luciférase; ainsi, il y a une étape supplémentaire et une augmentation des coûts. Les deux luminescence et fluorescence nécessitent un équipement spécialisé. Pour produire la fluorescence, la protéine fluorescente verte (GFP) de cyclisation qui est catalysée par l'oxygène moléculaire, est nécessaire. Ainsi, l'expression de la GFP peut être variable au sein d'une masse tumorale en fonction de l'accès à l'oxygène, ce qui en fait un marqueur peu fiable 17. Modification de la lignée de cellules de cancer de la vessie murin MB49 à sécréter de la prostate humaine Specific Antigen (PSA) 15,16 comme un marqueur de substitution est une autre stratégie. Ces marqueurs fournissent également un autre moyen de confirmer la présence d'une tumeur à la fin de l'expérience, ce qui les rend une alternative à immunohistochimie. Cette étude rapporte le procédé PLL implantation de la tumeur orthotopique et présente une comparaison des systèmes de détection d'une tumeur, à savoir la méthode ELISA, la fluorescence, l'imagerie par ultrasons.

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Protocole

Tous les travaux des animaux adhéré aux directives du Comité des soins et l'utilisation des animaux institutionnels (IACUC) sur l'utilisation des animaux et de manutention (numéro de protocole 084/12) à l'Université nationale de Singapour.

1. Croissance des cellules MB49-PSA in vitro et de mesure PSA Sécrétion

  1. Maintenir murine cancer de la vessie cellules MB49-PSA 15 dans complet du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 2 mmol / L de L-glutamine et 0,05 mg / mL de pénicilline-streptomycine dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. Ajouter 200 pg / ml d'hygromycine B pour maintenir la pression de cellules sécrétrices de PSA sélection.
  2. Pour déterminer la sécrétion de PSA, la plaque 1 x 10 6 cellules dans une plaque de culture à 6 puits et incuber à 37 ° C en présence de 5% de CO2 pendant 48 heures.
  3. Deux jours plus tard, de recueillir le surnageant pour la mesure du PSA.
    1. En utilisant une pipette Pasteur, transférer le supernatant à un tube de 15 ml de la centrifugeuse.
    2. Centrifuger pendant 5 min à 250 xg pour éliminer les cellules flottantes et les débris. Si le dosage du PSA est effectué sur un autre jour, stocker le surnageant à - 30 ° C dans un microtube de 1,5 ml. Sinon, passez à l'étape suivante immédiatement.
    3. Déterminer la concentration de PSA en utilisant un PSA libre humain ELISA kit 7.
  4. Énumérer les cellules étalées.
    1. En utilisant une pipette Pasteur, laver les cellules doucement avec 1 ml de DMEM. Aspirer et complètement supprimer les médias.
    2. Ajouter 1 mL de milieu frais et gratter doucement avec un racleur de cellules pour déloger les cellules du puits.
    3. Transférer les cellules dans un tube de microcentrifugation et remettre en suspension les soigneusement pour assurer une suspension à cellule unique.
    4. Mélanger des volumes égaux de la suspension cellulaire et une solution de bleu trypan à 0,4%. Compter les cellules vivantes (qui ne prennent pas le colorant) à l'aide d'un hémocytomètre.
  5. Calculer l'expression de PSA en ngde PSA / ml de milieu / 10 6 cellules. L'expression de PSA de cellules MB49-PSA pour l' implantation chez la souris est 80-120 ng / mL / 10 6 cellules.

2. Détermination de la sensibilité des mesures de PSA par ELISA et analyse PCR en temps réel

  1. Plate cellules MB49-PSA dans un milieu complet DMEM dans une plaque de culture à 6 puits avec différentes quantités de cellules MB49 parentales telles qu'il ya un maximum de 1 x 10 6 cellules par puits (ie, 10 0, 10 1, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5 ou 10 6 cellules MB49-PSA sont mis en culture avec 10 6, 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1, 0 ou 10 cellules MB49, respectivement).
  2. Un jour plus tard, recueillir le surnageant pour la mesure du PSA, comme décrit dans l'étape 1.3. Déterminer la concentration de PSA en utilisant un PSA libre humain ELISA kit 7.
  3. Extraire l'ARN à partir des cellules.
    1. lyser lecellules directement dans la plaque en ajoutant 1 ml de réactif d'extraction d'ARN.
    2. Incuber pendant 5 min à température ambiante et à transférer le lysat cellulaire dans un tube de microcentrifugation. Ajouter 0,2 mL de chloroforme et vortex les échantillons vigoureusement pendant 15 s. Incuber pendant 3 minutes à la température ambiante.
    3. Centrifuger les échantillons à 12000 xg pendant 15 min à 4 ° C. transférer avec précaution la phase aqueuse supérieure (0,5 ml) dans un nouveau tube sans déranger l'interphase.
    4. Ajouter 0,5 ml d'alcool isopropylique. Incuber pendant 10 min à température ambiante. Centrifuger les échantillons à 12000 xg pendant 10 min à 4 ° C. Enlever le surnageant complètement, sans perturber le précipité d'ARN au niveau du fond du tube.
    5. Laver le culot une fois avec 1 ml d'éthanol à 75%. Centrifuger à 7500 xg pendant 5 min à 4 ° C. Retirez tout l'éthanol et laisser le culot sécher à l'air pendant 10 minutes.
    6. Dissoudre l'ARN dans 30 ul d'eau sans nucléase. Incuber pendant 5 min à 60 ° C pour augmenter la sortelubility.
    7. Quantifier l'ARN en mesurant l'absorbance en utilisant la lumière ultraviolette (UV), la spectroscopie à 260 nm (A260). Pour évaluer la pureté de l'ARN, mesurer l'absorbance à 280 nm (A280) et calculer le rapport A260 / A280 qui devrait être supérieur à 1,6.
  4. Reverse-transcription d'ADNc de 2 pg d'ARN.
    1. Préparer le mélange réactionnel sur de la glace et de le transférer dans des tubes de 0,2 ml.
    2. Centrifuger brièvement les tubes à centrifuger le contenu et d'éliminer les bulles d'air.
    3. Charger les tubes dans le cycleur thermique et effectuer la transcription inverse dans les conditions suivantes: 60 min à 37 ° C, puis 5 min à 95 ° C. Une fois la course terminée, conserver les échantillons d'ADNc à 4 ° C.
    4. Conserver les échantillons à - 30 ° C pour le stockage à long terme.
  5. Effectuer une analyse PCR en temps réel pour PSA et cytoplasmique beta actine. actine beta est utilisé pour normaliser les échantillons. Effectuer le test sur 100 ng d'ARN de transcription inverse dans un pla 96 puitste. Doser tous les échantillons en triple. Effectuer 40 cycles avec les paramètres suivants: 2 min à 50 ° C, 10 min à 95 ° C, 15 s à 95 ° C pour la dénaturation et 1 minute à 60 ° C. Réglez la limite inférieure de détection à un seuil de cycle (CT) de 35; Ainsi, tout échantillon ayant une valeur au-delà de CT 35 est considéré comme non détectable.

3. Le maintien de la tumorigénicité de MB49-PSA Cell Line

NOTE: L'exposition prolongée croissance in vitro conduit à une perte de tumorigénicité. Pour maintenir tumorigénicité, la lignée cellulaire MB49-PSA est repiqué par le biais de la souris au moins une fois tous les 2 ans.

  1. Cellules.
    1. La récolte des cellules à croissance exponentielle, en les grattant doucement avec un racleur de cellules stérile. Mélanger des volumes égaux de la suspension cellulaire et une solution de bleu trypan à 0,4%. Compter les cellules vivantes en utilisant un hémocytomètre. Ne pas implanter si plus de 20% des cellules sont mortes.
    2. Calculer la quantité de cellules vivantes requis (1 x 107 cellules / ml) et de les transférer à un tube de 15 ml centrifugeuse. Centrifuger à 250 g pendant 5 min à 4 ° C et jeter le surnageant. Re-suspendre le culot cellulaire dans DMEM supports vierges. Répétez le lavage trois fois pour éliminer toute trace de FBS avant l'implantation.
    3. Maintenir la suspension de cellules sur de la glace jusqu'à ce que les souris soient prêts pour l'implantation.
  2. Implanter des cellules tumorales par voie sous cutanée chez la souris sur le flanc dorsal.
    1. Anesthésier un 4 à 6 semaines d'âge souris C57BL6 / J à l'aide d'un mélange d'anesthésiques kétamine et de médétomidine (75 mg / kg et 1 mg / kg, respectivement), injectée par voie intrapéritonéale à 0,1 ml par 10 g de poids corporel.
    2. Rasez le flanc droit d'exposer la peau.
    3. En utilisant une paire de pinces, soulever la peau pour le séparer du muscle sous - jacent et injecter 0,1 ml de la suspension de cellules (1 x 10 6 cellules) par voie sous- cutanée avec une aiguille 24 G. Lors du retrait de l'aiguille, pincer le site d'injection pendant 5 à 10 s de telle sorte que les cellules tumorales nepas de fuite hors du site d'injection.
    4. Revive la souris avec une injection sous-cutanée de atipamézole (1 mg / kg) à 0,1 ml par 10 g de poids corporel.
  3. Surveiller la croissance de la tumeur tous les deux jours en mesurant le diamètre de la tumeur en utilisant des étriers. Le volume tumoral est calculé en utilisant la formule v = (ab 2) / 2, où "a" est la dimension la plus longue et "b" est la largeur perpendiculaire, à la fois en mm.
  4. Lorsque le volume de la tumeur est d' au moins 50 mm 3 (environ 7 jours), euthanize la souris avec du CO 2. Exciser la masse tumorale avec une paire de pinces et ciseaux stériles dans des conditions aseptiques et dans DMEM.
  5. Dans une plaque de culture à 6 puits, émincer la tumeur en petits morceaux à l'aide de scalpels stériles. Utilisez un piston de seringue mL 1 comme un «pilon» pour désagréger davantage la tumeur.
  6. Ajouter 3 ml de DMEM complet et maintenir les cellules dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2.
  7. Une fois que les cellules adhèrent à la plate-e (entre un et deux jours), retirez le support, les débris et les cellules non-adhérentes en aspirant doucement avec une pipette Pasteur stérile. Laver deux fois avec DMEM. Prenez soin de ne pas perturber les cellules.
  8. Ajouter 1 ml de DMEM et récolter les cellules en les grattant avec un racleur de cellules. Pour sélectionner et développer des colonies isolées, compter les cellules en utilisant un hémocytomètre et la plaque 1 cellule par puits dans une plaque de culture à 96 puits. Des cellules de culture dans du DMEM avec 200 pg / ml d' hygromycine B à 37 ° C et 5% de CO 2.
  9. Changer les médias et l'antibiotique tous les 4 - 5 jours. Surveiller les cellules jusqu'à ce qu'ils soient à environ 80-90% confluentes. Re-plaque des cellules sur une 24 plaque de culture par pipetage pour déloger les cellules du puits.
  10. Une fois que les cellules dans la plaque de culture 24 puits sont confluentes, les déloger en grattant avec un grattoir à cellules et la plaque eux dans une plaque de culture 6 puits.
  11. Cribler les clones différents pour PSA sécrétion, comme décrit dans l'étape 1. cryo-préservation du clone avec le secret de PSA plus haution et l'utiliser pour des expériences de souris futures.

4. Implanter la tumeur

NOTE: Chaque souris est implanté avec 1 x 10 5 cellules MB49-PSA dans 50 pl de DMEM supports vierges dans la vessie. En raison de l'espace mort dans le cathéter, toujours préparer un volume supplémentaire (au moins 100 pi supplémentaires par souris). Une approche alternative serait d'utiliser une seringue remplie d'air tel que décrit par Kasman et al. 5 plutôt que d' une seringue remplie.

  1. Cellules.
    1. Un jour avant l'implantation, lorsque les cellules sont d'environ 80% de confluence, le passage des cellules tumorales MB49-PSA dans un milieu complet DMEM (supplémenté avec 10% de SVF, 2 mmol / L de L-glutamine, 0,05 mg / mL de pénicilline-streptomycine et 200 pg / ml d' hygromycine B) à 37 ° C et 5% de CO 2 à un rapport de division de 1: 2.
    2. Le jour de la procédure, la récolte des cellules en les grattant doucement avec un racleur de cellules stérile. Mélanger des volumes égaux de la suspension cellulaire et0,4% trypan solution bleue. Compter les cellules vivantes en utilisant un hémocytomètre. Ne pas implanter si plus de 20% des cellules sont mortes.
    3. Calculer la quantité de cellules vivantes requis (2 x 10 6 cellules / ml) et de les transférer dans un tube de 15 ml de la centrifugeuse. Centrifuger à 250 g pendant 5 min à 4 ° C et jeter le surnageant. Re-suspendre le culot cellulaire dans DMEM supports vierges. Répétez le lavage trois fois pour éliminer toute trace de FBS avant l'implantation.
    4. Maintenir la suspension de cellules sur de la glace jusqu'à ce que les souris soient prêts pour l'implantation.
  2. Laisser le 4 à 6 semaines vieille femelle C57BL / 6J à acclimater pendant une semaine avant la procédure. Tous les travaux des animaux doit être effectué dans une enceinte de sécurité biologique pour maintenir des conditions stériles.
    1. Peser chaque souris et injecter l'anesthésie (75 mg / kg de kétamine et 1 mg / kg médétomidine) par voie intrapéritonéale à 0,1 ml par 10 g de poids corporel. Poids corporel doit être comprise entre 17 et 22 g. Confirmer anesthetization en observant pas response après une pincée d'orteil.
    2. Pour l'identification, marquer l'oreille à l'aide d'un poinçon de l'oreille.
    3. Injecter une solution ou un composé de sodium lactate de Hartmann par voie intrapéritonéale à 0,1 ml par 10 g de poids corporel toutes les 1 - 2 h pour hydratation.
    4. Appliquer une pommade ophtalmique stérile pour les deux yeux à l'aide d'une ampoule de coton stérile, car le réflexe de clignement est perdue sous anesthésie et les yeux sécher. Renouveler si nécessaire.
    5. Poser la souris en position couchée sur des serviettes en papier sur le dessus d'un paquet de chaleur (activé par contact avec l'air) pour maintenir la température du corps et du ruban adhésif les pattes arrière vers le bas.
  3. Avec un doigt, appliquer une légère pression à la région abdominale inférieure et recueillir l'urine de la vessie dans un tube à centrifuger de 1,5 ml. Cet échantillon sert de la valeur basale de PSA urinaire.
  4. Retirer stérile poly-L-lysine (PLL) dans une seringue de 1 ml et fixer un 24 calibre de cathéter intraveineux, avec le stylet à aiguille retirée. Appliquer du lubrifiant sur la pointe du cathéter et insert le cathéter à travers l'urètre dans la vessie en utilisant une pince pour guider le cathétérisme. Arrêtez-vous lorsque la résistance se fait sentir. NOTE: Les chercheurs devraient discuter avec leur personnel vétérinaire sur la nécessité de l'utilisation d'un gel lubrifiant avec un anesthésique pour instillations intravésicale et l'utilisation de post-procédure analgésiques.
  5. Instiller 50 pi de PLL lentement, à une vitesse de 10 pi toutes les 20 s, pour éviter reflux vésico-urétéral 18. Laisser le cathéter dans la vessie pendant 20 minutes avec un bouchon pour empêcher l'écoulement hors.
  6. Au bout de 20 min, retirer le cathéter et évacuer la vessie de tout contenu en appuyant doucement sur la région abdominale inférieure. L'utilisation d'un vide seringue de 1 ml, rincer tout contenu restant hors du cathéter.
  7. Mélanger les cellules MB49-PSA soigneusement par pipetage et les retirer dans une seringue de 1 ml. Fixer le cathéter et appliquer du lubrifiant. Instiller 50 pi de 1 x 10 5 cellules à un rythme lent de 10 ul toutes les 20 s. Remplacer le bouchon surle cathéter. Donner des souris de contrôle 50 pi de solution saline.
  8. Après 1 h, retirer les cathéters et évacuer la vessie de tout contenu. Retirez le ruban adhésif sur les pattes de derrière et placer la souris sur leurs côtés ventraux. Revive les souris par voie sous-cutanée par injection du médicament d'inversion (1 mg / kg atipamézole) à 0,1 ml par 10 g de poids corporel.
  9. Surveiller la souris jusqu'à ce que la motilité est observée. Remettre les souris dans leurs cages.
  10. A l'issue d'un protocole de détection de tumeurs (sections 5, 7 ou 8), euthanize les souris en utilisant du CO 2. la détection des tumeurs post-mortem est décrite dans la section 6.

5. Suivi croissance tumorale avec ELISA

REMARQUE: La présence et la croissance tumorale chez des souris est surveillée en mesurant la sécrétion de PSA dans l'urine. Les chercheurs devraient consulter leur personnel vétérinaire sur le suivi de la santé animale et le bien-être après l'implantation de la tumeur et les points limites.

  1. Il existe deux méthodes pour recueillir l'urine de souris.
    1. Recueillir l'urine pendant la nuit en plaçant une seule souris dans une cage métabolique individuel conçu pour séparer l'urine des matières fécales. Si la mise en place n'a pas de réfrigération, ajouter un inhibiteur de protéase (100 ul) dans le tube de prélèvement d'urine pour empêcher la dégradation de PSA durant la nuit. Cependant, le nombre de cages métaboliques disponibles limite l'utilité de cette méthode de collecte d'urine.
    2. Où il est logistiquement impossible d'utiliser des cages métaboliques (comme dans les salles de ABSL2), recueillir l'urine tache à l'aide d'un doigt pour exercer une légère pression sur la région abdominale inférieure, tandis que les souris sont anesthésiées comme décrit à l'étape 4.2.1. Cela se fait habituellement avant la thérapie est inculquée. D'après notre expérience, au moins 150 pi d'urine peut être collectée 1 h après l'anesthésie.
  2. Immédiatement placer l'urine recueillie sur la glace. Hématurie peut être visible à partir de la deuxième semaine après l'implantation de la tumeur. Les échantillons fortement hémolysés peuvent affecter l'analyse ELISA. Par conséquent, l'urinedoit être placé sur la glace et traitée rapidement après la collecte.
  3. Centrifuger les tubes d'urine à 6700 xg pendant 5 min à 4 ° C pour éliminer les cellules ou les débris.
  4. Pour normaliser la différence de la production d'urine entre les souris, aliquote l'urine dans de nouveaux tubes et de les stocker à -30 ° C jusqu'à ce que l' exécution des analyses pour PSA en utilisant un kit ELISA 7 et de la créatinine en utilisant un kit de dosage 7. Même si les souris ne produisent pas de PSA, il existe un faible niveau de liaison non spécifique détectée en utilisant la méthode ELISA. Pour les échantillons à être considérés comme positifs, le seuil doit être fixé à des valeurs supérieures à la normale chez les souris + 3 écarts type (SD) 15.

6. Détection de présence de la tumeur avec la PCR en temps réel

  1. A la fin, disséquer la cavité abdominale de la souris et de localiser la vessie. Exciser la vessie et le placer dans un cryovial. Congeler immédiatement dans de l'azote liquide.
  2. Extraire l'ARN en homogénéisant les tissus dans un extr d'ARNréactif d'action.
  3. Effectuer une analyse de transcription inverse et de PCR en temps réel pour PSA, comme décrit ci-dessus dans la section 2.

7. Suivi croissance tumorale avec Imaging Fluorescence

  1. Étiquette 1 x 10 7 cellules MB49-PSA avec un colorant fluorescent proche infrarouge 19.
  2. Re-plaque et récolter les cellules marquées sur les jours 4, 7, 11, 14, 18, et 21 pour vérifier si les cellules conservent la viabilité et la fluorescence par cytométrie en flux 20.
  3. Implanter les cellules MB49-PSA marquées dans des vessies de souris, comme décrit ci-dessus dans la section 4.
  4. Surveiller la croissance de la tumeur en utilisant un système d'imagerie par fluorescence tous les deux jours.
  5. Le jour de l'imagerie, peser et anesthésier les souris en utilisant un mélange d'anesthésiques kétamine et de médétomidine (75 mg / kg et 1 mg / kg, respectivement), injectée par voie intrapéritonéale à 0,1 ml par 10 g de poids corporel.
  6. Rasez la zone abdominale pour exposer la peau.
  7. Placer la souris dans la chambre d'imagerie et d'acquérirles images des vessies en utilisant le logiciel fourni avec le système d'imagerie.
  8. Revive les souris par voie sous-cutanée par injection d'un médicament d'inversion (1 mg / kg atipamézole) à 0,1 ml par 10 g de poids corporel.

8. Suivi croissance tumorale avec haute fréquence d'imagerie par ultrasons

  1. tumeurs implants chez la souris, comme décrit ci-dessus dans la section 4.
  2. Tous les deux jours, de surveiller la croissance des tumeurs en utilisant l'imagerie par ultrasons.
  3. Le jour de l'imagerie, peser et anesthésier les souris en utilisant un mélange d'anesthésiques kétamine et de médétomidine (75 mg / kg et 1 mg / kg, respectivement), injectée par voie intrapéritonéale à 0,1 ml par 10 g de poids corporel.
  4. Rasez la zone abdominale pour exposer la peau.
  5. Instiller 100 ul de 0,9% stérile saline dans la vessie à l'aide d'un calibre 24 IV cathéter. La solution saline se distendre la vessie et améliorer la visibilité pendant la imagerie par ultrasons.
  6. Placer la souris sur la plate-forme d'ultrasons et d'appliquer un gel conducteur au labdomen eurs.
  7. Abaisser la sonde de poche à la peau et acquérir des images en mode B de la vessie sur la plate - forme d'imagerie 21.
  8. Revive les souris par voie sous-cutanée médicament d'inversion d'injection (1 mg / kg atipamézole) à 0,1 ml par 10 g de poids corporel.

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Résultats

PSA sécrétion à partir de cellules MB49 a varié avec le milieu de croissance. MB49-PSA est cultivé dans DMEM médias parce que cela se traduit par une sécrétion accrue de PSA (figure 1A). Afin de déterminer la sensibilité du PSA ELISA et PCR en temps réel, un nombre différent de MB49-PSA sécrétant les cellules ont été mélangées avec des cellules parentales MB49. PSA ELISA détecte un minimum de 1 x 10 5 cellules PSA sécrétant / 1 x 10 6 cellules

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Discussion

Les étapes les plus critiques dans le protocole sont: 1) maintenir avec succès la tumorigénicité de la lignée cellulaire; 2) assurant mesurable PSA sécrétion avant l'implantation des cellules tumorales chez la souris; 3) la génération d'une suspension à cellule unique pour l'implantation de manière à réduire la variation de la taille de la tumeur; et 4) instiller des cellules à une vitesse lente pour éviter reflux vésico-urétéral, ce qui entraîne une tumeur implantation de cellules dans le rein.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par une subvention du Conseil national de la recherche médicale de Singapour (NMRC/CIRG/1335/2012) accordée au professeur Kesavan Esuvaranathan.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Cellules MB49-PSAN/AN/Aréf (Wu QH, 2004)
RPMI 1640 mediaHyCloneSH30027.01  ;
Milieu d’aigle modifié (DMEM) de DulbeccoBiowestL0102
Sérum de veau fœtal (FBS) Sérum de bovin fœtal d’Amérique du SudBiowestS1810
FBS) Amérique du Sud, SérumBiowestS181B
(FBS)HyCloneSH30088.03  ;
L-glutamineBiowestX0550
Pénicilline-StreptomycineBiowestL0022
Hygromycine BInvitrogen10687-010
Free PSA (Human) ELISAkit AbnovaKA0209
TRIzol Réactif pour l’extraction de l’ARN  ;Ambion15596026
Kit de transcription inverse de l’ADNc haute capacité avec inhibiteur de la RNaseApplied Biosystems4374967
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
TaqMan Gene Expression Assay &ndash ; Mouse ActbApplied Biosystems4331182Mm00607939_s1
TaqMan Gene Expression Assay &ndash ; Humain KLK3Applied Biosystems4331182souris femelles Hs00426859_g1
C57BL/6JIn Vivos4 - 6 semaines
Anesthésie (75 mg/kg de kétamine et 1 mg/kg de médétomidine)Pharmacie
Médicament d’inversion (1 mg/kg Atipamezole)Pharmacie
Poinçon d’oreilleMicroscopie électronique Sciences72893-01
Solution de Hartmann ou Composé lactate de sodiumB Braun
Pommade ophtalmique - Duratears Pommade lubrifiante oculaire stérileAlcon
Heat pack - HotHands chauffe-mainsHeatmax Inc
Introcan Certo IV cathéterB Braun425130024 G x 3/4&Prime ;
Aquagel Gelée lubrifiantePharmacie locale Solution
de poly-L-lysine, 0,01 %,SigmaP4707
cOmplete, Mini, sans EDTA Inhibiteur de protéase CocktailRoche4693159001
Quantichrom Kit de dosage de créatinineBioAssay SystemsDICT-50  ;
Colorant fluorescent - VivoTrack 680Perkin ElmerNEV12000  ;
Solution de transition de tissus congelés RNAlater-ICEAmbion4427575
Name>CompanyNuméro de catalogue>Comments
>Equipment and Software
7500 Système de PCR en temps réelappliqué Biosystems
7500 Software v2.3Applied Biosystems
Metabolic CageTecniplast  ;Rack de type vertical pour système
  ;BD Biosciences
BD FACSDiva software v7BD Biosciences
IVIS SpectrumCT in vivo système d’imagerie  ;Caliper Life Sciences  ;
Logiciel d’image vivante v3.1Caliper Life Sciences  ;
Système d’imagerie Vevo 2100VisualSonics  ;
( de veau fœtal Premium localelocale BD FACSCanto I de 12 cages

Références

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