Un système de détection de tumeur modèle et tumeur murine Orthotopique vessie

Résumé

Ce protocole décrit la génération de tumeurs de la vessie orthotopique de souris femelles de souris C57BL / 6J et le contrôle de la croissance tumorale.

Résumé

Ce protocole décrit la génération de tumeurs de la vessie chez des souris C57BL / 6J femelles en utilisant la lignée cellulaire de cancer de la vessie murin MB49, qui a été modifiée pour secréter de la prostate humain de l'antigène spécifique (PSA) et la procédure pour la confirmation d'implantation de la tumeur. En bref, les souris sont anesthésiés à l'aide de drogues injectables et sont faits pour mettre en position dorsale. L'urine est libérée de la vessie et de 50 pi de poly-L-lysine (PLL) est lentement instillée à un débit de 10 pl / 20 s en utilisant un cathéter 24 G IV. Il est laissé dans la vessie pendant 20 minutes en bouchant le cathéter. Le cathéter est retiré et PLL est libéré par une légère pression sur la vessie. Ceci est suivi par l' instillation de la lignée cellulaire de cancer de la vessie de souris (1 x 10 ⁵ cellules / 50 ul) à un débit de 10 pl / 20 s. Le cathéter est bouché pour empêcher l'évacuation prématurée. Après 1 h, les souris sont ravivées avec un médicament d'inversion, et la vessie est annulée. Le taux d'instillation lente est important,car il réduit reflux vésico-urétéral, ce qui peut provoquer des tumeurs de se produire dans les voies urinaires supérieures et dans les reins. La lignée cellulaire doit être bien remis en suspension pour réduire l'agglutination des cellules, car cela peut conduire à des tailles de tumeur inégale après l'implantation.

Cette technique induit des tumeurs avec une grande efficacité. La croissance des tumeurs est contrôlée par la sécrétion urinaire de PSA. la surveillance du marqueur PSA est plus fiable que les ultrasons ou l'imagerie par fluorescence pour la détection de la présence de tumeurs de la vessie. Tumeurs chez les souris atteignent généralement une taille maximale ayant un impact négatif sur la santé d'environ 3 - 4 semaines, si non traitée. En surveillant l'évolution de la tumeur, il est possible de différencier les souris qui ont été guéris de ceux qui ne sont pas implantés avec succès des tumeurs. Avec seulement une analyse du point final, ce dernier peut être à tort, supposé avoir été guéri par thérapie.

Introduction

Le but de cette méthode est de générer des tumeurs de la vessie murin orthotopique et de suivre les tumeurs implantées aussi précisément que possible, de sorte que les souris sans implantation de la tumeur ne sont pas pensé pour avoir été durcie à l'analyse du point final. Dans l'ensemble, la méthode indiquée réduira la nécessité d'un grand nombre de souris pour l'analyse expérimentale et assurer une plus grande précision dans la détermination des résultats thérapeutiques.

Le développement d'un modèle orthotopique de cancer est important, car les cellules tumorales implantation sous-cutanée ne récapitulent pas l'en....

Protocole

Tous les travaux des animaux adhéré aux directives du Comité des soins et l'utilisation des animaux institutionnels (IACUC) sur l'utilisation des animaux et de manutention (numéro de protocole 084/12) à l'Université nationale de Singapour.

1. Croissance des cellules MB49-PSA in vitro et de mesure PSA Sécrétion

1. Maintenir murine cancer de la vessie cellules MB49-PSA ¹⁵ dans complet du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS), 2 mmol / L de L-glutamine et 0,05 mg / mL de pénicilline-streptomycine dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO

Résultats

PSA sécrétion à partir de cellules MB49 a varié avec le milieu de croissance. MB49-PSA est cultivé dans DMEM médias parce que cela se traduit par une sécrétion accrue de PSA (figure 1A). Afin de déterminer la sensibilité du PSA ELISA et PCR en temps réel, un nombre différent de MB49-PSA sécrétant les cellules ont été mélangées avec des cellules parentales MB49. PSA ELISA détecte un minimum de 1 x 10 ⁵ cellules PSA sécrétant / 1 x 10 ⁶ cellules

Discussion

Les étapes les plus critiques dans le protocole sont: 1) maintenir avec succès la tumorigénicité de la lignée cellulaire; 2) assurant mesurable PSA sécrétion avant l'implantation des cellules tumorales chez la souris; 3) la génération d'une suspension à cellule unique pour l'implantation de manière à réduire la variation de la taille de la tumeur; et 4) instiller des cellules à une vitesse lente pour éviter reflux vésico-urétéral, ce qui entraîne une tumeur implantation de cellules dans le rein.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cellules MB49-PSA	N/A	N/A	réf (Wu QH, 2004)
RPMI 1640 media	HyClone	SH30027.01  ;
Milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco	Biowest	L0102
Sérum de veau fœtal (FBS) Sérum de bovin fœtal d’Amérique du Sud	Biowest	S1810
FBS) Amérique du Sud, Sérum	Biowest	S181B
(FBS)	HyClone	SH30088.03  ;
L-glutamine	Biowest	X0550
Pénicilline-Streptomycine	Biowest	L0022
Hygromycine B	Invitrogen	10687-010
Free PSA (Human) ELISA	kit Abnova	KA0209
TRIzol Réactif pour l’extraction de l’ARN  ;	Ambion	15596026
Kit de transcription inverse de l’ADNc haute capacité avec inhibiteur de la RNase	Applied Biosystems	4374967
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystems	4304437
TaqMan Gene Expression Assay &ndash ; Mouse Actb	Applied Biosystems	4331182	Mm00607939_s1
TaqMan Gene Expression Assay &ndash ; Humain KLK3	Applied Biosystems	4331182	souris femelles Hs00426859_g1
C57BL/6J	In Vivos		4 - 6 semaines
Anesthésie (75 mg/kg de kétamine et 1 mg/kg de médétomidine)	Pharmacie
Médicament d’inversion (1 mg/kg Atipamezole)	Pharmacie
Poinçon d’oreille	Microscopie électronique Sciences	72893-01
Solution de Hartmann ou Composé lactate de sodium	B Braun
Pommade ophtalmique - Duratears Pommade lubrifiante oculaire stérile	Alcon
Heat pack - HotHands chauffe-mains	Heatmax Inc
Introcan Certo IV cathéter	B Braun	4251300	24 G x 3/4&Prime ;
Aquagel Gelée lubrifiante	Pharmacie locale Solution
de poly-L-lysine, 0,01 %,	Sigma	P4707
cOmplete, Mini, sans EDTA Inhibiteur de protéase Cocktail	Roche	4693159001
Quantichrom Kit de dosage de créatinine	BioAssay Systems	DICT-50  ;
Colorant fluorescent - VivoTrack 680	Perkin Elmer	NEV12000  ;
Solution de transition de tissus congelés RNAlater-ICE	Ambion	4427575
Name	>Company	Numéro de catalogue	>Comments
>Equipment and Software
7500 Système de PCR en temps réel	appliqué Biosystems
7500 Software v2.3	Applied Biosystems
Metabolic Cage	Tecniplast  ;	Rack de type vertical pour système
;	BD Biosciences
BD FACSDiva software v7	BD Biosciences
IVIS SpectrumCT in vivo système d’imagerie  ;	Caliper Life Sciences  ;
Logiciel d’image vivante v3.1	Caliper Life Sciences  ;
Système d’imagerie Vevo 2100	VisualSonics  ;

( de veau fœtal Premium localelocale BD FACSCanto I de 12 cages