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Article de méthode

Electrophorèse Capillaire séparation de l'anticorps monoclonal isoformes Utilisation d'un Capillaire Neutre

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DOI :

10.3791/55082

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16 janvier 2017

 ,  ,  ,  , 
1Unidad de Investigación y Desarrollo, Probiomed S.A. de C.V.

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole complet d’électrophorèse de la zone capillaire pour l’évaluation de l’hétérogénéité physicochimique intrinsèque des anticorps monoclonaux en tant qu’attribut de qualité.

Résumé

Les protéines biothérapeutiques, telles que les anticorps monoclonaux (mAb), sont des alternatives réalisables pour le traitement des maladies dégénératives chroniques. L’activité biologique de ces protéines dépend de leurs propriétés physico-chimiques. L’utilisation de techniques performantes comme la chromatographie et l’électrophorèse capillaire a été décrite pour l’analyse de l’hétérogénéité physico-chimique des anticorps monoclonaux. De nos jours, la technique de l’électrophorèse de la zone capillaire (CZE) constitue l’un des tests les plus résolutifs et les plus sensibles pour l’analyse des biomolécules. De plus, la séparation électro-entraînée dans CZE est régie par des propriétés étendues de la matière et offre l’avantage d’analyser des protéines proches de leur état natif. Cependant, la mise en œuvre réussie de cette technique pour l’analyse de routine dépend des compétences de l’analyste aux étapes critiques de la préparation de l’échantillon et du système. Le but de ce tutoriel est de détailler les étapes pour réussir l’analyse CZE des mAbs. De plus, ce protocole peut être utilisé pour le développement et l’amélioration des compétences du personnel impliqué dans les laboratoires de chimie analytique des protéines.

Introduction

Les anticorps monoclonaux (mAb) sont des protéines biothérapeutiques avec un intérêt croissant en raison de leur capacité d'agir contre plusieurs maladies chroniques et dégénératives 1. Comme d' autres biomolécules, les mAb sont sujettes à subir plusieurs modifications physico - chimiques à tous les stades de leur cycle de vie (ie, de la biosynthèse du produit final). De telles modifications comprennent, mais sans s'y limiter: la désamidation, la glycosylation, l' oxydation, la cyclisation, l' isomérisation, l' agrégation et le clivage protéolytique 2. Par conséquent, les techniques d'analyse capables de résoudre les isoformes intrinsèques sont nécessaires pour surveiller les mAb hétérogénéité et de la stabilité dans le but d'établir des spécifications de qualité.

L'électrophorèse capillaire (CE) est une technologie de séparation haute performance réalisée outinside d'un tube de silice fondue étroite (plage um) remplie d'un électrolyte de fond (BGE). Lors de l'application d'un champ électrique (jusqu'à 30 000 V), molécule chargées migrent vers l'électrode avec une charge opposée ( à savoir, la séparation entraîné électro-). L'utilisation de tensions élevées en CE permet des analyses rapides et une plus grande efficacité, qui sont supérieures à une électrophorèse sur gel classique. Électrophorèse capillaire de zone (CZE) est une technique basée CE couramment utilisé dans l'industrie biopharmaceutique pour l' évaluation de la qualité du produit 3-9. Contrairement à d' autres modes de CE (par exemple, l' électrophorèse sur gel capillaire, capillaire isoélectrofocalisation) ou des méthodes basées sur la chromatographie, CZE peut être effectuée sans utiliser dénaturants ou interfaces en phase solide, ce qui permet l'analyse de l'hétérogénéité inhérente des mAb proches de leur état natif 10 . Séparation CZE des isoformes mAb se produit à l' intérieur d'un capillaire en silice fondue recouverte d'un polymère hydrophile (capillaire neutre) et est basé sur leur mobilité électrophorétique différente, qui est gouverné par la charge, la masse, la taille et la forme (ou volume hydrodynamique) 11. fractions mAb sont détectées lorsqueils sont mobilisés et passent à travers la fenêtre de détection, qui est détecté par un détecteur ultraviolet (UV) de l' absorbance à 214 nm 4.

La mise en œuvre réussie de cette technique d'analyse dépendra de l'attention voulue aux détails avant et pendant l'expérience. Agir autrement augmentera le coût et le temps de procéder à l'analyse, conduisant finalement à l'échec et la frustration constante.

Ici, nous présentons un guide étape par étape pour effectuer une analyse réussie de mAb hétérogénéité par CZE par l'explication détaillée de la préparation des solutions et des échantillons, la préparation du système de CE, les méthodes d'instruments mis en place, l'acquisition de données, et le traitement. Aux fins de ce tutoriel, un anti-facteur de nécrose tumorale alpha entièrement humain recombinant (anti-TNF) mAb est utilisé comme modèle de protéine; Cependant, ce protocole peut être facilement personnalisé pour l'analyse d'autres protéines qui envisagent de brèves modifications. UNEn outre, plusieurs recommandations visant à atténuer les problèmes potentiels sont proposés. Le lecteur est invité à suivre strictement le protocole proposé, comme la probabilité de réussir augmentera.

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Protocole

1. Préparation des solutions

  1. Préparer la solution BGE.
    1. Préparer 100 ml d'une solution composée de 0,05% (m / v) de cellulose, l'hydroxy propyl méthyl cellulose (HPMC), 200 mM de ε-amino n-caproïque (EACA) et 30 mM d'acétate de lithium.
      NOTE: Comme HPMC est un polymère viscoélastique, verser la poudre dans un bécher en verre, ajouter 80 ml d'eau et enfin ajouter la barre d'agitation. Continuez à ajouter les autres réactifs comme normalement. Porter des lunettes de sécurité lors de la manipulation d'acétate de lithium car il peut causer une irritation des yeux.
    2. Ajuster la valeur de pH 4,8 ± 0,1 avec 50% (v / v) d'acide acétique. Laisser la solution se stabiliser pendant 5 min et ajuster si nécessaire.
    3. Ajouter de l'eau pour compléter à un volume final de 100 ml en fiole jaugée.
    4. Filtrer à travers une membrane hydrophile ayant une taille de pores de 0,2 um.
    5. Conserver à 2-8 ° C pendant 7 jours.
  2. Préparer l'étalon interne.
    1. Préparer 1 mld'une solution composée de 1% (m / v) histamine.
    2. Filtrer à travers une membrane hydrophile ayant une taille de pores de 0,2 um.
    3. Conserver à 2-8 ° C pendant 1 jour.

Préparation 2. Sample

  1. Préparation de 180 ul d'échantillon dilué Acm avec du tampon Tris (50 mM de Tris (hydroxyméthyl) aminométhane, pH 8,0) à une concentration finale de 1 mg / ml.
  2. Ajouter 20 pi de 1% (m / v) de l'histamine.
  3. Mélanger et centrifuger à 1000 xg pendant 5 sec.
  4. Placer un micro-fiole dans un flacon universel.
  5. Transférer l'échantillon dans le micro flacon et boucher le flacon universel. Distribuer l'échantillon vers le haut afin d'éviter d'introduire des bulles.
  6. Conserver à 2-8 ° C pendant 1 jour.
  7. Placer le flacon universel (avec micro flacon contenant la solution d'échantillon) dans le bac d'entrée d'échantillon.

3. Préparation du système CE.

  1. Système de nettoyage CE.
    NOTE: Conduite eest procédé au moins une fois par semaine, afin d'éviter les fuites de courant électrique provenant de l'accumulation de poussière et de débris. Toutefois, en fonction de l'application (par exemple, l' utilisation d'un BGE avec une viscosité accrue ou avec une concentration élevée en sel, des échantillons avec augmentation de la viscosité) électrodes et leviers d'ouverture peut exiger d'être nettoyé plus fréquemment pour éviter la contamination croisée et contamination de l' échantillon.
    1. Éteignez l'interrupteur d'alimentation de l'instrument de la CE et d'ouvrir la porte d'entrée.
    2. Nettoyer la surface de la couverture de l'échantillon, l'échantillon de maintien du système (échantillon et tampons plateaux), couvercle de la cartouche, barre de serrage, bloc d'interface et des électrodes avec un non-tissé imbibé d'eau essuyez. Répétez la procédure avec un mélange éthanol-humidifié essuyer et sécher avant de l'utiliser.
    3. Rincer les leviers d'ouverture avec de l'eau. Nettoyer leur surface avec un Chiffon non tissé. Répétez la procédure avec un mélange éthanol-humidifié essuyer et sécher avant l'installation.
    4. Nettoyer les deux extrémités du câble à fibres optiques prudently avec un chiffon en microfibre imbibé d'eau. Répétez la procédure avec un chiffon imbibé d'éthanol.
  2. Ensemble de cartouche.
    1. Retirer un nouveau capillaire neutre (50 um de diamètre intérieur) de son emballage.
    2. Bande vers le bas une extrémité du capillaire tube de protection sur le plan de travail. Déroulez, redresser et tirer le capillaire sur le tube.
    3. Collez un morceau de ruban adhésif ou de papier à l'établi et ajouter des repères de mesure comme suit: longueur au détecteur (30 cm), la fenêtre capillaire (0,2 cm) et de la longueur à l'extrémité de sortie (10 cm) (ie, longueur 40,2 cm au total, 30,0 cm de longueur effective).
    4. Alignez la fenêtre capillaire à la marque de mesure de 0,2 cm dans le document de référence. Fixer le capillaire avec du ruban adhésif et marquer les extrémités du capillaire 2 mm en dehors des marques de mesure.
    5. Coupez le capuchon de protection à l'extrémité d'entrée capillaire (le plus éloigné de la fin de la fenêtre) dans un seul mouvement rectiligne en utilisant le bord affleurement de la pierre de fendage.
      1. Immerger l'extrémité capillaire dans un flacon universel plafonné rempli d'eau afin d'éviter des dommages permanents au revêtement intérieur capillaire. Répéter cette opération à chaque fois que l'extrémité capillaire est exposé à la température ambiante pendant plus de 1 min.
    6. Insérer l'extrémité d'entrée capillaire dans le côté de sortie de la cartouche.
    7. Poussez et tirez le capillaire à travers la cartouche que nécessaire jusqu'à ce que la fenêtre capillaire est centrée à la fenêtre de la cartouche.
    8. Insérez la fiche d'ouverture (100 um x 200 um) dans la fenêtre de la cartouche.
      REMARQUE: Assurez-vous que la lumière blanche passe à travers la fenêtre quand il est exposé à une source de lumière blanche. Si la lumière qui passe à travers a une apparence brunâtre, ajuster si nécessaire.
    9. Insérer le capillaire dans le tube de liquide de refroidissement pré-formé pour une longueur capillaire totale de 40,2 cm (avec écrou de tube pré-installé, la virole et le joint torique aux deux extrémités dans cet ordre).
    10. Poussez le capillaire à travers le coolant tubulure comme nécessaire jusqu'à ce que le capillaire figure à l'autre côté du tube.
    11. Insérer l'extrémité du tube de refroidissement dans le côté de sortie de la cartouche et serrer l'écrou de tube.
    12. Insérer l'extrémité d'entrée capillaire dans le côté d'entrée de la cartouche.
    13. Poussez et tirez le capillaire à travers la cartouche que nécessaire jusqu'à ce que le capillaire apparaît à côté de l'entrée de la cartouche.
    14. Insérer l'extrémité du tube de refroidissement dans le côté d'entrée de la cartouche et serrer l'écrou de tube.
    15. Coupez le capuchon de protection à l'extrémité de sortie capillaire (l'extrémité la plus proche de la fenêtre) en un seul mouvement rectiligne en utilisant le bord affleurement de la pierre de fendage.
    16. Insérez les clips de joint-retenue sur les extrémités capillaires et appuyez sur pour la mettre en position. Inspecter visuellement les extrémités du capillaire. Si elles ne sont même pas, répétez la procédure.
    17. Placer le gabarit capillaire de longueur sur le bord du plan de travail.
    18. Placez la cartouche vers le bas against le modèle capillaire de longueur et aligner le tube capillaire se termine par les lignes de référence sur le modèle. Si les marques de mesure capillaire (voir 3.2.4) ne sont pas alignées avec les lignes de référence, ajuster si nécessaire.
    19. Tenir le capillaire contre le modèle capillaire de longueur et couper les deux extrémités du capillaire en utilisant le bord du flush de la cliver pierre 2 mm en dessous des lignes de référence sur le modèle.
    20. Inspecter visuellement le capillaire se termine par une loupe. Si les extrémités capillaires ne sont pas lisses, brunir les utiliser le visage doux de la pierre de fendage.
    21. Insérez l'ouverture joint torique dans le trou du bouchon d'ouverture à l'aide de l'outil d'insertion O-ring.
    22. Installez des flacons universels plafonnés remplis d'eau dans le boîtier de la cartouche et le lieu cartouche dans le cas immédiatement avec des extrémités capillaires insérées dans des flacons. Pour le stockage à court et à long terme garder à 2-8 ° C.
  3. Préparation de plateaux de tampons.
    1. Remplissez et placez univers plafonnésdes flacons al dans l'entrée de la mémoire tampon et des plateaux de sortie (figure 1). positions flacon Répéter les pistes 2, 3, 4 et 5 selon le nombre d'échantillons à analyser, en plaçant une voie pour tous les six injections d'échantillons.
      REMARQUE: Évitez de mouiller les bouchons des flacons afin d'éviter les fuites de courant.

figure-protocol-1
Figure 1: Position et le niveau de remplissage des flacons universels dans l'entrée de la mémoire tampon et de sortie des plateaux. Remplir les niveaux: 1/1 = 1400 pi, 3/4 = 1300 pi et 1/2 = 1000 pi. Abréviations: W = eau, HCl = acide chlorhydrique 0,1 M. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Système CE composants d'assemblage.
    1. Installez le détecteur UV.
    2. Installer les leviers d'ouvertureen appuyant vers le haut dans le bloc d'interface.
    3. Installez le câble à fibre optique. Insérez l'extrémité correspondant à la barre de serrage et, tout en maintenant les deux extrémités, tourner dans le sens horaire. Connectez l'autre extrémité au détecteur UV.
      REMARQUE: Manipulez le câble à fibre optique avec soin au cours de cette procédure depuis la flexion pourrait provoquer sa rupture.
    4. Placer l'échantillon et des plateaux de tampons dans le système échantillon de maintien et enclenchent en position.
    5. Placez la cartouche capillaire dans le bloc d'interface et, tout en appuyant sur la barre de serrage aux deux extrémités, serrez les boutons.

4. Méthodes Instrument Set-up

  1. Créer le conditionnement, le fonctionnement et les méthodes de l'appareil d'arrêt selon les paramètres suivants et le tableau 1: Tension, max: 30,0 kV; Courant, max: 300,0 uA; Température de la cartouche: 20,0 ° C; température de stockage de l'échantillon: 10,0 ° C; détecteur UV conditions initiales: Wavelength: 214 nm; Débit de données: 4 Hz; Filtre: normal; largeur Peak (des points): 16-25; signal Absorbance: Direct.
    NOTE: taux d'acquisition des données peut être augmentée jusqu'à 25 Hz afin d'améliorer la couverture des zones de séparation étroites.
Conditionnement programme méthode du temps
Temps (min) un événement Valeur Durée flacon Inlet flacon Outlet Résumé commentaires
- Rincez - Pression 2068 mbar 1,0 min BI: C1 BO: C1 Vers l'avant HCl 0,1 M
- Rincez - Pression 2068 mbar 2.0 min BI: B1 BO: C1 Vers l'avant Eau
- Rincez - Pression 2068 mbar 10,0 min BI: E1 BO: C1 Vers l'avant BGE
0.00 Séparé - Tension 15,0 KV 10,0 min BI: D1 BO: D1 0,17 Min rampe, polarité normale Séparé
10.00 Rincez - Pression 2758 mbar 10,0 min BI: E1 BO: C1 Vers l'avant BGE
20.01 Attendez - 0,0 min BI: A1 BO: A1 - conseils de rinçage
Exécution de méthode programme de temps
Temps (min) un événement Valeur Durée flacon Inlet flacon Outlet Résumé commentaires
- Rincez - Pression 2068 mbar 1,0 min BI: C1 BO: C1 Forward, In / Out inc flacon 6 HCl 0,1 M
- Rincez - Pression 2068 mbar 2.0 min BI: B1 BO: C1 Forward, In / Out inc flacon 6 Eau
- Rincez - Pression 2068 mbar 4.0 min BI: E1 BO: C1 Forward, In / Out inc flacon 6 BGE
- Injecter - Pression 34 mbar 20.0 sec SI: A1 BO: B1 Substituer, Forward injection échantillon
- Attendez - 0,4 min BI: A1 BO: A1 In / Out inc flacon 6 LAVAGE
0 Séparé - Tension 15,0 KV 30,0 min BI: D1 BO: D1 0,17 Min rampe, polarité normale, In / Out inc flacon 6 séparation Sample
0,5 Autozéro - - - - - -
30.01 Arrêtez les données - - - - - -
30.02 Rincez - Pression 2068 mbar 2.0 min BI: B1 BO: C1 Forward, In / Out inc flacon 6 Eau
32.03 Attendez - 0,0 min BI: A1 BO: A1 In / Out inc flacon 6 conseils de rinçage
32.04 Fin - - - - - Fin
Arrêt programme méthode du temps
Temps (min) un événement Valeur Durée flacon Inlet flacon Outlet Résumé commentaires
- Rincez - Pression 2068 mbar 1,0 min BI: E6 BO: E6 Vers l'avant HCl 0,1 M
- Rincez - Pression 2068 mbar 6,0 min BI: F6 BO: F6 Vers l'avant Eau
- Lamp - Off - - - - - -
- Attendez - 0,0 min BI: A1 BO: A1 - conseils de rinçage

Tableau 1: Conditionnement, en cours d' exécution et les programmes de temps d'arrêt.

5. Acquisition et traitement de données

  1. Programmer l'ensemble de l' échantillon.
    1. Programmer le capillaire pour le conditionnement en utilisant le procédé de l'appareil de conditionnement. Quand le capillaire est utilisé pour la première fois, le programme quatre répétitions; sinon programmer seulement deux répétitions du procédé de conditionnement.
    2. Programmer les échantillons à analyser en utilisant la méthode de l'instrument en cours d'exécution.
    3. Programmer le capillaire pour le stockage en utilisant la méthode de l'instrument d'arrêt et répéter la procédure indiquée dans la section 3.2.22.
  2. Exécutez l'expérience.
  3. Exporter les électrophérogrammes.
  4. Calculer le temps de migration et la teneur en pourcentage de base, un principalisoformes acides nd utilisant l'intégration verticale de la ligne de chute du profil de électrophérogramme.

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Résultats

La figure 2 montre le profil du courant électrique typique d'un EACA 200 mM, 30 mM d' acétate de lithium à pH 4,8 avec l' échantillon BGE anti TNFa Acm dilué avec du tampon Tris (50 mM, pH 8,0). Comme on peut le constater, le courant est stable tout au long de l'analyse et peut osciller entre des valeurs de 30 à 35 uA. La figure 3 montre l'électrophérogramme CZE d'un échantillon vierge où le pic détecté correspond à l'étalon i...

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Discussion

Dans ce tutoriel, nous mettons en évidence l'importance des pratiques appropriées lors de la conduite CZE analyse de mAb afin d'augmenter la probabilité de réussir. Toutefois, lorsque CZE est utilisé sur une base régulière, les questions se posent inévitablement 12.

Pour de meilleurs résultats, il est important de suivre les notes qui ont été inclus dans l'ensemble du protocole, car elles aideront l'analyste à surmonter et résoudre les étapes difficiles. Une consid...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs Carlos E. Espinosa-de la Garza, Rodolfo D. Salazar-Flores, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz et Emilio Medina-Rivero sont des employés de Probiomed S.A. de C.V., qui développe, fabrique et commercialise des produits biosimilaires. Tous les auteurs sont impliqués dans le développement de produits biosimilaires pour Probiomed.

Remerciements

Les auteurs remercient Wiley pour l’autorisation accordée d’utiliser les concepts de la publication suivante pour ce tutoriel. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero : Analyse des anticorps monoclonaux recombinants par électrophorèse de la zone capillaire. Électrophorèse. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. Ce travail a été soutenu par la subvention 230551 du CONACyT, Mexique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide acétique glacialTecsiquimAT0035-7
Acide chlorhydrique de qualité ACSJ.T. Baker9535-05
Dichlorhydrate d’histamineFluka53300
(Hydroxypropyl)méthylcellulose  ;Fluka09963
Acétate de lithiumSigma-Aldrich517992
Acide 6-aminocaproïqueSigma-AldrichA2504
eCAP Tris Buffer, 50,0 mM,  ; pH 8Beckman Coulter477427
PA 800 Plus Système d’analyse pharmaceutiqueBeckman CoulterA66528
eCAP Neutre capillaire  ;Beckman Coulter477441
flacon, micro, 200 & micro ; lBeckman Coulter144709
Bouchons universelsBeckman CoulterA62250
Flacons universelsBeckman CoulterA62251
Câble, optique, UV/VisBeckman Coulter144093
Module de détection UV/VisBeckman Coulter Beckman Coulter144733
Kit d’assemblage de cartouche, viergeBeckman Coulter
144738

Références

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Réimpressions et autorisations

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