Article de méthode

Accordable hydrogels de matrice extracellulaire pulmonaire pour la 3D Culture Cellulaire

DOI :

10.3791/55094

⸱

17 janvier 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Virginia Commonwealth University, 2Department of Physiology and Biophysics, Virginia Commonwealth University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ceci est une méthode pour créer un échafaudage trois dimensions de culture de cellules de la matrice extracellulaire pulmonaire. poumon Intact est transformé en hydrogels qui peuvent soutenir la croissance des cellules en trois dimensions.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici une méthode pour établir des composants multiples hydrogels de culture cellulaire pour la culture in vitro de cellules de poumon. En commençant par la santé en tissu bloc pulmonaire de porc, rat ou la souris, le tissu est perfusé et immergé dans les détergents chimiques ultérieures pour éliminer les débris cellulaires. comparaison histologique du tissu avant et après le traitement confirme l'élimination de plus de 95% de la coloration de l'ADN double brin et l'alpha-galactosidase suggère que la majorité des débris cellulaires sont éliminés. Après décellularisation, le tissu est lyophilisé, puis cryomilled en poudre. La poudre de matrice est digéré pendant 48 heures dans une solution de digestion de la pepsine acide, puis on neutralise pour former la solution de pré-gel. Gélification de la solution de pré-gel peut être induite par une incubation à 37 ° C et peut être utilisée immédiatement après la neutralisation ou stocké à 4 ° C pendant jusqu'à deux semaines. Les revêtements peuvent être formés en utilisant la solution de pré-gel sur une plaque non-traitée pour cattachement ell. Les cellules peuvent être mises en suspension dans le pré-gel avant de l'autoassemblage de réaliser une culture en 3D, plaquée sur la surface d'un gel formé à partir de laquelle les cellules peuvent migrer à travers l'échafaudage, ou plaquée sur les revêtements. Les modifications de la stratégie présentés peuvent avoir un impact température de gélification, la force ou la taille des fragments de protéines. Au-delà de la formation d'hydrogel, la rigidité d'hydrogel peut être augmentée en utilisant genipin.

Introduction

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La traduction des résultats in vitro en clinique est l’un des problèmes les plus difficiles auxquels sont confrontés les chercheurs biomédicaux. La recherche in vitro sur le plastique de culture tissulaire est plus facile, plus pratique et maintient une viabilité cellulaire élevée. 1 Cette approche est un point de départ raisonnable, mais les résultats ont une traduction clinique limitée. De plus en plus, les laboratoires intègrent des constructions tridimensionnelles pour remplacer les méthodes bidimensionnelles traditionnelles. Des revues sont disponibles pour de nombreux environnements tridimensionnels, des échafaudages biologiques aux échafaudages polymères. 2,3

Les cadres biologiques peuvent imiter les caractéristiques des environnements in vivo car ils contiennent de nombreux composants protéiques et glycosaminoglycanes de la matrice native et fournissent des sites de liaison familiers auxquels les cellules peuvent se fixer et reconnaître. Il a été démontré que les matériaux dérivés de la matrice extracellulaire (ECM) sont des échafaudages capables de fixer et de proliférer les cellules. 4 L’un des défis qui limitent l’application des plates-formes d’hydrogel ECM provient de leurs propriétés mécaniques intrinsèquement faibles après la gélification. Les tissus natifs ont souvent des propriétés mécaniques qui sont plus élevées que les hydrogels. Les agents de réticulation non toxiques peuvent augmenter les propriétés mécaniques des hydrogels pour mieux imiter l’environnement des tissus natifs. La génipine est un agent de réticulation naturel non toxique dérivé des plantes de gardénia avec la capacité d’adapter étroitement les propriétés mécaniques de la MEC avec des changements dans la concentration de génipine5,6.

Presque toutes les cellules du corps existent dans la MEC qu’elles produisent ou maintiennent et s’organisent sur celle-ci. L’accent mis sur l’importance universelle de la MEC dans l’organisation, l’état et la fonction de chaque organe ou système a déclenché la production de plates-formes matricielles pour l’investigation in vitro. La sous-muqueuse de l’intestin grêle porcin est l’échafaudage d’origine naturelle le plus étudié, et elle a été utilisée pour régénérer les tendons, les ligaments, le muscle squelettique4 et même l’os7. Les matrices d’autres organes et espèces donneuses ont également démontré un bon potentiel de régénération tissulaire. L’utilisation de composants ECM étrangers pose des problèmes minimes d’immunomodulation. Après l’élimination de la matière cellulaire de l’hôte, la MEC restante aura une teneur en acides aminés et une organisation similaires à celles de toutes les autres espèces de mammifères8. De plus en plus de gens pensent que la meilleure façon d’examiner les interactions cellule-MEC in vitro est d’utiliser des échafaudages MEC spécifiques à un organe. Chaque organe fournit une composition unique de protéines et de protéoglycanes pour créer des niches cellulaires. Les niches fournissent la dégradation structurelle, fonctionnelle et même enzymatique de la matrice extracellulaire, contribuant ainsi à la signalisation biophysique. Pour obtenir un microenvironnement in vitro le plus similaire au microenvironnement in vivo, l’utilisation de la MEC spécifique aux tissus permettrait d’optimiser les niches cellulaires pour la recherche.

L’objectif de ce protocole est de fournir une méthode pour établir un échafaudage d’hydrogel unique à la MEC pulmonaire. Cette méthode fournit une plate-forme pour la recherche in vitro sur les interactions cellules pulmonaires-ECM.

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Protocole

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Solution Filtre stérile instructions
Dih 2 O Oui Dih 2 O; filtré de manière stérile
Solution à 0,1% de Triton X-100 Oui Sous la hotte ajouter 100 pi de Triton-X 100 Solution 100 ml Dih 2 O et agiter jusqu'à dissolution;
filtre stérile.
2% de désoxycholate Solution Oui Sous la hotte ajouter la solution de désoxycholate de sodium 2 g
par 100 ml Dih 2 O et agiter jusqu'à dissolution; filtre stérile
NaCl 1 M Oui Ajouter 58,44 g de NaCl à 1 L de Dih 2 O; agiter jusqu'à dissolution;
filtre stérile
une solution de DNase Oui Ajouter 12.000des unités de DNase 1 L Dih 2 O; Ajouter 0,156 g MgSO 4
(Anhydre) et 0,222 g de CaCl 2; agiter jusqu'à dissolution; filtre stérile
PBS Oui Mélanger 27,2 g Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (de heptahydraté),
80 g de NaCl et 2 g de KCl avec 10 L Dih 2 O; agiter jusqu'à dissolution; ajuster le pH à 7,4; filtre stérile

Tableau 1: Solutions requises pour décellularisation tissulaire. Faire les solutions ci-dessus pour le processus de décellularisation. Conserver à 4 ° C. Environ 2,5 L sera nécessaire pour un poumon porcin.

1. Formation Hydrogel

  1. Porcine Lung décellularisation (adapté des références 9,10)
    1. Obtenir un en bloc poumon porcin normal, d'un abattoir, avec le coeur et Vasculature intacte.
    2. Utilisez des ciseaux de tissu ou un scalpel pour disséquer le cœur, vasculature aussi près que possible au cœur de coupe, restant vasculature sera utilisé dans les étapes ultérieures pour perfusion.
    3. disséquer soigneusement l'écart du tissu conjonctif autour de la trachée, des bronches et du système vasculaire en utilisant un scalpel ou de ciseaux.
      NOTE: Déterminer le meilleur poumon à utiliser pour le reste de la procédure en choisissant un poumon sans grandes coupures ou piqûres à travers la plèvre et de grandes quantités de atélectasie ou une occlusion vasculaire qui peuvent entraver l'efficacité du processus de décellularisation.
    4. Coupez le poumon suboptimale laissant autant bronchus attachés à la trachée que possible (coeur, du tissu conjonctif et les lobes du poumon enlevé peuvent être éliminés). Il devrait y avoir un poumon restant attaché à la trachée et de la vascularisation.
      NOTE: Maintenir les sections pour l'histologie, si désiré. 9
    5. Fermez les bronches déconnectées avec des pinces ou suture à pDisconnecteur excès revent.
    1. Préparer les solutions de décellularisation et réfrigérer à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire (tableau 1).
    2. L'utilisation d'une pompe à main canulée pour adapter l'artère pulmonaire, perfuser le tissu pulmonaire 3 fois avec de l'eau DI à la fois par l'artère pulmonaire et de la trachée. Perfuser vasculature premier à chaque fois. Commencer avec environ 1 L dans le système vasculaire et 1,5 L dans la trachée pour chaque perfusion, mais que les débris cellulaires sont éliminés plus liquide peut être perfusée à travers le système.
    3. Perfuser à la fois le système vasculaire et de la trachée avec du Triton X-100 solution.
    4. Immerger le tissu pulmonaire dans Triton X-100 solution pendant 24 heures à 4 ° C.
    5. Perfuse vascularisation et la trachée 3 fois avec de l'eau déminéralisée pour rincer.
    6. Perfuser à la fois du système vasculaire et de la trachée avec une solution de désoxycholate.
    7. Immerger les coupes de tissus en désoxycholate pendant 24 heures à 4 ° C.
    8. Perfuse vascularisation et la trachée 3 fois avec de l'eau déminéralisée pour rincer.
    9. Perfuser deux vascularisation et de la trachée avec une solution de NaCl.
    10. Immerger tissu dans une solution de NaCl filtrée pendant 1 h à 4 ° C.
    11. Perfuse vascularisation et la trachée 3 fois avec de l'eau déminéralisée pour rincer.
    12. Perfuser deux vascularisation et de la trachée avec une solution de DNase.
    13. Immerger le tissu dans une solution de DNase filtrée pendant 1 h à 4 ° C.
    14. Perfuser deux vascularisation et de la trachée 5 fois avec du PBS.
    15. Disséquer loin tissu cartilagineux notable, la trachée et les tubules 2 mm ou plus de diamètre (principalement trouvés autour du hile et des parties médianes des poumons) de mener des voies respiratoires, ne laissant que des zones respiratoires (principalement les zones périphériques).
    16. Disséquer les tissus en 1 sections pouces ou plus petits. Orientation du tissu n'a pas d'importance pour cette étape.
    17. Versez l'excès de tissu liquide et dans 50 ml tubes coniques. Congeler le tissu à -80 ° C.
      NOTE: Retenir les sections pour l'histologie pour assurer l'élimination des cellules et debri cellulaires, si on le souhaite. Nous utilisons H & E, α-galactosidase, PicoGreen, hydroxyproline, ninhydrine, bleu, SDS-PAGE alcian, et la spectrométrie de masse pour caractériser. 9
  2. traitement du poumon
    1. Retirer les couvercles de tubes congelés contenant du tissu pulmonaire décellularisé.
    2. Placer le papier filtre sur l'ouverture du tube et le fixer avec une bande élastique.
      NOTE: Tube et le contenu doivent encore être congelés placer autrement -80 ° C jusqu'à gelé.
    3. Lyophiliser le tissu jusqu'à ce que tout excès de liquide a disparu, en utilisant un lyophilisateur selon les instructions du fabricant. Conserver à -80 ° C jusqu'au moment de l'usine.
    4. Avant de commencer ajouter de l'azote liquide à l'usine de congélation pour refroidir l'isolation et les composants internes à des conditions de travail.
    5. Retirer la barre de moulin magnétique du tube de moulin et ajouter le tissu pour couvrir le fond.
    6. Remplacer la barre de moulin et ajouter le tissu légèrement tassées. Le bar de l'usine doit encore se déplacer librement.
    7. Fermer le tube de moulin et plaCE dans l'usine de congélation.
    8. Remplir l'azote liquide à la ligne de remplissage max.
    9. Moulin à congélateur tous les tissus en poudre fine (environ 5 min, vitesse de ~ 600 min impaction -1), dans un cylindre de polycarbonate avec un impacteur en acier inoxydable, ainsi que inoxydable bouchons d'extrémité en acier à l' aide de l'usine de congélation selon les instructions du fabricant. Conserver à -80 ° C jusqu'à utilisation.
  3. Micro-poreux de formation de gel (8 mg / ml) (adapté de références 9,11)
    1. Ajouter 1% (p / v) de la poudre décellularisé et 0,1% (p / v) de pepsine à HCl 0,01 M, sous agitation constante (devrait être en mesure de voir couler au plus haut niveau de liquide), à ​​la température ambiante, par 48 h.
      NOTE: La poudre est chargée statiquement, afin d'ajouter l'HCl après que la poudre offre la possibilité de se laver l'excès sur les parois du tube.
    2. Après digestion pendant 48 h, placer la solution et les réactifs sur la glace pendant 5 min.
    3. Réfrigérée en utilisant 10% de NaOH (v / v) de 0,1, und 11,11% (v / v) de 10x PBS (pour amener la solution entière à 1x la concentration), amener solution protéique à digestion pH physiologique de 7,4.
      REMARQUE: La solution peut alors être stockée à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine. Effectuer la cinétique de gélification à l' aide de rhéométrie 9 si on le souhaite.

2. La réticulation hydrogels pour améliorer la résistance mécanique

  1. Des solutions de 1%, 0,1% et 0,01% p / v solution génipine de réticulation ont été préparées en dissolvant la quantité nécessaire de poudre génipine dans 10% de DMSO.
  2. Vortexer la solution toutes les 15 minutes pendant 1 heure.
  3. Ajouter une solution genipin pour couvrir hydrogels ECM (100 pi pour chaque puits d'une plaque de 96 puits) qui ont déjà été assemblés en partie 1.3.4.
  4. Laissez chaque hydrogel ECM pour réticuler pendant 24 heures à 37 ° C.
  5. Rincer l'hydrogel ECM 3 fois avec du PBS jusqu'à ce que la solution de lavage est plus bleue. Le hydrogels réticulés seront alors prêts pour une caractérisation et CEétudes de culture ll.

3. Culture cellulaire avec microporeux Gel

  1. Revêtement bidimensionnelle
    1. En utilisant la solution de 1.3.3, ajouter 20 pi de solution de pré-gel dans chaque puits d'une plaque de culture de tissu à 96 puits non traitée.
    2. Réfrigérer pendant une nuit à 4 ° C pour permettre l'adsorption des protéines à l'assiette.
    3. solution Aspirer prégel et rincer avec du PBS.
    4. Cellules Passage 9.
    5. Ajouter 10.000 cellules / cm2 dans des puits.
    6. Augmenter les médias à 100 pi par puits et incuber à 37 ° C.
  2. Trois culture cellulaire tridimensionnelle 9
    1. En utilisant une solution de 1.3.3, resuspendre les cellules sédimentées à une concentration de 1.000.000 cellules / ml d'une solution de pré-gel.
    2. passer rapidement 16 pl de suspension prégel-cellulaire dans chaque puits d'une plaque à 96 puits, pour former un épais hydrogel ~ 500 um pour la culture cellulaire 3D.
    3. Incuber à 37 ° C pendant 30min pour le gel pour former.
    4. Ajouter 100 ul de milieu à haut de hydrogels formés et incuber à 37 ° C.
  3. Trois culture cellulaire dimensions sur des gels de raideur variable
    1. Utiliser une solution de 1.3.3, pipette 100 pi d'une solution de pré-gel dans chaque puits d'une plaque de 96 puits.
    2. Incuber à 37 ° C pendant 30 minutes pour le gel de se former.
      Remarque: Cross-linking étapes de la partie 2 peuvent être utilisés ici.
    3. Cellules Passage 9.
    4. Ajouter 10.000 cellules / cm2 dans des puits.
    5. Augmenter les médias à 100 pi par puits et incuber à 37 ° C.

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Résultats

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En utilisant cette méthode, nous avons produit des hydrogels de porc normale, rat, et les poumons de souris (Figure 1). poumons transformés fournissent environ 5 mg, 40 mg et 10 g de poudre ECM respectivement. Un aperçu du procédé est représenté sur la figure 2. visualisations clé au cours du processus comprennent: aspect blanc des poumons après le rinçage désoxycholate; après la formation de pré-gel, une solution doit être opaque et la solution doit app...

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Discussion

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Un des aspects les intégrales de la biologie est l'auto-organisation des molécules dans les structures hiérarchiques qui effectuent une tâche spécifique. 13 En laboratoire, l' auto-assemblage dépend de nombreux facteurs tels que la concentration en sel, le pH et la durée de digestion. Comme le montre, il se forme d'hydrogel auto-organisation lorsque les protéines solubilisées retour à une température physiologique. L'hydrogel formé est capable de favoriser l' attachement et la prolifératio...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

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Nous tenons à remercier les fermes de Smithfield pour le don du tissu pulmonaire porcin intact. Nous tenons également à remercier le Dr Hu Yang, le Dr Christina Tang et le département de chirurgie plastique VCU pour nous permettre d'utiliser leur équipement. échantillons hydrogels et de tissus ont été préparés pour SEM au Département VCU d'anatomie et de l'installation de neurobiologie Microscopie pris en charge, en partie, grâce au financement du NIH-NINDS Core Center Grant 5 P30 NS047463 et, en partie, par la forme de financement du NIH-NCI Cancer Support Center Grant P30 CA016059. SEM imagerie d'échantillons à l'installation de base Caractérisation VCU Nanotechnology (CCN). Ce travail a été financé par la National Science Foundation, CMMI 1351162.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Triton X-100  ;Fisher ScientificBP151-100À utiliser dans la hotte avec des lunettes de protection et des gants.
Désoxycholate de sodiumSigma-AldrichD6750-100gÀ utiliser en cagoule avec protection oculaire et gants.
Sulfatede magnésium Sigma-AldrichM7506-500gAucun
Chlorurede calcium Sigma-AldrichC1016-500gAucun
DNaseSigma-AldrichD5025-150KUAucun
HClSigma-Aldrich258148-500MLÀ utiliser avec des lunettes de protection et des gants.
PepsinSigma-AldrichP6887-5GÀ utiliser dans une hotte avec des lunettes de protection et des gants.
Hydroxyde de sodiumFisher ScientificBP359-500À utiliser avec des lunettes de protection et des gants.
GenipinWako Chemicals078-03021Utilisation dans la hotte avec protection oculaire et gants.
PBS 10xQualité Biologique119-069-151Aucun
PBSVWR45000-448Aucun
Papier filtreWhatman8519N/A
Pompe à mainFisher Scientific10-239-1N/A
Bécherdiplômé VitLab445941N/A
CryomillSPEX6700Utiliser des cryogants et un œil protection.
LyophilizerFTS FlexiDryUtilisez des gants.
RhéomètreDiscoveryHR-2Utilisez des gants et des lunettes de protection.

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, J., Cuddihy, M., Kotov, N. Three-Dimensional Cell Culture Matrices: State of the Art. 14, (2008).
  2. Haycock, J. W. 3D Cell Culture. , Humana Press. (2011).
  3. Walker, J. M., Ed, Epithelial cell culture protocols. , Humana Press: Springer. New York: New York. (2012).
  4. Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta Biomater. 5 (1), 1-13 (2009).
  5. Koo, H. -J., Lim, K. -H., Jung, H. -J., Park, E. -H. Anti-inflammatory evaluation of gardenia extract, geniposide and genipin. J. Ethnopharmacol. 103 (3), 496-500 (2006).
  6. Jeffords, M. E., Wu, J., Shah, M., Hong, Y., Zhang, G. Tailoring Material Properties of Cardiac Matrix Hydrogels to Induce Endothelial Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 11053-11061 (2015).
  7. Suckow, M. A., Voytik-Harbin, S. L., Terril, L. A., Badylak, S. F. Enhanced bone regeneration using porcine small intestinal submucosa. J. Invest. Surg. 12 (5), 277-287 (1998).
  8. Brown, B. N., Badylak, S. F. Extracellular matrix as an inductive scaffold for functional tissue reconstruction. Transl. Res. J. Lab. Clin. Med. 163 (4), 268-285 (2014).
  9. Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. J.Biomed.Mater.Res.A. , (2016).
  10. Price, A. P., England, K. A., Matson, A. M., Blazar, B. R., Panoskaltsis-Mortari, A. Development of a decellularized lung bioreactor system for bioengineering the lung: the matrix reloaded. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2581-2591 (2010).
  11. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
  12. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS One. 5 (9), e12905(2010).
  13. Ratner, B. D., Bryant, S. J. Biomaterials: where we have been and where we are going. Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 41-75 (2004).
  14. Fridman, R., Benton, G., Aranoutova, I., Kleinman, H. K., Bonfil, R. D. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nat Protoc. 7 (6), 1138-1144 (2012).
  15. Zhang, W. -J., et al. The reconstruction of lung alveolus-like structure in collagen-matrigel/microcapsules scaffolds in vitro. J. Cell. Mol. Med. 15 (9), 1878-1886 (2011).
  16. Booth, A. J., et al. Acellular Normal and Fibrotic Human Lung Matrices as a Culture System for In Vitro Investigation. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 186 (9), 866-876 (2016).
  17. Matsuda, A., et al. Evidence for human lung stem cells. N. Engl. J. Med. 364 (19), 1795-1806 (2011).
  18. Zuo, W., et al. p63+Krt5+ distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517 (7536), 616-620 (2015).
  19. Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
  20. Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).

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Mots-clés

Formation d hydrogelTechnique de d cellularisationCulture cellulaire 3DDigestion la pepsineR ticulation la g nipineTests rh ologiquesEssai d adh sion cellulaireProtocole de lyophilisationProcessus de cryobroyage

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