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Article de méthode

Activation autophagie par exercice aérobie chez la souris

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DOI :

10.3791/55099

⸱

3 février 2017

 , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Northwestern University

Dans cet article

Résumé

l'activation Autophagie est bénéfique dans la prévention d'un certain nombre de maladies. L' une des approches physiologiques pour induire autophagy in vivo est un exercice physique. Ici, nous montrons comment activer l'autophagie par l'exercice aérobie et de mesurer les niveaux de l'autophagie chez les souris.

Résumé

L’autophagie est une voie de dégradation lysosomale essentielle à l’homéostasie, à la fonction et à la différenciation cellulaires. Dans des conditions de stress, l’autophagie est induite et cible diverses cargaisons, telles que le cytosol en vrac, les organites endommagés et les protéines mal repliées, pour la dégradation dans les lysosomes. Les molécules nutritives résultantes sont recyclées dans le cytosol pour la synthèse de nouvelles protéines et la production d’ATP. La régulation positive de l’autophagie a des effets bénéfiques contre la pathogenèse de nombreuses maladies, et des stratégies pharmacologiques et physiologiques pour activer l’autophagie ont été rapportées. L’exercice aérobique a récemment été identifié comme un inducteur d’autophagie efficace dans plusieurs organes chez la souris, notamment les muscles, le foie, le cœur et le cerveau. Ici, nous montrons des procédures pour induire l’autophagie in vivo par un exercice forcé sur tapis roulant ou une course volontaire à la roue. Nous démontrons également des méthodes microscopiques et biochimiques pour analyser quantitativement les niveaux d’autophagie dans les tissus de souris, en utilisant les protéines marqueurs LC3 et p62 qui sont transportées et dégradées dans les lysosomes avec les autophagosomes.

Introduction

L' autophagie est une voie de dégradation évolutivement conservée, qui est induite en réponse à diverses conditions de stress telles que la famine et de l' hypoxie 1, 2. Pendant l' autophagie, vésicules à double membrane, appelée autophagosomes, incorporer des composants subcellulaires inutiles ou endommagées et de les transporter dans les lysosomes de la dégradation 3. Autophagy basal est essentielle pour la fonction cellulaire et le développement de l' organisme, et une altération autophagy de base est impliqué dans de nombreux troubles, y compris la neurodégénérescence, la tumorigenèse et le diabète de type 2 4, 5, 6.

L'autophagie inducteur physiologique le plus connu est la famine. Cependant, il a deux limitations majeures. Tout d' abord, la faim prend une longue période pour induire efficacement autophagy chez les animaux, par exemple, 48 h de restriction alimentaire chez la sourisdans la plupart des organes. Deuxièmement, la famine induit peine cerveau autophagie, en raison d'un apport d'éléments nutritifs relativement stable dans le cerveau. En effet, il est aussi difficile à détecter par induction autophagy inducteurs à petites molécules, comme de nombreux médicaments ne peuvent pas traverser la barrière hémato-encéphalique. Ainsi, pour mieux analyser la fonction d'activation de l' autophagie dans la pathogenèse de la maladie, nous avons récemment découvert que l' exercice est une méthode physiologique plus puissant pour induire l' autophagie dans un court laps de temps 7, 8, 9. Par rapport à la famine, l'autophagie est effectivement induit en exécutant tapis roulant aussi vite que 30 min. Ainsi, l'exercice est une approche physiologique pratique et puissant pour étudier le mécanisme de l'autophagie dans la médiation de bienfaits pour la santé et la prévention des maladies.

Il existe plusieurs protéines marqueurs pour la détection de l'activité de autophagy, y compris p62 et LC3. LC3 (microtubules protéine associée 1A / 1B c-lumièrehain 3) est une protéine cytosolique (LC3-je forme) qui est conjugué à PE (phosphatidyléthanolamine) lors de l'autophagie induction. LC3 PE-lipidée (formulaire LC3-II) est recruté sur des membranes de autophagosomal et peut être utilisé pour visualiser autophagosomes lorsqu'ils sont marqués avec la GFP. Sa translocation du cytosol vers ponctué structures de autophagosomes en microscopie est une indication de autophagy induction. p62 est un récepteur de chargement pour des substrats de autophagie (telles que les protéines d'ubiquitination) et est incorporé dans autophagosomes aussi. Étant donné que la protéine est dégradée dans les lysosomes ainsi autophagosomes, les niveaux peuvent être utilisés pour mesurer le flux de autophagy. Ici, nous montrons comment utiliser ces marqueurs pour quantifier l'autophagie dans les tissus de souris différents induits par l'exercice aérobie, y compris l'exercice forcé (tapis roulant) et l'exercice volontaire (roues de roulement). Les mêmes procédures peuvent également être appliqués à la mesure in vivo de autophagy après le traitement d'autres inducteurs.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées conformément aux lignes directrices approuvées par le Institutional soin et l'utilisation des animaux Comité Northwestern University (IACUC).

1. Les modèles de souris

  1. Utilisez la souris 8-12 semaines d'âge dans la formation d'exercice. Pour détecter autophagy exercée induite in vivo en utilisant des souris transgéniques GFP-LC3 (C57BL / 6 de fond) pour des études d'imagerie et C57BL / 6 pour des analyses biochimiques.

2. L'autophagie induite par l'exercice

  1. Setup Treadmill - exercice forcé
    1. Acclimate et former les souris sur un tapis roulant vers le haut ouvert 10 ° C pendant 2 jours. Le jour 1, exercer les souris pendant 5 min à 8 m / min, et le jour 2, exercer les souris pendant 5 min à 8 m / min suivi d'un autre 5 min à 10 m / min 10. Encourager les souris à courir par coup de pouce de la main douce.
    2. Sur le 3 ème jour, que les souris soumises à un seul bout de course pour 90 min à 10 ° tapis roulant vers le haut, starting à la vitesse de 10 m / min. Au bout de 40 min, augmenter la vitesse du tapis roulant à une vitesse de 1 m / min, toutes les 10 minutes pour un total de 30 minutes, et ensuite augmenter la vitesse à la vitesse de 1 m / min, toutes les 5 minutes jusqu'à ce qu'il atteigne 17 m / min, pour un total de 90 min de temps d'exercice et 1.070 mètres de distance en cours d'exécution.
    3. Réglez le stimulus électrique à une plage de faible intensité (1,2 Hz), et encourager les souris à courir pour éviter les chocs répétés des pieds.
    4. Pour la collecte des tissus, euthanasier les souris par inhalation isoflurane, suivie par dislocation cervicale immédiatement après l'exercice. D'autres méthodes d'euthanasie approuvées peuvent également être utilisés, tels que le CO2 ou l'injection IP d'autres anesthésiques. Le niveau de l'autophagie ne semble pas être affecté par les méthodes d'euthanasie.
  2. Exécution de la configuration de roue - exercice volontaire
    1. Placez une roue de souris en cours d'exécution (11,4 cm de diamètre) dans une cage avec une souris unique logé.
    2. Vérifiez la capacité en cours d'exécution en utilisant un compteur de vélo.Mettre en place le paramètre de roue [distance (en mm) par rotation complète de la roue] à 358 (11.4 * π). Mesurer la distance de la course après 24 h.
    3. Laissez la souris courir volontairement pendant 2 semaines avec la roue de roulement. Pour la collecte de tissus, sacrifier la souris le matin après la période en cours d'exécution.

3. L'autophagie évaluation Flux

  1. Pour mesurer le flux autophagique dans des conditions de repos et de l'exercice, le traitement des souris avec le chloroquine inhibiteur de l'autophagie pendant trois jours et de les comparer à des souris traitées avec du PBS.
    1. Dissoudre la chloroquine dans du PBS (5 mg / ml), et injecter la chloroquine chez des souris par voie intrapéritonéale à la dose de 50 mg / kg / jour pendant trois jours consécutifs. Sacrifiez souris et de recueillir des tissus 3 heures après la dernière injection.
    2. Pour les souris exercées, prétraiter les chloroquine pendant deux jours consécutifs à la dose de 50 mg / kg / jour. Le troisième jour, l'injection des souris avec la même concentration de chloroquine, et après90 min laisser courir sur le tapis roulant pour un autre 90 min.
    3. Euthanize les souris par inhalation d'isoflurane, suivie d'une dislocation cervicale. Collecter des tissus immédiatement après l'exécution, de sorte que le temps total d'incubation de chloroquine est le même que le contrôle (au repos), la souris (3 h).
      REMARQUE: Vous pouvez également utiliser une seule injection de chloroquine pour déterminer le flux de l'autophagie dans les tissus de la souris.

4. Tissue Récolte et fixation

  1. Avant la récolte de tissus préparer du tampon phosphate salin (PBS) et frais paraformaldéhyde 4% (PFA, prudence: équipement de protection individuelle nécessaire) dans du PBS à un pH final de 7,4. Conserver les deux solutions à 4 ° C.
  2. Remplir 30 ml seringue avec 15 - 20 ml de 4% PFA (pour les souris GFP-LC3). Connectez la seringue avec une aiguille G 20 du cathéter.
  3. Après l'exercice, l'euthanasie les souris par inhalation d'isoflurane, suivie d'une dislocation cervicale.
  4. Placez l'animal sur une surface de travail propre sur sa back. Couper et ouvrir la cavité thoracique en coupant le diaphragme pour exposer le cœur.
  5. Faire une petite incision sur le foie pour laisser le sang sortir, et injecter un total de 15 ml de 4% PFA lentement dans le ventricule droit du cœur via le cathéter, jusqu'à ce que le poumon et le foie se tournent complètement pâle. Perfuser la souris immédiatement après la séance d'exercice, en utilisant une pompe à seringue avec un débit constant de 90 ml / h.
  6. Après perfusion, retirer l'aiguille et de recueillir des tissus d'intérêt (par exemple cerveau 11 et les muscles squelettiques). Pour le muscle squelettique, disséquer les vastus lateralis. En bref, tirer la peau de la jambe vers l' arrière pour exposer les muscles, localiser les quadriceps fémoral 12 et disséquer vastus lateralis, ce qui est le muscle externe fixé à la partie supérieure de l'os fémoral.
  7. Pour plus de fixation et de déshydratation, placer les tissus de souris GFP-LC3 dans 4% PFA pendant 24 heures à 4 ° C, puis de les transférer à 15%saccharose-PBS à 4 ° C pendant une nuit ou jusqu'à ce que les tissus sont installés, puis à 30% de saccharose-PBS à 4 ° C pendant une nuit ou pendant un stockage prolongé. Gardez les échantillons dans l'obscurité, autant que possible, car ils peuvent être sensibles à une forte lumière.
  8. Pour une analyse Western blot casser geler les tissus de souris C57BL / 6 directement dans l'azote liquide, et les stocker à -80 ° C.

5. Analyse d'imagerie de la GFP-LC3 punctas

  1. Processus de tissus
    1. Pré-traiter les tissus (préalablement fixés en PFA et stockés dans 30% de saccharose) dans l'incorporation milieu tel que "composé de température de coupe optimale" (OCT) pendant quelques minutes dans une boîte de Pétri petite étiqueté.
    2. Transférer le tissu dans un cryomoule marqué contenant suffisamment frais OPO pour couvrir le tissu. Orientez la surface sectionnant vers le bas de la cryomoule (section transversale du muscle vastus lateralis et coupe sagittale pour l'hémi-cerveau). Eviter la formation de bulles.
    3. Freeze les échantillons en plaçant le cryomoule pendant quelques minutes dans une glacière en mousse couvert rempli de glace sèche, jusqu'à ce que l'OPO devient blanc. Enveloppez échantillons individuels dans des feuilles marquées, les sceller dans un sac en plastique, et les stocker à -80 ° C pendant une nuit ou plus.
    4. Utilisez un cryostat pour couper des sections échantillons à une épaisseur de 10 pm, et monter les sections sur les diapositives. Stocker les diapositives à -20 ° C, et de toujours garder les lames loin de la lumière chaque fois que possible.
  2. Préparation de diapositives
    1. Retirer les lames du congélateur et les dégeler à la température ambiante. Couvrir la section de tissu avec une goutte de milieu de montage avec DAPI. Placez une lamelle de taille appropriée sur le dessus et d'éviter la formation de bulles.
    2. Utilisez le vernis à ongles pour sceller les bords de la lamelle, laisser le vernis à ongles à sécher dans l'obscurité à la température ambiante, puis stocker les lames dans un récipient étanche à la lumière à 4 ° C, ou procéder à l'imagerie capture de GFP-LC3 lacrymaux.
  3. Quantification de la GFP - LC3 puncta par microscopie à fluorescence
    1. Effectuer la microscopie à épifluorescence, capturer des images dans le même état (exposition et les paramètres) pour tous les échantillons. Pour GFP, utiliser une longueur d'onde d'émission de 525 nm; pour DAPI, utiliser 490 nm. Acquérir au moins dix images par échantillon en utilisant un objectif 60X pour vastus lateralis et la région du cortex frontal du cerveau.
    2. Quantifier le nombre de GFP-LC3 puncta dans une zone de tissu de 2,500 um 2 dans chaque image pour l' analyse statistique, en aveugle pour les groupes expérimentaux. Calculer le nombre moyen de 10 images de chaque échantillon, en utilisant la fonction automatique de mesure de «comte d'objets". Réglages du muscle vastus lateralis sont: Seuil L = 10, H = 200; 2X lisse; 1X propre, et les paramètres pour le cortex frontal du cerveau sont: Seuil L = 11, H = 200; 2X lisse; 1X propre.

6. Analyse par Western Blot des marqueurs sur Autophagie

  1. processus de tissus
    1. Préparer le tampon de lyse: 50 mM de Tris-HCl; NaCl 150 mM; EDTA 1 mM; 1% de Triton X-100; inhibiteur de protéase et un inhibiteur de phosphatase (fraîchement ajoutée).
    2. Enlever le tissu de souris C57BL / 6 de -80 ° C stockage. Couper le tissu musculaire en petits morceaux avec une lame de rasoir avant le processus suivant. Ajouter 800 ul (pour les hémi-cerveau) ou 500 ul (pour vastus lateralis) de tampon de lyse froid à l'échantillon. Homogénéiser l'échantillon à 4 ° C avec un homogénéiseur à vitesse moyenne.
    3. lyser complètement le mélange homogénéisé pendant 30 minutes à 1 heure à 4 ° C avec rotation.
    4. Isoler l'homogénat à 12000 xg pendant 10 min à 4 ° C, jeter le culot, et de recueillir le surnageant dans un nouveau tube.
  2. Analyse de autophagie
    1. Déterminer la concentration en protéines des lysats de tissus à l'aide du kit de dosage BCA Protein selon les spécifications du fabricant. Normaliser chaque échantillonà la même concentration.
    2. Combiner l'échantillon avec le tampon d'échantillon 2 x Laemmli en un rapport de 1: 1, faire bouillir à 95 ° C pendant 5 à 10 min, et de procéder à une analyse Western Blot sur autophagy les marqueurs 13, 14, comme p62 (anticorps anti-p62, dilution 1: 500) et LC3 (anticorps anti-LC3, dilution 1: 500). Faire bouillir les échantillons immédiatement après l'addition du tampon d'échantillon, une incubation plus longue sur la glace peut générer de multiples bandes de dégradés LC3.
    3. Quantifier p62 et LC3 bandes par analyse de densitométrie en utilisant ImageJ, et de normaliser la valeur à la bande d'actine correspondante.

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Résultats

Ce protocole décrit deux méthodes différentes pour induire l'autophagie dans les tissus de souris par l'exercice aérobie: un total de 90 min d'exercice forcé sur un tapis roulant à plusieurs voies procédé par deux jours de acclimation; ou deux semaines d'exercice volontaire sur une roue en cours d'exécution utilisé par les souris logés individuellement. Dans chaque protocole d'exercice, on peut mesurer le flux de autophagy par microscopie à fluorescence et une ana...

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Discussion

L'autophagie est un processus catabolique qui fournit de l'énergie et réduit la cytotoxicité par la dégradation lysosomale des composants du cytoplasme ou organites endommagés. L'étude de l'autophagie est important de comprendre la régulation de l'homéostasie cellulaire et les mécanismes de réponse au stress. De nouveaux modèles et méthodologies émergent dans le domaine de la recherche 15, pour étudier comment l' autophagie altérée contribue à de nombreux processus patholo...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Nous remercions le Laboratoire d’histologie et de phénotypage de souris de l’Université Northwestern pour son soutien technique et son assistance, ainsi que Noboru Mizushima (Université de Tokyo) pour la fourniture de souris transgéniques GFP-LC3. A. R. et C. H. ont été soutenus par les fonds de démarrage de l’Université Northwestern et la subvention des National Institutes of Health (DK094980).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tapis de courseColumbus Instruments150-RM Exer 3/6
Souris Roue de courseSuper Pet100079365diamètre 11,4 cm
OdomètreBellDASHBOARD 100
Pompe à seringueKD ScientificKDS100
Microscope à fluorescenceNikonModèle : microscope inversé ECLIPSE
CryostatLeicaCM 1850UV
HomogénéisateurIKA003737001 / Modèle : T10 Basic S1
ChloroquineCAYMAN CHEMICAL COMPANY14194
ParafolmaldehyeSIGMA-ALDRICHP6148Equipement de protection individuelle requis. Ce produit peut libérer du formaldéhyde, un produit chimique connu pour causer le cancer.
Média de montageVector LaboratoriesH-1200
p62 anticorpsBD Biosciences610833
LC3 anticorpsNovus BiologicalsNB100-2220
2x LaemmliSample Buffer Bio-RadLaboratories 161-0737
ImageJNIH

Références

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