Une seule étape simple protocole Dissection pour Whole-mount Préparation des adultes Drosophila Brains

Résumé

L'adulte drosophile cerveau est un système utile pour l' étude de circuits neuronaux, les fonctions supérieures du cerveau et des troubles complexes. Une méthode efficace pour disséquer tout le tissu du cerveau de la petite tête de mouche facilitera les études basées sur le cerveau. Nous décrivons ici une seule étape simple protocole, de la dissection des cerveaux adultes avec une morphologie bien préservée.

Résumé

Il y a un intérêt croissant pour l' utilisation de drosophile pour modéliser les maladies dégénératives cérébrales humaines, la carte circuitries neuronales dans le cerveau adulte, et d' étudier la base moléculaire et cellulaire des fonctions cérébrales supérieures. Une préparation toute monture de cerveaux adultes avec une morphologie bien conservée est critique pour de telles études sur la base du cerveau entières, mais peut être techniquement difficile et prend du temps. Ce protocole décrit une approche de dissection en une étape facile à apprendre, d'une tête de mouche adulte en moins de 10 s, tout en gardant le cerveau intact attaché au reste du corps pour faciliter les étapes de traitement ultérieures. La procédure permet de supprimer la plupart des tissus de l'oeil et trachéaux normalement associées au cerveau qui peut interférer avec l'étape de formation d'image ultérieure, et met également moins de demande sur la qualité de la pince à disséquer. En outre, nous décrivons une méthode simple qui permet le retournement commode des échantillons de cerveau montés sur une lamelle couvre-objet, ce qui est important pour imager les deux côtés du bpluies avec une intensité de signal similaire et de qualité. À titre d'exemple du protocole, nous présentons une analyse des dopaminergiques (DA) des neurones dans le cerveau adulte de WT (w ¹¹¹⁸⁾ mouches. L'efficacité élevée de la méthode de dissection, il est particulièrement utile pour des études basées sur le cerveau des adultes à grande échelle dans la drosophile.

Introduction

Le organisme modèle drosophile, communément connu comme la mouche des fruits, a longtemps été apprécié pour ses outils génétiques élégants, les temps de reproduction courtes et très conservée voies moléculaires et cellulaires. La mouche des fruits a été employée avec succès pour disséquer les voies de signalisation de base, les mécanismes de mise en forme d'organismes multicellulaires, ainsi que les mécanismes sous - jacents du développement neuronal, les fonctions et les maladies ^1,2. Avec les récents progrès dans les technologies de marquage cellulaire et d' imagerie, le cerveau de la mouche des fruits est devenu particulièrement puissant dans la cartographie fine des circuits neuronaux et à disséquer la base moléculaire et cellulaire des fonctions cérébrales supérieures, telles que l' apprentissage et la mémoire, et le rythme circadien ^{1,3, 4,5,6,7,8.}

Un avantage particulier du système Drosophila est sa taille relativement petite, ce qui permet toute monture préparation et l' examen du cerveau en utilisant un composé régulier ou microscope confocal. This fonctionnalité permet des analyses détaillées anatomiques et fonctionnelles des circuits neuronaux, ou même un seul neurone, au niveau cellulaire et subcellulaire, dans le contexte d'un tissu du cerveau entier, offrant ainsi à la fois une vision globale du sujet étudié et sa géométrie exacte dans l'ensemble cerveau. Cependant, étant donné la taille plutôt miniature du cerveau, il présente également un défi technique efficace de dissection d'un tissu cérébral intact sur le boîtier de protection de la tête d'exosquelette dans une mouche adulte. Diverses méthodes de dissection efficaces et relativement simples ont été décrites en détail, qui impliquent habituellement prudent et pas-sage retrait du boîtier de la tête et les tissus associés , y compris les yeux, de la trachée, et la graisse du cerveau proprement dit ^{9, 10} Ces méthodes de dissection. Microchirurgie placer souvent des exigences plutôt strictes sur la qualité de la pince de dissection, se fondant sur une pince avec de fines pointes bien alignées qui peuvent être facilement endommagés. En outre, comme les cerveaux disséqués sont souvent separated du reste du corps, le cerveau peuvent facilement être perdus au cours des processus de coloration et de lavage ultérieures en raison de leur petite taille et leur transparence dans la mémoire tampon de traitement. Ici, nous décrivons un protocole de dissection une étape relativement simple et facile à apprendre, pour les cerveaux adultes qui maintient les cerveaux disséqués attachés au torse. Le processus de dissection souvent efface facilement loin la plupart des tissus du cerveau associées telles que l'œil et de la trachée et réduit la demande pour les pinces de dissection de bonne qualité.

En outre, lorsque l'imagerie du cerveau au microscope composé fluorescent ou un microscope confocal, la partie du cerveau qui est éloigné de la source de lumière fluorescente produit souvent un signal plus faible et les images moins précises en raison de l'épaisseur du cerveau entier monture. Ici, nous décrivons également une méthode de montage simple qui permet de retournement facile des échantillons du cerveau, ce qui permet l'imagerie pratique des deux côtés du cerveau avec signal similaire intensity et de qualité.

Comme une preuve de concept pour l'application de cette méthode pour étudier le cerveau adulte, nous avons examiné en outre la présence de neurones dopaminergiques dans le cerveau des w ¹¹¹⁸ mouches; un génotype qui est souvent utilisé comme la lignée parentale pour générer des mouches transgéniques et le contrôle de type sauvage dans de nombreuses études de drosophile.

Protocole

1. Solutions utilisées pour Brain Dissection et immunofluorescence

1. Disséquer le cerveau adulte mouche artificielle dans le liquide céphalorachidien (aCSF): 119 mM de NaCl, 26,2 mM de _NaHCO3, 2,5 mM de KCl, 1 mM de NaH ₂ PO _4, 1,3 mM de _MgCl2 et 10 mM de glucose. Avant utilisation, le gaz du LCRa avec 5% de CO _2/95% O ₂ pendant 10 - 15 min et pic avec 2,5 mM de _CaCl2. Stériliser la solution LCRa par filtration à travers un filtre membrane de 0,22 pm.
   Remarque: Magasin LCRa à 4 ° C pour éviter toute contamination bactérienne. Fly cerveaux peuvent également être disséqués dans un tampon phosphate salin (PBS), bien que les comparaisons détaillées des effets des deux solutions de dissection sur la qualité finale des cerveaux disséqués d'imagerie n'a été réalisée.
2. En utilisant 4% de paraformaldehyde (PFA) préparé dans 1 x PBS comme solution fixative, qui est normalement aliquoté et conservé à -20 ° C.
   caution: PFA est toxique et corrosif et doit être manipulé avec précaution.
3. Utilisez 1x PBS pour rincer la PFA à partir des cerveaux et après la dernière étape de lavage, au cours de la coloration immunofluorescente des cerveaux disséqués. Préparer le PBS 1x de 10x PBS solution mère (1,37 M de NaCl, 27 mM de KCl, 100 mM Na ₂ HPO _4, et 18 mM KH ₂ PO _4).
4. Utiliser 0,3% de Tween-20 dans du PBS 1X (1x PBT) pour toutes les étapes ultérieures de lavage au cours de la coloration immunofluorescente des cerveaux disséqués.

2. Microsurgical Dissection des adultes Fly Heads

Remarque: La procédure de dissection est illustré sur la figure 1.

1. Anesthetize les mouches adultes avec le CO _2. En utilisant des pinces, ramasser une mouche et brièvement DEWAX sa cuticule en le plongeant dans 70% d'éthanol pendant 3 - 5 s. Cela garantit que l'absence de bulles adhèrent à la cuticule de mouche lorsqu'il est immergé dans l'LCRa ou d'une solution de dissection PBS 1X.
2. Sous undissection microscope avec une source de lumière à un angle qui ne sera pas bloquée par les mains, réglez l'objectif d'atteindre une vision claire de la mouche (1.2X grossissement). Utiliser une pince à la main non dominante pour immobiliser l'animal , et immerger la volée dans la solution froide de dissection avec son abdomen tournée vers le haut, comme représenté sur la figure 1A.
3. Gardez la pince à 160 - angle de 170 ° par rapport à la plaque de dissection, tout en exerçant une petite force sur l'abdomen de la mouche (illustrée par des flèches sur la figure 1A). Cette étape va immobiliser la mouche et le forcer à déplacer la tête vers l'arrière par 15 - 25 ° tout en prolongeant la trompe vers le haut. Dans le processus, une région souple et translucide de la cuticule, sous les proboscidiens, devrait devenir apparente. Augmenter le grossissement et ajuster le plan focal sur cette région.
   Note: Ne pas tenir la pince trop serré, mais plutôt juste assez ferme pour stabiliserla mouche. Une trop grande force entraînera les organes à l'intérieur de la rupture dans la solution.
4. Utilisez la main dominante pour appuyer sur la pince de dissection afin que ses conseils sont fermés, ce qui va générer une force de résistance légère sur les pointes de la pince, de sorte que la pince surgiront ouverte lorsque la pression de la main de maintien est libéré. Positionner la pince perpendiculairement à la pince de retenue à la volée, comme représenté sur la figure 1B.
   1. Pierce les astuces fermés de la pince de dissection à travers la région souple et translucide de la cuticule sous les proboscidiens, comme illustré par la flèche rouge sur la figure 1B. Il est important de ne pas pénétrer dans la pince trop profondément ce qu'elle touche le cerveau. Le cerveau proprement dit devrait devenir visible. Maintenir une prise stable de la volée avec la main non dominante.
5. Rapidement mais sûrement, libérer les pointes des pinces à dissection par sa propre force et de compter sur l'élan de cette version pour arracher til entoure exosquelette la tête de mouche. Un cerveau intact appropriée devrait devenir visible (tissu blanc immédiatement au- dessus de la pointe de la pince inférieure de la figure 1C) Suivre une ligne imaginaire pour guider l'élan des conseils de pince libérés (illustrés comme les flèches rouges extérieurs illustrés à la figure 1C). Cela permettra d'éliminer en douceur l'exosquelette et la plupart de l'œil du cerveau associée et de la trachée du cerveau. Le moment et la force appropriée appliquée pour ouvrir l'exosquelette dépendra de l'expérience de l'enquêteur.
   Note: Ceci est l'étape la plus critique lors de la dissection. Il est important de compter sur la force naturelle produite à partir de la dynamique de la pince d'ouverture pour enlever l'exosquelette tout en laissant le cerveau exposé reste attaché au reste du corps.
6. Utilisez la pince dans la main dominante pour retirer soigneusement les tissus accessoires résiduels, tels que le trachéale qui apparaît comme des structures de fibres blanches remaining attaché au cerveau. Veillez à ne pas tirer ou endommager le cerveau proprement dit.

3. immunofluorescence des cerveaux

1. Fixer les échantillons de cerveau disséqués avec leurs torses associés dans environ 1 ml de 4% PFA pour 40 - 60 min.
   Remarque: Pour cela et étapes ultérieures, garder les tubes ou les plaques avec des échantillons sur un nutator correctement mélanger les échantillons dans la solution.
2. Rinçage avec 1 ml de PBS 1x par pipetage de la solution vers le haut et vers le bas 3 fois. Veillez à ne pas aspirer les cerveaux loin.
3. Laver 5 fois avec 1x PBT pendant 5 minutes chacun. Gardez les échantillons sur la nutator pendant l'incubation.
4. Incuber avec des anticorps primaires à la dilution O bon / N à 4 ° C.
5. Le lendemain, retirez les anticorps primaires, et laver les échantillons 5 fois avec 1x PBT. Laissez les échantillons pendant 5 - 10 min dans la solution 1x PBT entre chaque lavage. Gardez les échantillons sur la nutator pendant l'incubation.
6. Incuber la laveéchantillons dans des anticorps secondaires appropriés avec la dilution et le temps d'incubation suggéré.
7. Laver les échantillons à six reprises avec 1x PBT avec une incubation de 10 min entre chaque lavage.
   Cette étape est essentielle pour l'élimination des anticorps secondaires liés de façon non spécifique de l'échantillon.
8. Incuber dans une dilution de 1: 10000 à 1 mg / ml de 4 ', 6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans une solution de PBT 1x pendant 30 min. DAPI est un colorant d'ADN qui se lie aux régions à l'ADN et peuvent être utilisées pour révéler la morphologie globale du cerveau.
9. Rincer trois fois avec PBS 1x.
10. échantillons de transfert à un plat de dissection, et séparer les cerveaux des corps dans un plat de dissection en utilisant une pince.
11. Après la coloration et des étapes de lavage, monter les cerveaux entre deux lamelles et placez les lamelles sur le dessus d'une glissière de montage. De cette manière, les échantillons de cerveau peuvent facilement être basculés de sorte que les deux côtés du cerveau peut être imagée avec une intensité de signal similaire.
    Note: Montage du cerveau sur la lamelle plutôt que directement sur la glissière de montage permet le retournement de l'orientation de l'échantillon librement. Le procédé de montage est expliquée plus en détail ci-dessous.
    1. Placez un 18 x 18 mm lamelle sur le dessus d'une glissière de montage. Elargissez l'ouverture d'une pointe de pipette avec une lame et l'utiliser pour transférer le cerveau en solution PBS 1x sur le 18 x 18 mm lamelle.
    2. Placez le cerveau sur le milieu de la lamelle, enlever le liquide autour du cerveau avec une pointe de pipette bien, puis ajouter un autre 20 - 40 pi d'anti-fade milieu de montage (0,2% (p / v) n-propyle gallate dans 99,5 % qualité ACS glycérol) sur le cerveau.
       Remarque: La quantité de milieu de montage ajouté dépend du nombre de cerveaux examinés.
    3. Doucement étaler les cerveaux tout en déplaçant le milieu de montage visqueux vers l'extérieur. Placez une seconde 18 x 18 mm lamelle sur le dessus du cerveau par un premier abaissement de la lame d'un côté jusqu'à ce qu'il soit en contact avecla surface du glissement de montage, puis abaisser lentement l'autre côté pour minimiser le contact du cerveau avec des bulles d'air.
       Remarque: il n'y a pas besoin d'utiliser une pièce d' écartement entre les deux lamelles couvre -objet , le volume du support de montage et le cerveau devraient fournir un espace suffisant pour séparer les deux lamelles.
    4. Autoriser les diapositives à installer. Éliminer l'excès de liquide qui sortent des côtés des feuillets avec un tissu de laboratoire.
    5. Pour éviter que les lamelles avec les cerveaux montés de tomber de la glissière de montage pendant le transport, utiliser un petit morceau de ruban adhésif pour fixer les lamelles à la diapositive de montage.
       Note: Brains montés entre les diapositives peuvent être visualisés immédiatement ou conservés à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine sans perte significative de signal fluorescent, sans qu'il soit nécessaire d'utiliser un produit d' étanchéité pour sceller les diapositives. Pour la conservation à long terme des cerveaux colorés, du côté des deux feuillets peut être scellé with vernis à ongles et stocké dans un congélateur à -20 ° C, bien que les cerveaux colorés pourraient perdre leurs signaux au fil du temps. Ce n'est pas recommandé.
12. Utiliser un microscope composé fluorescent approprié ou microscope confocal à l'image du cerveau.
    1. Tout d'abord, l'acquisition de l'image à partir du côté du cerveau plus proche de l'objectif, puis retourner soigneusement les lamelles pour que les échantillons pris en sandwich au milieu. Cette étape facilite l'acquisition de l'image de l'autre côté du même cerveau.
    2. Utilisez un microscope droit composé fluorescent et un objectif 20X à l' image du cerveau entier (exemples de la figure 2) et un objectif 40X d'images plus petites régions du cerveau, tels que les neurones dopaminergiques dans la région de cluster Paired Anterior Medial (PAM) (exemples sur la figure 3).

Résultats

La figure 1 illustre les principales procédures de cerveau adulte dissection, tel que décrit plus haut Les figures 2 et 3 sont des images représentatives de trois jours d'âge WT. (Génotype: w ¹¹¹⁸⁾ mouche adulte cerveau, qui ont été costained avec un anticorps dirigé contre la tyrosine hydroxylase (TH , coloré en rouge sur la figure 2 et blanc sur la figure 3), un marqueur couramment ...

Discussion

Avec un intérêt croissant à l' aide de la drosophile adulte cerveau pour étudier les maladies humaines du cerveau, circuits neuronaux et les fonctions supérieures du cerveau, il est nécessaire de développer des méthodes simples et rapides pour obtenir les cerveaux des mouches intactes pour toute monture d' analyses, ce qui est particulièrement important pour les Large- l'échelle des écrans à base de cerveau. Notre méthode fournit un moyen simple et facile à apprendre approche de disséquer une tête d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
w* ;   ; park&Delta ; 21/TM3,  ; P{GAL4-Kr.C}DC2,  ; P{UAS-GFP. S65T}DC10,  ; Sb1	Bloomington Drosophila Stock Center	51652	Balancer a été remplacé par TM6B
PBac{WH}parkf01950	Exelixis à Harvard Medical School	f01950	Balancer a été remplacé par TM6C
NaCl	Fisher Scientific	S640-500
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)  ;	Fisher Scientific	02-003-990
Chlorure de potassium (KCl)	Fisher Scientific	BP366-500
Phosphate monobasique monohydraté (NaHCO3)	Fisher Scientific	02-004-198
Chlorure de magnésium (MgCl2)	Fisher Scientific	02-003-265
D-Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-500G	Remplace le chlorure
calcium dihydraté (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670-500G
EMD Millipore  ; Filtres à membrane PVDF Durapore : Hydrophile : 0,22 & micro ; m Taille des pores	Fisher Scientific	GVWP14250
Solution de formol, 10 % (histologique)	Fisher Scientific	SF98-20
Phosphate de potassium, dibasique, poudre, bioréactif ultrapur	Fisher Scientific	02-003-823
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Excelta Pince à épiler de précision avec pointes très fines	Fisher Scientific	17-456-055	Le protocole n’exige pas de pointes très fines.
Anticorps anti-tyrosine hydroxylase	Pel-Freez Biologicals	P40101
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav	The Developmental Studies Hybridoma Bank	Clone 7E8A10
Anticorps secondaire anti-rat IgG (H+L) de chèvre, conjugué Alexa Fluor 647 ThermoFisher	Scientific	A-21247
Anticorps secondaire anti-IgG de lapin (H+L), conjugué Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-11037
Solution DAPI (1 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	62248
Poudre de gallate de propyle	Sigma-Aldrich	P3130-100G
Réactif de glycérol ACS, &ge ; 99.5 %	Sigma-Aldrich	G7893-500ML
Zeiss Axioimager Z1	Zeiss	Quote
	Zeiss	Quote
Zen lite software		Quote