La PCR bloquante de type sauvage suivie d’un séquençage direct offre une méthode très sensible de détection des mutations somatiques à basse fréquence dans une variété de types d’échantillons.
Article de méthode
La PCR bloquante de type sauvage suivie d’un séquençage direct offre une méthode très sensible de détection des mutations somatiques à basse fréquence dans une variété de types d’échantillons.
la détection et l'identification précise des mutations à basse fréquence peut être problématique lors de l'évaluation de maladie résiduelle après le traitement, le dépistage des nouvelles mutations de résistance au cours du traitement, ou lorsque les patients ont peu de cellules tumorales circulantes. PCR blocage de type sauvage suivi par une analyse de séquençage offre une sensibilité élevée, la flexibilité et la simplicité comme une méthodologie permettant de détecter ces mutations à basse fréquence. En ajoutant un oligonucleotide conçu sur mesure d'acide nucléique verrouillé dans une nouvelle ou déjà établie essai de séquençage à base de PCR classique, des sensibilités de l'ordre de 1 allele mutant dans un fond de 1000 WT alleles peuvent être atteints (1: 1000). artefacts de séquençage associés à des événements de désamination généralement trouvés dans des tissus inclus dans la paraffine fixés au formol peut être remédié en partie par l'utilisation de l'uracile glycosylase d'ADN au cours des étapes d'extraction. Le protocole optimisé de détection est spécifique ici pour la mutation MyD88, mais peut servir de modèle pour concevoir toutedosage WTB-PCR. Avantages du test WTB-PCR sur les autres essais couramment utilisés pour la détection de mutations à basse fréquence incluant allèle spécifique PCR et PCR en temps réel quantitative comprennent moins les occurrences de faux positifs, une plus grande souplesse et la facilité de mise en œuvre, et la capacité de détecter à la fois connue et des mutations inconnues.
Le séquençage Sanger a toujours été l'étalon-or dans les tests pour les mutations somatiques connues et inconnues. L' une des limitations de séquençage de Sanger est sa limite de détection (~ 10 - allèle mutant de 20% dans un fond de WT) 1. Ce niveau de sensibilité est inapproprié pour la détection de mutations somatiques de bas niveau qui peuvent être présents dans des échantillons de tissus de patients prémalignes ou avec peu de cellules tumorales circulantes, ou lorsque la moelle osseuse (BM) est inégale. Cela rend également l' évaluation de la maladie résiduelle après le traitement ou la détection des mutations de résistance ém....
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Déclaration éthique: Tous les tests des échantillons humains a été réalisée après obtention de l'approbation Institutional Review Board (IRB).
1. Extraction de l'ADN à partir de tissu FFPE, du sang périphérique et de moelle osseuse Aspirer
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Une vue d' ensemble conceptuelle de WTB-PCR lors de l' extension est présentée sur la figure 1. Étant donné qu'un seul mésappariement de nucleotide dans l'hybride ADN-bloqueur diminue considérablement sa température de fusion (AT m = 20 - 30 ° C), l' amplification de l'allèle WT est bloqué tandis que l' ADN matrice mutant est libre de compléter l' extension 17. De cette manière, l'ADN mutant est ampli.......
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Le dosage WTB-PCR décrit ici utilise un ensemble générique d'amorces avec un oligo blocage conçu pour bloquer l' amplification de l' ADN WT pendant l' extension (Figure 1). Le produit WTB-PCR est ensuite séquencée pour l'analyse mutationnelle. L'utilité de WTB-PCR / Sanger réside dans sa simplicité, de haute sensibilité, et à haut débit. En utilisant les directives décrites ici, la plupart des tests basés sur Sanger existants peuvent être simplement modifiés par l'ajout d'.......
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1,5 ou 2 mL Tubes à centrifuger Safe-Lock | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100 % alcool | VWR | 89370-084 | Qualité histologique ; 91,5 % Éthanol, 5 % Alcool isopropylique, 4,5 % Alcool méthylique |
| 3730XL Séquenceur | ABI | ou équivalent | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Pour la purification PCR à billes magnétiques |
| Aluminium feuilles d’étanchéité | GeneMate | T-2451-1 | Pour PCR et stockage à froid |
| BigDye Terminator v3.1 Kit de séquençage de cycle | Life Technologies | 4337455 | Pour le séquençage bidirectionnel. Avec 5x Centrifugeuse tampon de séquençage |
| Série 5804 | Rotor Eppendorf | A-2-DWP (pour plaque PCR) | |
| Plaque froide pour plaques à 96 puits | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, sans RNAse, eau | |||
| (100 mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 Aimant à jupe latérale | Thermo Fisher Scientific | 12027 | Pour une utilisation dans la purification PCR. |
| Éthanol absolu | Sigma | E7023 | 200 proof, pour la biologie moléculaire |
| Site web Exiqon Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polymérase (5 U/µ ; L) | Roche | 12032937001 | With10x tampon de réaction PCR concentré, avec 20 mM MgCl2 |
| d’électrophorèse | % d’agarose | ||
| GeneRead DNA FFPE | Qiagen | Contient de l’uracile ADN glycosylase nécessaire pour réduire les artefacts de séquençage | |
| Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | Pour le séquençage. |
| LNA oligonucléotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+T+CC/invdT/ (+N = bases LNA) |
| M13-F Séquençage Primer | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R Sequencing Primer | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycleur | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifugeuse Modèle 5430 | Rotor Eppendorf | FA-45-30-11 (pour tubes de microcentrifugation de 1,5/2 mL) | |
| Spectrophotomètre NanoDrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | ||
| PCR | amorce directe IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
| PCR amorce inverse | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR plaques | GeneMate | T-3107-1 | |
| Pipettors | 20, 200, 1 000 & micro ; | ||
| Septa à plaque L, 96 puits | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | Pour l’aspiration BM et le sang périphérique |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | Pour l’analyse de séquençage |
| Panier | |||
| Acétate de sodium (3 M, pH 5,2) ; | Sigma | S7899 | |
| de pipette filtrées stériles | 20, 200, 1 000 & micro ; L | ||
| Thermomélangeur C ; | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Réservoir | ~ 1 000 mL | ||
| Xylène | VWR | 89370-088 | Qualité histologique |
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