Ce manuscrit fournit des protocoles qui utilisent électroporation in utero (IUE) pour décrire la connectivité structurelle des neurones au niveau d'une seule cellule et l'excitabilité des neurones marqués par fluorescence. L'histologie est utilisé pour caractériser dendritique et projections axonales. enregistrement cellules entières en tranches aiguës est utilisée pour étudier l'excitabilité.
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Article de méthode
In Utero électroporation approches pour étudier l'excitabilité des neurones sous - populations et connectivité unicellulaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le système nerveux est composé d'une vaste gamme de types de neurones distincts. Ces sous-populations neuronales se caractérisent, entre autres caractéristiques, leurs morphologies dendritiques distinctes, leurs modèles spécifiques de connectivité axonale, et leurs réponses de tir sélectif. Les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables de ces aspects de la différenciation au cours du développement sont encore mal compris.
Ici, nous décrivons les protocoles combinés pour l'étiquetage et la caractérisation de la connectivité structurelle et l'excitabilité des neurones corticaux. Modification du protocole électroporation in utero (IUE) permet l'étiquetage d'une faible densité de population de neurones. Ceci, à son tour, permet l'identification et le suivi des dendrites et des axones des neurones individuels, la caractérisation précise de l'emplacement laminaire des projections axonales et analyse morphométrique. IUE peut également être utilisé pour étudier les changements dans l'excitabilitéDe type sauvage (WT) ou neurones génétiquement modifiés en le combinant avec l'enregistrement de cellules entières à partir de tranches aiguës de cerveaux électroporation. Ces deux techniques contribuent à une meilleure compréhension de l'accouplement de la connectivité structurelle et fonctionnelle, ainsi que des mécanismes moléculaires qui contrôlent la diversité des neurones au cours du développement. Ces processus de développement ont des implications importantes sur le câblage axonal, la diversité fonctionnelle des neurones, et la biologie des troubles cognitifs.
Introduction
Le développement de structures dendritiques et axonales est une facette importante de la régulation du circuit dans le système nerveux, y compris dans le cortex cérébral. Elle joue un rôle crucial au cours du câblage sélectif des diverses sous-populations neuronales. Un certain nombre de rapports récents ont montré que, en plus de la connectivité, la diversité moléculaire des neurones se traduit par l'acquisition de modes très spécifiques de tir. Cependant, les mécanismes de détermination de l'excitabilité et de la connectivité des sous - types neuronaux distincts au cours du développement, ainsi que leur degré de coordination, sont encore mal compris
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Protocole
Toutes les procédures animales ont été approuvées par la Communauté de Madrid Animal Care et utilisation Comité, conformément à la législation nationale et européenne (PROEX 118/14; 331/15 PROEX). Maintenir des conditions stériles pendant la procédure.
1. In Utero électroporation
NOTE: Ce protocole d'IUE est adapté d'autres qui ont été publiées antérieurement 5, 6, 7. Ce manuscrit décrit un protocole pour l'IUE embryons de E15.5, avec des modifications dans la stratégie de journaliste qui permettent....
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Résultats
Pour caractériser les changements morphologiques des neurones dans le détail et dans le développement, il est essentiel d'étiqueter les neurones à faible densité. Un système Cre-recombinase dilué permet l'expression d'un gène d'intérêt dans une faible densité de population de neurones, de sorte que seuls les neurones qui incorporent cette enzyme expriment la GFP (figure 1A). En utilisant cette stratégie, la couche II-III est ciblé et étiqueté par IUE à E1.......
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Discussion
Ce protocole décrit en détail la façon d'étiqueter les neurones du cortex somatosensoriel de C75BL / 6 souris afin d'analyser leur connectivité et leur excitabilité. En ce qui concerne les méthodes existantes, il permet de visualiser les aspects discriminatoires de la connectivité, tels que le nombre de branches axonales par neurone, leur topographie précise, et leur localisation anatomique. En modifiant la position des électrodes, il est possible de cibler d' autres populations de neurones, telles que le co.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent aucun conflit d'intérêt.
Remerciements
Nous sommes reconnaissants à R. Gutiérrez et A. Morales pour leur excellente assistance technique et à Los Angeles Weiss pour l'édition. CGB est financé par le e Espagnol Ministerio de Ciencia Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Ce travail a été financé par une subvention de la Fondation BBVA et SAF2014-58598-JIN (MINECO) à M. Navarrete et par une subvention de la Fondation Ramón Areces et subventions SAF2014-52119-R et BFU2014-55738-REDT (de MINECO) à M. Nieto.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 | |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 | |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 | |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Carprofène (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP | |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP | |
| Kétamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP | |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP | |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 | |
| Pommade pour les yeux (Lipolac) | Angelini | 65.277 | |
| Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 | |
| Pénicilline-Streptomycine | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| Manche de scalpel # 3 - 12 cm | Outils de science fine | 10003-12 | |
| Lames de scalpel # 10 | Outils de science fine | 10010-00 | |
| Pince Adson dentelée - droite 12 cm | Outils de science fine | 1106-12 | |
| Ciseaux fins trempés - Droits 11 cm | Outils pour les sciences fines | 14090-11 | |
| Ciseaux Mezenbaum-Nelson Courbés L=14,5 cm | Teleflex | PO143281 | |
| Pointes fines et incurvées - Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO | |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Mathieu Porte-aiguilles - Dentelé | Fin Outils scientifiques | 12010-14 | |
| Applicateur AutoClip | Braintree scientific, Inc | ACS ; APL | |
| 9 mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | ||
| 205016 Sutures - Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 | |
| Rasoir électrique ; | Panasonic | ER 240 | |
| Capillaires en verre borosilicaté (100 mm, 1,0/0,58 Diamètre extérieur/intérieur) | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| Tubes d’aspirateur pour pipettes microcapillaires calibrées | Sigma -Aldrich | A5177-5EA | |
| Gaze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 | |
| cotons-tiges (Star cott) | Albasa-Needle | ||
| 25 g (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 | |
| Paraformaldéhyde | Sigma -Aldrich | 158127 | |
| OCT Compound | Sakura | 4583 | |
| Plat de culture tissulaire 100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| GFP Tag Anticorps polyclonal | Thermo Fisher Scientific | A-11122 | |
| Anticorps secondaire, conjugué Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 ; | |
| Sérum fœtal bovin | Thermo Fisher Scientific | 10270106 ; | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Électroporateur ECM 830 ; | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | |
| Électrodes en platine 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 | |
| Microscope ; pour l’imagerie fluorescente - MZ10F | Leica-VIP | ||
| 3000 Vaporisateur isofluorane | |||
| Système de balayage laser | Leica-Axiovert | ||
| 200 Microscope | Zeiss-Cryostat | ||
| - CM 1950 | Leica-P-97 | ||
| Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| Dispositif moléculaire d’analyse softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Dispositifs moléculaires-Logiciel | ||
| d’acquisition (amplificateur MultiClamp 700B) | Dispositifs moléculaires | DD1440A | |
| Micromanipulateur motorisé + Base rotative | Sutter Instrument | MP-225 | |
| Table d’air | Newport-Pompes | ||
| péristaltiques miniatures | WPI | - |
Références
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheri....
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Réimpressions et autorisations
