Synthèse de 1,2-Azaborines et la préparation de leurs complexes protéiques avec T4 lysozyme Mutants

Résumé

Un protocole pour la synthèse des 1,2-azaborines et la préparation de leurs complexes protéiques avec des mutants de lysozyme T4 est présenté.

Résumé

Nous décrivons une synthèse générale de 1,2-azaborines à l’aide de techniques standard sans air et d’une préparation de complexes protéiques avec des mutants de lysozyme T4 par diffusion de vapeur. Les composés sensibles à l’oxygène et à l’humidité sont préparés et isolés sous atmosphère inerte (N₂) à l’aide d’un collecteur de gaz sous vide ou d’une boîte à gants. À titre d’exemple de synthèse de l’azaborine, nous démontrons la synthèse et la purification de la N-H-B-éthyl-1,2-azaborine volatile par une séquence en cinq étapes impliquant la distillation et la chromatographie sur colonne pour l’isolement des produits. Les mutants T4 du lysozyme L99A et L99A/M102Q sont exprimés avec la souche RR1 d’Escherichia coli. Les protocoles standard de lyse chimique cellulaire suivie d’une purification à l’aide d’une colonne d’échange d’ions carboxyméthyle permettent d’obtenir des protéines d’une pureté suffisamment élevée pour la cristallisation. La cristallisation des protéines est réalisée à différentes concentrations de précipitant à différentes plages de pH en utilisant la méthode de diffusion de vapeur de goutte suspendue. La préparation complexe avec les petites molécules est réalisée par la méthode de diffusion de vapeur sous atmosphère inerte. L’analyse par diffraction des rayons X du complexe cristallin fournit des preuves structurelles sans ambiguïté des interactions de liaison entre le site de liaison des protéines et les 1,2-azaborines.

Introduction

Le bore-azote contenant des hétérocycles (ie 1,2-azaborines) ont récemment attiré l' attention significative en tant isostères de arenes. Cette isosterism peut conduire à la diversification des motifs structurels existants pour élargir l'espace chimique ^{2, 3, 4.} Azaborines ont une utilité potentielle pour les applications en recherche biomédicale , ^{5, 6, 7, 8,} en particulier dans le domaine de la chimie médicinale dans laquelle les....

Protocole

NOTE: Toutes les manipulations oxygène et sensibles à l' humidité ont été effectuées sous atmosphère inerte (N ₂₎ en utilisant soit des techniques libres d'air standard ou une boîte à gants. THF (tétrahydrofuranne), _Et2O (éther diéthylique), un groupe CH ₂ Cl ₂ (dichlorométhane), le toluène et le pentane ont été purifiés par passage à travers une colonne d'alumine neutre sous argon. L' acétonitrile a été séché sur _CaH2 (hydrure de calcium) et distillé sous atmosphère d'azote avant l'emploi. Pd / C (palladium sur charbon) a été chauffé sous vide poussé à 100 ° C pendant 12 h avant utilisati....

Résultats

La voie de synthèse schématique pour le 1,2-azaborines est représenté sur la figure 1. Ce protocole applicable à la synthèse de cinq molécules du bore contenant de l'azote différentes. La figure 2 représente les spectres ¹¹ RMN B mesuré au cours de l' étape 1.3 pour suivre la formation du produit désiré (3). La purification des protéines a été réalisée en utilisant un système de Chromatographie à basse pression et un c.......

Discussion

Dans la première partie de ce protocole, nous avons décrit une synthèse modifiée de 1,2-azaborines basés sur des méthodes précédemment rapportées ^{12, 13.} Triallylborane ²² a été utilisé comme un substitut pour les routes à l' aide de allyltriphenyl étain ou potassium allyltrifluoroborate pour préparer N -allyl- N -TBS- B chlorure de produit d' addition (1). Cette méthode permet une appro.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tétrahydrofurane (THF), sans inhibiteur, pour HPLC, &ge ; 99,9 %	Sigma Aldrich	34865
Éther diéthylique (Et2O), pour HPLC, &ge ; 99,9 %, sans inhibiteur	Sigma Aldrich	309966
chlorure de méthylène  ; (CH2Cl2), (stabilisé/certifié ACS)	Fisher	D37-20
toluène	Fisher	T290-4
pentane, HPLC	Fisher	P399-4
acétonitrile	Fisher	A21-4
hydrure de calcium (CaH2), qualité réactif, 95 %	Sigma Aldrich	208027
Palladium pyrophorique sur charbon actif (/C), 10 % en poids	Strem	46-1900
1,0 M Solution de trichlorure de bore dans	de l’hexane Sigma Aldrich	211249	hautement toxique/pyrophorique
, &ge ; 99,5 %	Sigma Aldrich	471283
Grubbs 1st génération	materia	C823
Acétamide	Sigma Aldrich	A0500
n-Butanol, anhydre, 99,8	Sigma Aldrich	281549
solution d’éthyllithium , 0,5  ; M dans benzène/cyclohexane	Sigma Aldrich	561452	hautement toxique / pyrophorique
, 2,0 M dans Et2O	Sigma Aldrich	455180
2-Méthylbutane, anhydre, &ge ; 99 %	Sigma Aldrich	277258
Escherichia coli, (Migula) Castellani et Chalmers (ATCC® ; 31343&trade ;)	ATCC	31343
Lysozyme T4 WT* (L99A)	Addgene	18476
Lysozyme mutant T4 (S38D L99A M102Q N144D)	Addgene	18477
Sel sodique d’ampicilline	Sigma Aldrich	A0166
isopropyl-&beta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  ;	Invitrogen	AM9464
Phosphate de sodium monobasique anhydre	Fisher	BP329
Phosphate de sodium dibasique anhydre	Fisher	BP332
Chlorure de sodium	Fisher	S642212  ;
Acide éthylènediaminetétraacétique	Fisher	BP118
Chlorure de magnésium	Sigma Aldrich	M4880	Corrosif
Thermo scientific perce, DNaseI	Fisher	PI-90083
GE Healthcare  ; Média d’échange cationique à débit rapide Sepharose	Fisher	45-002-931
Tris-base	Fisher	BP152-500  ;
Azoture de sodium	TCI	S0489
2-mercaptoéthanol	Fisher	ICN806443  ;
Sartorius  ; Concentrateurs centrifuges Vivaspin 20	Fisher	14-558-501
Phosphate de potassium monobasique	Sigma Aldrich	P5379
2-Hydroxyethyl disulfure	Sigma Aldrich	380474
N-paratone  ;	Hampton Research	HR2-643
4 Tube à membrane de dialyse RC 12 000 à 14 000 Dalton MWCO  ;	Fisher	08-667F
; Des	Hampton Research		façonnés en boucle
CryoTong	Thermo Fisher		cryogénique
Coot Des			images de densité électronique sont générées à partir du logiciel

, , ,, Triéthylamine catalyseur % Solution de HCl hautement toxique tubes cryogéniques CryoLoop pince