Mesure simultanée de mitochondrial Calcium et mitochondrial potentiel membranaire dans des cellules vivantes par microscopie à fluorescence

Résumé

Les mitochondries peuvent utiliser le potentiel électrochimique à travers leur membrane interne (Δ _Ψm) pour séquestrer le calcium ^{(Ca2 +),} ce qui leur permet de façonner Ca cytosolique ²⁺ de signalisation dans la cellule. Nous décrivons un procédé pour mesurer simultanément les mitochondries ^{Ca2 +} d'absorption et ΔΨ _m dans les cellules vivantes en utilisant des colorants fluorescents et de la microscopie confocale.

Résumé

En dehors de leur rôle essentiel dans la création de l' ATP, les mitochondries jouent également le rôle du calcium local ^{(Ca2 +)} tampons à bien réguler la concentration intracellulaire de ^{Ca2 +.} Pour ce faire, les mitochondries utilisent le potentiel électrochimique à travers leur membrane interne (ΔΨ _m) pour séquestrer le Ca ^2+. L'afflux de ^{Ca2 +} dans les mitochondries stimule trois déshydrogénases limitant la vitesse du cycle de l' acide citrique, ce qui augmente le transfert d'électrons à travers la phosphorylation oxydative (OXPHOS) complexes. Cette stimulation maintient ΔΨ _m, qui est temporairement dissipée sous les ions calcium positifs traversent la membrane mitochondriale interne dans la matrice mitochondriale.

Nous décrivons ici une méthode pour les mitochondries de mesure simultanément Ca ²⁺ d'absorption et ΔΨ _m dans les cellules vivantes en utilisant la microscopie confocale. En perméabilisant les cellules, Ca ²⁺ mitochondrial peutmesurer à l' aide de Ca ²⁺ indicateur fluorescent Fluo-4 AM, avec mesure de ΔΨ _m à l' aide du colorant fluorescent tétraméthylrhodamine, l' ester méthylique, le perchlorate (TMRM). L'avantage de ce système est qu'il existe très peu de chevauchement spectral entre les colorants fluorescents, ce qui permet simultanément une mesure précise de la mitochondrie Ca ²⁺ et ΔΨ _m. En utilisant l'addition séquentielle d'aliquotes de Ca ^2+, Ca ²⁺ absorption mitochondriale peut être contrôlée, et la concentration à laquelle ^{Ca2 +} mitochondrial induit une transition de perméabilité de la membrane et la perte de _m ΔΨ déterminée.

Introduction

Les mitochondries jouent un rôle important dans la régulation de la concentration intracellulaire de ^{Ca2 +} en agissant comme locaux Ca ²⁺ tampons ^1. Ca ²⁺ entre les mitochondries via le uniport Ca ^2+, un processus piloté par le gradient électrochimique qui existe à travers la membrane mitochondriale interne (ΔΨ _m) ^2. Une fois dans la matrice mitochondriale, Ca ²⁺ peut activer la phosphorylation oxydative en stimulant trois déshydrogénases limitant la vitesse du cycle de l' acide citrique ^3. Cette stimulation maintient ΔΨ _m....

Protocole

1. Préparation des cellules

1. Cultiver les cellules sur 10 cm des boîtes de culture cellulaire ou flacons de 75 ^cm2 dans les milieux de culture [10 ml Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco supplémenté avec 5% (v / v) de sérum de veau fœtal (FBS) et 1x pénicilline / streptomycine (p / s )] à 37 ° C / 5% de CO _2.
2. Pour récolter les cellules, retirer le support par aspiration, puis laver avec 5 ml 1x tampon phosphate salin (PBS 1x). Retirer PBS 1x par aspiration, puis ajouter 1,5 ml de 0,25% (p / v) de trypsine / 0,25% (p / v) d' acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et on incube à 37 ° C / 5% de CO ₂ pendant 2 min. ....

Résultats

Nous avons utilisé ce protocole pour examiner les effets d'une mutation MT-ND5 sur la capacité des mitochondries des cellules 143B au tampon augmente en calcium ^12. Dans l'exemple représenté ici, les cellules 143B de commande ont été chargées avec Fluo-TMRM et 4, AM avant de perméabilisation à la digitonine. Après 5 min d'imagerie, huit additions séquentielles d'une dilution 1: 100 de 40 mM de CaCl ₂ exogènes ont été faites, la libre concentrat.......

Discussion

Le calcium joue un rôle important dans de nombreux processus cellulaires, y compris la contraction musculaire, la signalisation neuronale et la prolifération cellulaire ^13. L' augmentation des concentrations de calcium cellulaire sont souvent associés à la demande d'énergie, avec le calcium capable de stimuler directement la phosphorylation oxydative mitochondriale pour augmenter la génération d' ATP ^3. Il est donc essentiel que nous avons la capacité de survei.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu Eagle modifié Dulbecco’s (DMEM)	ThermoFisher	10566016
sérum fœtal bovin (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x pénicilline/streptomycine (p/s)	ThermoFisher	15140122
0,25 % de trypsine/0,25 % d’EDTA	ThermoFisher
lamelle à 8 puits à chambre	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541  ;
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270  ;
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375  ;
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670  ;
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378  ;
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126  ;
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ gratuit Hank' s solution saline tamponnée (HBSS)  ;	ThermoFisher	14175-095
tétraméthylrhodamine, ester méthylique, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acétoxyméthyle ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
diméthylsulfoxyde (DMSO)	ThermoFisher	D12345
cyanure de carbonyle p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonine	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127  ;	ThermoFisher	P3000MP
hémacytomètre	VWR	631-0925
10 cm Boîtes de culture cellulaire	Corning	COR430167
75 cm2 Fioles de culture cellulaire	Corning	COR430641