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En direct d'imagerie cellulaire et l'analyse 3D des antagonistes des récepteurs de type 1a traite des transfectées embryonnaires humaines cellules rénales Utilisation Microscopie confocale

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DOI :

10.3791/55177

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27 mars 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Georgetown University Medical Center, 2Department of Medicine, Georgetown University Medical Center, 3Department of Physics, Georgetown University Medical Center, 4Department of Oncology, Georgetown University Medical Center

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole de cellules d'image exprimant vert fluorescent type récepteurs de l'angiotensine 1a protéine marqués pendant endocytose initiés par le traitement de l'angiotensine II. Cette technique comprend les lysosomes d'étiquetage avec un second marqueur fluorescent, puis en utilisant un logiciel pour analyser la co-localisation du récepteur et lysosome en trois dimensions au fil du temps.

Résumé

Imagerie des cellules vivantes est utilisé pour capturer simultanément des images en accéléré des récepteurs de type angiotensine 1a (AT 1a R) et des compartiments intracellulaires dans des cellules embryonnaires humaines transfectées de rein-293 (HEK) après stimulation par l' angiotensine II (Ang II). Des cellules HEK sont transfectées transitoirement avec l' ADN plasmidique contenant AT 1a R marqué avec le renforcement de la protéine fluorescente verte (EGFP). Lysosomes sont identifiés par un colorant fluorescent rouge. images en direct de cellules sont capturées sur un microscope à balayage laser confocal après stimulation Ang II et analysées par le logiciel en trois dimensions (3D, voxels) au fil du temps. imagerie des cellules vivantes permet les enquêtes sur le trafic de récepteur et évite les facteurs de confusion liés à la fixation, et en particulier, la perte ou le déplacement artefactuelle des récepteurs membranaires EGFP-marqués. Ainsi, les cellules individuelles sont suivies dans le temps, la localisation subcellulaire des récepteurs peut être imagée et mesurée. Les images doivent être acquises sufficiently rapidement pour capter le mouvement des vésicules rapide. Pourtant, à des vitesses d'imagerie plus rapides, le nombre de photons collectés est réduit. Compromis doivent également être prises dans le choix des paramètres d'imagerie comme la taille de voxel afin de gagner de la vitesse d'imagerie. applications importantes de l'imagerie des cellules vivantes sont d'étudier le trafic de protéines, la migration, la prolifération, le cycle cellulaire, l'apoptose, l'autophagie et interaction protéine-protéine et de la dynamique, pour ne citer que quelques-uns.

Introduction

L'objectif global est d'obtenir des données quantitatives dans le temps et l'espace de colocalisation des récepteurs avec des organites intracellulaires spécifiques après un traitement par un agoniste du récepteur. Ainsi, l'objectif immédiat est ici de capturer time-lapse images confocales de lysosomes et un transmembranaire couvrant récepteur dans les cellules de rein embryonnaire humain (HEK) après transfection et à assembler ensuite et analyser les données d'imagerie en 3D pour mesurer quantitativement la distribution du récepteur à lysosomes. Enquête sur le trafic simultané d'un récepteur transmembranaire avec les lysosomes ou d'autres organites durant l'endocytose, lorsqu'il est activé par le ligand du récepteur peut aider à déterminer comment le récepteur transmembranaire est régulée dans des conditions physiologiques et physiopathologiques.

AT 1a R est présumée être dégradée dans les lysosomes après un traitement par Ang II dans le modèle des systèmes de cellules, principalement HEK293 1 , bien que la majorité des receptors sont principalement localisés dans les endosomes multivésiculaires de recyclage pour le recyclage à la suite de la membrane plasmique tandis que la masse du ligand, l' Ang II est dégradé dans le lysosome 2, 3, 4, 5. Plus récemment, Li et al. démontrée en utilisant le transfert d'énergie par résonance Förster (FRET) , et la microscopie de fluorescence d'imagerie à vie (FLIM) techniques qui colocalise AT 1a R (à ~ 10 nm à l' échelle) avec LAMPE1, une protéine de la membrane lysosomale qui suggère qu'au moins une partie du récepteur est ciblé vers et dégradé 6 par les lysosomes. Ces auteurs ont noté que la chloroquine inhibiteur de lysosomale bloqué AT 1a association R-LAMP1 qui est compatible avec les précédents rapports suggérant que l'effet de la chloroquine est de bloquer la fusion des endosomes tardifs ou autophagosomes avec lysosomes. D' autres approches indirectes pour déterminer AT 1a R localization dans les lysosomes ont utilisé bafilomycine, un inhibiteur de lysosomale pour déduire AT 1a R présence dans les lysosomes 3, 4, 5, 6, 7, 8.

imagerie des cellules vivantes évite les effets potentiels de la fixation sur le volume cellulaire et la perte / gradation / redistribution des récepteurs de la GFP chimère. Des études antérieures se sont appuyés sur des cellules fixées afin de déterminer la colocalisation ou de co-occurrence du récepteur avec les lysosomes ou en utilisant des cellules vivantes marquées avec des mères porteuses de liaison aux récepteurs tels que le β-arrestine 1, 2, 3, 4, 5, 6. imagerie des cellules vivantes d'autres GPCR utilisant confocale à disque tournant ou balayage laser point confmicroscopes vecinales équipés de Gaasp ou HYD détecteurs ont permis aux enquêteurs d'observer l'internalisation et la traite des récepteurs dans des cellules individuelles imagées en z-piles à 30 s intervalles 9, 10. Cependant , même lorsque la cellule z-piles vivantes sont rapidement collectées, l' analyse ne peut se produire après la sélection d'un seul plan dans chaque pile, soit en 2D 10. Bien que cela puisse être suffisant pour l' étude du récepteur de kinase GPCR ou tyrosine intériorisé en question, les AT 1a Rs accumule dans des vésicules qui changent la taille et la position au fil du temps et sont donc par nature plus difficiles à échantillonner de manière adéquate à l' aide d' une tranche représentant unique à chaque point de temps. Pour déterminer soigneusement le tracé du étiqueté AT 1a R à travers la cellule et de détecter chaque sous - population de vésicules différentes en taille et position, nous avons mis au point une méthode pour l' imagerie 3D et l' analyse 3D pour suivre ces changements et d'être utilisé en conjonction avec l'étiquetage des différents compartiments intracellulaires tels que les lysosomes.

Les enquêteurs peuvent utiliser ce protocole pour l' imagerie des cellules vivantes pour visualiser directement le mouvement d'AT 1a R dans la cellule et son transfert à compartiments subcellulaires après stimulation Ang II. compartiments subcellulaires sont étiquetés avec des chimères de protéines fluorescentes ou d'autres marqueurs fluorescents. Ce protocole peut également être utilisé comme une première approche pour localiser les récepteurs dans les organites intracellulaires avec une résolution minimale de 200 nm afin de comparer muté par rapport à des récepteurs de type sauvage ou de détecter les changements suivants traitements pharmacologiques. La technique est accessible étant donné qu'il peut être réalisé sur un microscope confocal équipé pour l'imagerie des cellules vivantes. La facilité relative de cette approche contraste avec l' expertise et l' équipement nécessaires à la réalisation de FRET / FLIM / techniques BRET qui détectent les interactions moléculaires 6 accrue,"xref"> 11. Ces mesures définissent des interactions protéine-protéine avec une résolution élevée (~ 10 nm) et la localisation au sein d'organites subcellulaires est inférée. Ces techniques plus avancées sont utilisées pour suivre et mieux définir les interactions moléculaires d'intérêt, plutôt que le passage des récepteurs à travers des compartiments subcellulaires, et ils montrent directement les interactions protéine-protéine à des moments et des endroits spécifiques dans la cellule 11. FLIM, une technique de FRET indépendante de la concentration de l'accepteur, est le plus souvent effectué sur des échantillons fixes depuis l'acquisition d'images est plus lente. En revanche, le ratio FRET fournit l'imagerie rapide et haute résolution colocalisation des protéines interagissant. L'inconvénient de rapport FRET est que l' imagerie utilise épifluorescence Widefield pour gagner de la vitesse d'imagerie et d'inclure toute la cellule, ce qui réduit la résolution et le contraste des organites 12. transfert d'énergie de résonance de bioluminescence (BRET) est un autretechnique avancée qui a été appliquée à des GPCR pour mesurer l'acquisition de la proximité moléculaire 11 au fil du temps. Dans cette technique, un fluorophore protéique est moléculairement divisée et chaque moitié liée à l'une des deux protéines en question. Lorsque les deux protéines d'intérêt se lient les uns des autres, les parties de l'étiquette chimérique ré-assembler pour acquérir la fluorescence et la fluorescence accrue quantifiée au fil du temps.

Ici, nous présentons une technique simple pour l' imagerie des cellules vivantes couplé avec l' image de quantification pour étudier le trafic d'AT 1a R dans la cellule sur Ang II stimulation et le changement potentiel de livraison de intériorisé AT 1a R à lysosomes après stimulation Ang II. L'utilisation finale de cette technique est de caractériser les différences dans le trafic membranaire comparant type sauvage et récepteurs mutés. Ces différences aideront à identifier le mécanisme (s) qui ont un impact des activités physiologiques de AT 1a R leading à la régulation de la pression artérielle.

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Protocole

Jour un

1. Cellule Semis

  1. Préparer Modified Eagle Medium complet de Dulbecco (DMEM). Ajouter 50 ml de sérum bovin foetal, 5 ml de pénicilline / streptomycine, 5 ml de L-glutamine à 450 ml de DMEM pour faire 500 ml de DMEM complet additionné de sérum de veau foetal (10%), de la pénicilline / streptomycine (1%) et la L-glutamine (1%).
  2. cellules de semences humaines embryonnaires de rein (HEK), le numéro de passage 6-11 à 50.000 / puits dans un système 8 coverglass bien chambré en DMEM complet.
  3. Maintenir la lame chambré à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 pendant 24 heures.

Jour deux

2. liposome Transfection

  1. Fraîchement faire AT solutions plasmidiques et liposomes 1a R-GFP en utilisant des conditions stériles avec une armoire de biosécurité de niveau 2.
  2. Diluer 2 ul d'ADN plasmidique à 900 ng uL solution stock / dans 178 ul de milieu de sérum réduit pour obtenir un concentration d'ADN plasmidique d'environ 10 ng / ul.
  3. Diluer 4,5 pi de solution liposome mère dans 175,5 pi de milieu de sérum réduit pour créer une dilution 1:40 du stock.
  4. Ajouter la solution de liposomes à la solution de plasmide et mélanger à l'aide d'une pipette de 1 ml à la pipette vers le haut et vers le bas 20 fois pour mélanger la solution de transfection.
  5. Laisser incuber le mélange pendant 30 min à température ambiante (25-27 ° C).
  6. Bien que ce mélange est en phase d'incubation, retirez le support lentement avec un ml de pipetage 1 et ajouter lentement 400 pi de 1x tampon phosphate salin (PBS) qui est pré-chauffé à 37 ° C.
  7. Retirez délicatement le PBS et le remplacer par 200 ul / puits de milieu sérique réduit pré-chauffé à 37 ° C.
    REMARQUE: Faites attention à toutes les étapes lors du lavage des cellules pour éviter le détachement des cellules de la lamelle en raison de contrainte de cisaillement induite par pipetage.
  8. Maintenir les cellules à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 pendant 30 minutes.
  9. Une fois lapériode d'incubation est terminée, ajouter 80 ul de mélange de transfection à chaque puits et incuber les cellules pendant 4,0-4,5 heures , mais pas plus de 5 h à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2.
  10. Après la période transfection d'incubation est terminée, retirez lentement les médias des chambres en utilisant un mL de pipetage 1 et remplacer doucement avec 300 pl / puits de DMEM complet et incuber les cellules pendant 24 h à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 .

Jour trois

3. Sérum Starvation

  1. Retirez le support doucement à l'aide d'une pipette mL 1 et remplacer lentement avec 300 pi de DMEM sans sérum sans rouge de phénol.
  2. Maintenir la chambre à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 pendant 10 à 12 heures.

Quatrième journée

4. imagerie de cellules vivantes

  1. Compartiments intracellulaires Stain (lysosomes dans ce cas).
    1. About 30 min avant l'imagerie lysosomes dans les cellules, ajouter 22,5 ul d'une fluorescente solution 1 uM de colorant d'actions (0,5 pi de 1 mM colorant fluorescent dilué dans 499,5 pi de DMEM sans sérum sans rouge de phénol) à chaque puits pour une concentration de colorant finale de 75 nM.
    2. Incuber pendant 25-30 min à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2, puis retirez délicatement le colorant et ajouter lentement 300 pi de DMEM sans sérum frais sans rouge de phénol.
  2. Préparer le microscope pour l' imagerie.
    1. Réglez la scène vers le bas pour éviter d'endommager la lentille lors du démarrage d'un microscope automatisé.
    2. Allumez le microscope, la puissance du scanner, la puissance du laser et l'émission laser, et enfin la lampe aux halogénures métalliques pour l'observation visuelle (voir confocale instructions du fabricant de microscope).
    3. Ouvrir le logiciel d'imagerie et dans le tour du logiciel sur l'argon (488 nm), laser et la puissance jusqu'à 30 à 50%. Notez la puissance dépendâge du laser. Dans des expériences, il est crucial de maintenir les paramètres constants.
    4. Allumez laser émettant dans le rouge (par exemple 568 nm ou 594 nm).
    5. Régler le format d'image à une profondeur de 12 bits.
    6. Définir le trou d'épingle de la ligne de laser à l'argon de 488 nm et 568 nm pour le ou 594 nm laser à une unité de disque d'Airy. Si la GFP est très faible, utiliser un paramètre de 2 unités de disque d'Airy, mais correspondent aux canaux de manière appropriée.
    7. Lors de l'utilisation des jeux de filtres dichroïques, sélectionner les longueurs d'onde d'émission appropriés pour la GFP et le colorant fluorescent. Ou régler la longueur d'onde d'émission (Em) à 499-580 nm pour la GFP et Em 599-680 nm pour le colorant fluorescent émettant dans le rouge.
    8. Vérifiez que saigner et croisés ne se produisent pas. Éteignez chaque laser à son tour et vérifier les deux canaux d'émission pour chacun. Lorsque le laser Argon est éteint, l'émission verte doit être nulle. Lorsque le laser émettant dans le vert est éteint, le canal d'émission rouge doit être zéro.
      NOTE: La méthode la plus sûre est de chaque image dans des pistes séparées (Sequtiel).
    9. Inclure un canal de fond clair, si désiré. Éviter l'imagerie par contraste différentiel (DIC), car il peut fausser les mesures de colocalisation.
    10. Pour l'imagerie en direct, sélectionnez séquentielle de ligne plutôt que trame séquentielle.
  3. Sélectionnez les cellules pour l' imagerie.
    1. 1.4 Utiliser une ouverture numérique (NA) objectif, tel qu'un objectif 63X NA / 1,4 d'huile vers les cellules d'image (ou 40X / 1,4 AN). Centrer l'objectif et ajouter une goutte de haute viscosité, huile à faible autofluorescence d'immersion sur l'objectif.
    2. Transférer dans la chambre avec les cellules transfectées de l'incubateur à l'étage du microscope. Veillez à garder les lames plat et veiller à ce que la chambre est bien en place et empêché de mouvement.
    3. Déplacer l'objectif jusqu'à ce que la goutte d'huile touche le fond de la glissière; le plan focal droit est proche de cette position. En microscopes automatiques, enregistrer cette position ainsi que la position abaissée à utiliser pour le remainder de l'expérience d'imagerie pour faciliter le changement d'échantillons.
    4. Choisissez des cellules sombres. Des cellules surexprimant AT 1a R-GFP se détourner du récepteur dans la cellule et perturber le fonctionnement normal.
    5. Assurez-vous que le contour de la cellule, définie par la membrane plasmique, est visible, et de préférence ne se chevauchent pas avec d'autres cellules.
    6. Concentrez et centrer la cellule dans le champ de vision.
    7. Passez en mode confocal.
    8. Sélectionnez un mode d'imagerie rapide. Avec une main sur le contrôle de mise au point et l'autre sur le contrôle XY de la scène, se concentrer et centrer la cellule d'intérêt visualisé sur l'écran.
    9. Assurez-vous que la cellule d'intérêt est bien répartie et son côté inférieur ou ventral juxtaposée étroitement avec la lamelle en se concentrant de haut en bas à travers la cellule.
  4. Réglez les paramètres z-scène à l' image d' une cellule en 3D.
    1. Sélectionnez le bouton pour obtenir le haut Z-stack et le dialogue de fond (ou équivalent) et de se concentrer sur le fond du cell puis appuyez sur «commencer». Ensuite, se concentrer sur le haut de la cellule et appuyez sur «fin». Vérifier que la cellule entière est comprise dans la z pile.
    2. Définissez la taille Z-étape à 1,0 um.
  5. Définir les paramètres d'imagerie.
    1. Sélectionner Zoom 2, en fonction de la lentille, de telle sorte que la taille finale des pixels est d'environ 0,279 um x 0,279 um à 0,14 um x 0,14 pm dans la dimension XY.
    2. Pour les cellules HEK dans cette expérience, régler la vitesse de balayage d'environ 1 ms par voxel et sélectionnez 2 moyenne ou 2 accumulations par ligne, en fonction de la luminosité des cellules.
    3. Ajuster l'intensité du laser et de gagner pour l'imagerie GFP et le colorant fluorescent. En général, contre-colorants seront beaucoup plus lumineux et donc détecteur photomultiplicateur (PMT) et non Gallium arséniure phosphure (Gaasp) ou des détecteurs hybrides (HYD) doit être utilisé pour ce deuxième canal de couleur alors que GASP et HYD détecteurs sont nécessaires pour le canal de la GFP. Si le HYD ou Gaasp détectenteurs sont utilisés pour le colorant fluorescent, exercer la prudence et de commencer avec le laser à une puissance extrêmement faible.
    4. Régler la durée de balayage et la fréquence de balayage, par exemple, plus de 25 min de de chaque 30-60 ou plus pour voir le ciblage des AT 1a R-GFP vers les lysosomes.
    5. Réglez la mise au point automatique pour maintenir la stabilité focale plane au fil du temps.
  6. Commencez l'expérience d'imagerie.
    1. Préparez à l'avance 100x Ang II stock à 5 ug / ul (4,7793 mM) et ajouter 2,1 pi de ce à 998 ul de milieu (10 uM).
    2. Commencer la stimulation du ligand par addition de 3 ul d'une solution mère 100X du ligand (Ang II), le puits contenant 300 ul immédiatement avant la formation d'image (concentration finale 100 nM).
    3. Cliquez sur Démarrer et de l'image en 3D pour le temps et la fréquence souhaitée.
    4. Avant de terminer le travail au microscope, recueillir un z-pile pour une utilisation ultérieure dans la soustraction de fond lors de l'analyse. Dans le mode de comptage de photons, ce ne sont pasnécessaire puisque le fond est essentiellement 0. Avec un éclairage allumé et toutes les autres conditions d'imagerie de la même, mais avec aucun échantillon prendre une image de l'échantillon. Voir Contexte Soustraction (ci-dessous) en cours d'analyse.

Cinquième jour

5. Analyse de l'image

  1. Exporter des images au format TIFF.
    1. Faites un clic droit sur le nom du fichier image pour voir les menus et sélectionnez Exporter ou cliquez sur Fichier | Export | importer.
    2. Exporter au format TIFF pour les analyses ultérieures en veillant à exporter le RAW, les données 12 bits [pas le «Red Green Blue '(RGB) conversion utilisée pour des images de qualité de publication]. Ne pas exporter au format jpeg.
    3. Remarque X, Y, les dimensions des voxels Z et la taille z étape pour une utilisation ultérieure lors de l'analyse d'image. Par exemple, en utilisant un 40X / 1,4. NA un objectif de ces valeurs peuvent être 0,138 um x 0,138 um avec 1 um de taille z-étape (voir les données dans la section des résultats représentatifs).
  2. Créer une pile d'image pour l'analyse.
    1. Logiciel Quantification Ouvrir une image (Figure 2)
    2. Utilisez «Action | Créer un nouveau | Images de séquence sélectionnée" pour générer une image de fichier unique à partir de séquences importées simples (figure 2, flèche n ° 1).
    3. Entrez le nombre de canaux, le nombre de z-sections, et le nombre de points de temps.
    4. En fonction de la structure des fichiers * .tiff, sélectionnez, par exemple, des canaux, plan z, et des points de temps que l'ordre des plans d'image. Vérifiez que la pile de l'image finale représente correctement les canaux de couleur, z-stack, et des points de temps de l'image originale.
    5. Sélectionnez le nom de l' image (Figure 2, mis en évidence le nom de fichier à gauche, flèche n ° 2). Faites un clic droit sur l'image et / ou le champ d'image, et des options en bas de la liste, sélectionnez "Propriétés". Dans le pixel pm pour (X) (Y) et (Z) taille, entrez les propriétés d'image correctes indiquées ci-dessus.
  3. Soustraire fond avant l'analyse de l' image. La correction de fond peut être réalisé dans un logiciel d'analyse d'images. Soustraire fond en utilisant l' une des deux options.
    1. Option 1: Sélectionnez «Action | Créer un nouveau | Contexte Soustraction" (figure 2, flèche n ° 1). Utiliser l'image d'arrière-plan acquis obtenu à la fin de la session d'imagerie décrit ci-dessus comme "Dark Référence" Image sous "Outils | Soustraire Background".
    2. Option 2: Inspecter les zones les plus sombres dans les images où il n'y a pas d'échantillon, trouver le moyen ou maximum la luminosité de pixels dans cette région, sans tenir compte des pixels anormalement brillants qui pourraient être fluorophore parasite, un pixel au hasard lumineux, ou d'un autre phénomène. Sélectionnez "Actions | Créer un nouveau | Contexte Soustraction". Utilisez cette luminosité de pixel (fait négatif) que le décalage.
  4. Vérifiez l' enregistrement des couleurs et corriger si nécessaire.
    1. L' utilisation d' un contrôle positif telles que des microbilles imagées, ou, colocalisés vésicules et colorant fluorescent contenant GFP (Figure 3) évaluer la nécessité d' une correction en passant soit le canal rouge ou verte et hors tension. Visuellement, si l'enregistrement est désactivé, même par 1 pixel, il est évident à l'œil.
    2. Générer une correction de l' enregistrement en sélectionnant "Actions | Créer Nouveau | Correction d'enregistrement" (figure 2, flèche n ° 1) et utiliser la boîte de dialogue pour faire des ajustements. À la fin d'un nouveau élément de dossier apparaîtra intitulé «Correction d'enregistrement".
    3. Appliquer l'inscription à un ou plusieurs des images d'intérêt en cliquant sur le nom de l' image (Figure 2, mis en évidence le nom de fichier à gauche, la flèche n ° 2), puis en sélectionnant «Outils | enregistrement correct" (bouton d'outil adjacent aux actions).
  5. Créer séquence de mesure pour analyser AT 1a R-GFP vésiculaire et de l' intensité de la cellule entière suivantele traitement avec l'Ang II.
    1. Sélectionnez une image (Figure 2, mis en évidence le nom de fichier à gauche, la flèche n ° 2) et d'en tirer une région d'intérêt (ROI) autour d' une seule cellule en utilisant l'outil libre de la région (figure 2, flèche 3 #). Utilisez le mode de mise au point étendue (2D, menu déroulant en haut à gauche) pour observer la cellule comme l'outil de rognage ne fonctionne que dans la visualisation 2D.
    2. Cliquez droit sur l'image et sélectionnez "Découper la sélection" et une nouvelle image objet est généré.
    3. Sélectionnez la cellule recadrée en cliquant sur son nom, puis sélectionnez l'onglet "Mesure" ci - dessus (Figure 2, la flèche n ° 4).
    4. Pour définir et mesurer les vésicules intériorisées pour la GFP, faites glisser "Trouver des objets" sous "Finding" (figure 2, flèche 5 #) dans la boîte de séquence (figure 2, flèche 6 #).
    5. Set "Trouver des objets" Channel au canal de GFP.
    6. Ouvrir les paramètres (de l'icône de roue boîte de dialogue, flèche n ° 6) et réglez4; Seuil en utilisant: "SD et" limite inférieure "à 6. Réglez« taille minimale de l' objet "à 0 pm 3.
      NOTE: La limite inférieure SD dépendra des expériences individuelles. La confirmation visuelle que les objets sont corrects seuillée est faite en examinant les différents points de temps (figure 2, la flèche 7 #). La "mesure | Feedback Options" boîte de dialogue permet de choisir la façon dont les objets sélectionnés seuillées sont visualisées (figure 2, flèche n ° 8).
    7. Cliquez sur "Mesure" dans "Trouver des objets" boîte de dialogue (Figure 2 flèche n ° 6) et sélectionner les canaux et le type de mesures. En règle générale, sélectionnez "Tous les canaux" et "intensité et le volume des mesures».
    8. Pour définir le seuillage et des filtres pour l'identification de l'ensemble de la cellule et de mesurer l'intensité de la GFP totale, répétez les étapes précédentes (5.5.4 - 5.5.8) en utilisant les paramètres suivants: SD 0 et «taille minimum d'objet" à 2 μ; m 3 dans la seconde boîte de dialogue "Trouver des objets" pour identifier les cellules à l' aide de la GFP (Figure 2, flèche 9 #)
    9. Drag "Filtre Population" sous "filtrage" à la boîte de séquence dans la population 2 (la deuxième case "Trouver des objets", la figure 2, flèche n ° 9). Sélectionnez "Volume (pm 3> 100).
    10. assurer visuellement qu'un seul objet est identifié. La cellule entière devrait être seuillée et tous les autres objets filtré loin. Le paramètre "Filter" (s) peut nécessiter un ajustement si la cellule est faible, par exemple.
    11. Une fois que la mesure a été normalisé, sauf le protocole par un clic droit sur l'image et sélectionnez "Enregistrer Protocole" afin de réutiliser ( "Restore Protocol"). Le protocole peut également être exporté pour fournir un enregistrement dans le même sous-répertoire que l'image.
    12. Passer à la "Assurez - mesure" en sélectionnant "Mesures | Faire Point de mesure" (Figure 2 , du n ° 8) ou un clic droit sur l'image et sélectionnez "Make Mesure" et "Tous les timepoints".
    13. Entrez le nom de la mesure correcte (copier coller à partir de l'image est pratique) et le code d'analyse ou la date (un ajout utile pour la tenue des dossiers) et sélectionnez "Tous les timepoints". Un nouvel élément de feuille de calcul sera créé sous l'image. Gardez les noms de fichiers concis.
  6. Analyser et exporter les données.
    1. Cliquez sur le nom du fichier de feuille de calcul et sélectionnez l'onglet "Analyser". Déterminer si voxels saturés sont présents en sélectionnant d'abord "Restreindre l'analyse à:" sélectionner Population 2 (la cellule).
    2. clic droit sur le champ sous l'onglet "Analyser" et dans la boîte de dialogue sous "Analyser ces données:" sélectionner "Max ([canal de couleur de la GFP])"; sous la rubrique «Résumé par:" select "([canal de couleur de la GFP] moyenne", et sous la rubrique «Organiser les données par:" et "Row" select "timepoint" et click "OK".
      NOTE: Si les données contient des pixels saturés (par exemple de 65.536 pour les 16 bits ou 4096 pour 12 bits), l'analyse ne sera pas précis (il sera sous - estimer le contenu vésiculaire). Ignorez cette cellule d'analyse. Si non saturé, passez à l'étape suivante.
    3. Ensuite, sous l'onglet «Raw», puis sous l'onglet «Analyse» et un clic droit sur les données trouver "Restreindre l'analyse à:" puis sélectionnez Population 1 pour vésicules ou Population 2 pour toute la cellule.
    4. Sous "Analyser ces données:" sélectionnez "Somme" (canal de couleur de la GFP); sous "récapitulés par:" select "Sum"; et, sous la rubrique «Organiser les données par:" et "Row", sélectionnez "timepoint" ou "temps relatif" puis cliquez sur "OK". sélections d'analyse peuvent être sauvegardés et réutilisés.
    5. Sélectionner et copier / coller directement à partir du logiciel d'image de quantification à une feuille de calcul vierge ou d'exporter les données de feuille de calcul en cliquant droit sur l'datune sélection et enregistrer en tant que fichier .csv. L'ensemble de mesure de l'intensité de la cellule sera inclus avec les mesures de chaque vésicule dans la population alors assurez-vous d'identifier et de séparer des vésicules.
      NOTE: Après avoir tracé les données, l'augmentation de la fluorescence de la GFP totale contenue dans les vésicules augmente rapidement. Photobleaching, si elle se produit, est détectée comme la perte de totale intensité de la GFP cellulaire au fil du temps.
  7. Créer séquence de mesure pour analyser la GFP présente dans les lysosomes.
    1. Dans les Trouver des objets (Population 1), réglez "Trouver des objets" Chaîne du canal rouge et icône de roue à l' intérieur de cette boîte de dialogue indiquée par la flèche n ° 6 (Figure 2) set "Seuil en utilisant:" SD et "limite inférieure" à 6. Réglez «taille minimale de l' objet" à 0,017 um 3.
      NOTE: La limite inférieure SD dépendra des expériences individuelles. La confirmation visuelle que les objets sont correctes seuillés devrait être faite par examenINING différents points de temps. La "mesure | Feedback Options" boîte de dialogue permet de choisir la façon dont les objets sélectionnés seuillées sont visualisées (figure 2, flèche n ° 8).
    2. Cliquez sur "Mesure" dans "Rechercher" Objets "boîte de dialogue (Figure 2 flèche n ° 6) et sélectionner les canaux et les types de mesures. En règle générale," Tous les canaux "et" intensité et le volume des mesures »sont sélectionnés.
    3. Pour la population 2, les paramètres d'utilisation identiques à celles utilisées pour identifier la cellule entière transfectées exprimant AT 1a R-GFP (5.5.9).
    4. Si plusieurs cellules (y compris des cellules non transfectées avec des vésicules de colorant fluorescent positif) sont présents, de culture de la cellule lors de la première étape de l'analyse est critique. En variante, l'utilisation de «Compartimenter» doit être utilisé pour limiter l' identification des lysosomes dans la cellule transfectée exprimant AT 1a R-GFP. Lysosomes ne doit être identifié dans la cellule de la GFP etpas de cellules voisines, non transfectées.
    5. Analyser et exporter des données comme ci-dessus.
      REMARQUE: Un exemple de cellules et vésicules seuillée est représenté sur la figure 4.

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Résultats

Dans cet ensemble représentatif d'expériences, les cellules HEK ont été transfectées avec le récepteur de l' angiotensine de type 1a (AT 1a R-GFP) construire (E1,2,3-AT 1a R) cloné dans le plasmide pEGFP-N2 13. Images Time-lapse de HEK ont été acquises et joué comme un film (Voir imagerie de cellules vivantes 1 et imagerie de cellules vivantes 2 films). Les films et l...

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Discussion

Des expériences préliminaires présentées ici montrent que sur un parcours de temps assez court de 24 minutes, pas de changement notable dans la livraison d'AT 1a R-GFP aux lysosomes a eu lieu. En général, la livraison des récepteurs internalisés aux lysosomes pourrait se produire dès 15-20 min. Cette expérience est en accord avec l'hypothèse selon laquelle la majeure partie du internalisé AT 1a R est destinée aux grands endosomes périnucléaire. La preuve que certains au moins de R 1a

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Les travaux de recherche présentés dans ce manuscrit a été soutenu par la subvention R01 HL121456-01A1 à Kathryn Sandberg. Ce travail a été soutenu en plus par la disponibilité d'un Leica SP8 AOBS dans le Microscopy and Imaging Shared Resource (MISR) à Georgetown University Medical Center, qui est partiellement financé par P30-CA051008 des National Institutes of Health des États-Unis d'Amérique. Nous tenons à remercier Leica aide d'imagerie SP8 par Peter Johnson, et l'utilisation du Zeiss LSM880 dans le laboratoire de Thomas Coate, Département de biologie de l'Université de Georgetown avec l'aide de l'imagerie fournie par Alma Arnold de Carl Zeiss Microscopie LLC. Le contenu de ce manuscrit est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Angiotensine II (Ang II)Sigma-AldrichA9525  ;
Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM 1x)Gibco -ThermoFisher Scientific11960-044Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation
Sérum fœtal bovin (FBS)Sigma-AldrichF2442Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation
Pénicilline Streptomycine (Pen Strep)Gibco -ThermoFisher Scientific15140-122Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation
L-Glutamine 200 mM (100x)Gibco (technologies de la vie)25030-081Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation
Rein embryonnaire humain (HEK)-293 cellulesAmerican Type Culture Collection (ATCC)  ;CRL-1573Passage numéro 5 - 12
Nunc Lab-Tek II chambré 1.5 Système de verre de protection allemandSigma-Aldrich155409
Lipofectamine 2000 Réactif de transfectionThermoFisher Scientific11668019Store à 4 ° ; C  ;
Opti-MEM, sérum réduit moyenGibco- ThermoFisher Scientific31985-070Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation
PBS 10x  ;Fisher BioReagentsBP3994Chaud en 37 ° ; C au bain-marie avant utilisation
: Milieu Aigle modifié de Dulbecco (DMEM 1x)  ;Gibco -ThermoFisher Scientific31053-028Chaud en 37 ° ; C bain-marie avant utilisation
Sondes moléculaires LysoTracker Red DND-99-ThermoFisher ScientificL7528Stocker les aliquotes dans l’obscurité à -20 ° ; C .  ;
Volocity Ver. 6.3 Logiciel d’analyse d’imagesModules de visualisation et de quantificationPerkinElmerPour l’analyse d’images 3D d’empilements d’images
Leica SP8 AOBS Microscopeconfocal à balayage laserLeica MicrosystemsPour la collecte d’images
Zeiss LSM 880Microscope confocal à balayage laserCarl ZeissPour la collecte d’images

Références

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Mots-clés

Trafic des r cepteurs de l angiotensinecellules HEK 293r cepteurs marqu s la GFPcolocalisation lysosomaleanalyse d images 3Dimagerie en acc l rinternalisation des r cepteursmicroscopie fluorescence

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