L’angiogenèse implique des interactions multicellulaires et multisystémiques qui doivent être étudiées dans un environnement physiologiquement pertinent. L’objectif de cette étude est de démontrer la capacité du modèle de culture de mésentère de rat à faire des comparaisons en time-lapse de réseaux microvasculaires intacts au cours de l’angiogenèse.
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Angiogenèse, définie comme la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants, implique des cellules endothéliales, péricytes, les cellules musculaires lisses, les cellules immunitaires, et la coordination avec les vaisseaux lymphatiques et les nerfs. Le multi-cellulaire, les interactions multi-système nécessite l'enquête de l'angiogenèse dans un environnement physiologiquement pertinents. Ainsi, alors que l'utilisation de modèles in vitro de cultures cellulaires ont fourni des indications mécanistes, une critique commune est qu'ils ne récapitulent la complexité associée à un réseau microvasculaire. L'objectif de ce protocole est de démontrer la capacité de faire des comparaisons time-lapse de réseaux microvasculaires intacts avant et après stimulation de l'angiogenèse dans les tissus mésentère de rat en culture. tissus de culture contiennent des réseaux microvasculaires qui maintiennent leur hiérarchie. marquage immunohistochimique confirme la présence de cellules endothéliales, cellules musculaires lisses et les pericytes, les vaisseaux sanguins et les vaisseaux lymphatiques. Dans unddition, marquage de tissus avec une lectine BSI permet de comparer le temps écoulé des régions du réseau local avant et après la stimulation du facteur de croissance ou du sérum, caractérisé par une augmentation de la germination et de la densité capillaire du récipient. En comparaison avec les modèles de culture cellulaire communs, cette méthode fournit un outil pour les études endothéliales de la lignée cellulaire et évaluation du médicament angiogénique spécifique de tissu dans les réseaux microvasculaires physiologiquement pertinents.
Introduction
La croissance du réseau microvasculaire et le remodelage des dénominateurs communs pour la fonction des tissus, la cicatrisation des plaies, et de multiples pathologies et un processus clé est l' angiogenèse, définie comme la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de ceux qui existent déjà 1, 2. Pour les tissus d'ingénierie de nouveaux navires ou la conception de thérapies angiogéniques, la compréhension de l'importance de la dynamique cellulaires impliqués dans l'angiogenèse est critique. Cependant, ce procédé est complexe. Elle peut varier à des emplacements spécifiques à l' intérieur d' un réseau microvasculaire et implique plusieurs types de cellules ( par exemple les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, des pericytes, des macrophages, des cellules souches) et plusieurs systèmes (réseaux lymphatiques et des réseaux de neurones). Bien que les modèles in vitro ont contribué énormément à l' examen de la relation entre les différentes cellules impliquées dans l' angiogenèse 3, leur pertinence physiologique peut être compromise en raison de Thei r complexité limitée et le fait qu'ils ne reflètent pas étroitement un scénario in vivo. Pour surmonter ces limitations, les systèmes de culture en trois dimensions 3 modèles de tissus, ex vivo 4, les systèmes microfluidiques 5, 6 et 7 modèles de calcul ont été élaborés et mis en place au cours des dernières années. Cependant, il existe encore un besoin d'un modèle avec une capacité time-lapse pour étudier l' angiogenèse dans les réseaux microvasculaires intacts ex vivo. La mise en place de nouveaux modèles time-lapse pour les études de l'angiogenèse avec ce niveau de complexité fournira un outil précieux pour comprendre les mécanismes sous-jacents qui régissent l'angiogenèse et d'améliorer les thérapies.
Un modèle de potentiel qui permet à l'étude ex vivo de l' angiogenèse à travers un réseau microvasculaire intacte est le mésentère modèle de culture de rat> 8. Dans des travaux récents, nous avons démontré que le sang et les réseaux microvasculaires lymphatiques restent viables après culture. Plus important encore, le mésentère modèle de culture de rat peut être utilisé pour étudier les interactions fonctionnelles de péricytes-endothélial cellulaires, le sang et les connexions des cellules endothéliales lymphatiques et imagerie time-lapse. L'objectif de ce document est de fournir notre protocole pour la méthode d'imagerie time-lapse. Nos résultats représentatifs de documenter les multiples types de cellules qui demeurent viables après la stimulation de l'angiogenèse avec du sérum et offrent des exemples d'utilisation de cette méthode pour quantifier les réponses angiogéniques spécifiques de tissus ainsi que des études de suivi des cellules endothéliales.
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Protocole
Toutes les expériences et les procédures animales ont été approuvées par Institutional Care Committee et l'utilisation des animaux de l'Université de Tulane (IACUC).
1. Configuration de la procédure chirurgicale
- instruments autoclaves, des fournitures chirurgicales et les fournitures de culture avant la chirurgie. fournitures chirurgicales pour chaque rat comprennent: 1 drap, 1 drap avec trou prédécoupé (0,5 po x 1,5 po) dans le centre, des tampons de gaze, et 1 underpad absorbant. Les instruments chirurgicaux comprennent: 1 scalpel avec une lame numéro 10, 2 paires de pinces, et une paire de ciseaux fins. fournitures de culture comprennent: 1 drap, 1 paire de pinces, et préparés à 6 puits inserts de plaque avec des filtres en polycarbonate.
- Stériliser une plate-forme en plexiglas, une étape chirurgicale et un espace de paillasse chirurgical avec 70% d'éthanol. Gardez l'étape chirurgicale dans un bol stérile jusqu'à utilisation.
- Créer une étape chirurgicale par le forage d'un environ 2 par 1 dans le trou dans le centre d'une boîte de culture de 100 mm. Ensuite, utilisez du papier de verre pour lisserles arêtes coupantes et ajouter une couche de colle silicone sur les bords du trou pour créer une surface surélevée pour les tissus.
- Vous pouvez également concevoir la scène chirurgicale en utilisant un logiciel de CAO et de faire en 3-D impression (Figure 1).
- Placer un underpad absorbant stérile et posez une plate-forme de plexiglass sur le dessus de celui-ci. Placez le drap, sans un trou pré-coupé, sur un coussin chauffant à côté de la thibaude absorbant.
- Préchauffer une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS), les médias et une solution saline à 37 ° C. La place des médias et du PBS dans des boîtes de culture séparées au sommet du coussin chauffant et lieu de solution saline dans un tube de 50 ml conique à côté de la configuration chirurgicale.
- Assurez-vous que tous les paquets sont ouverts avant le début de la chirurgie pour assurer une manipulation stérile de tous les matériaux. Une liste complète des outils communs utilisés dans cette procédure sont répertoriés dans la Table des matières et outils chirurgicaux spécifiques.
2. MesenterLa récolte de tissus y
- Utiliser des rats adultes mâles Wistar (350 ± 25 g; 6 - 8 semaines d'âge). D'autres souches et l'âge des rats peuvent être substitués.
- Anesthésier le rat par une injection intramusculaire de kétamine (80 mg / kg de poids corporel) et de xylazine (8 mg / kg de poids corporel). Vérifiez que le rat est sous anesthésie par pincement entre les orteils pour vérifier une réponse réflexe; il devrait y avoir aucun. analgésie préemptive pour cette procédure terminal est pas nécessaire.
- Rasez la région abdominale et enlever restante cheveux à l'aide de la crème d'épilation. Essuyer la peau abdominale deux fois avec 70% d'alcool isopropylique suivie povidone-iode. Pour les lingettes, le chirurgien doit commencer au centre du site chirurgical et de se déplacer vers l'extérieur de la zone préparée de manière circulaire pour ne pas recouvrir les zones qui ont été préalablement lavés avec le même morceau de gaze stérile ou un tampon de coton stérile. Puis transfert animal à l'installation chirurgicale stérile et placer au sommet de la plate plexiglassforme.
- En utilisant une lame de scalpel, faire un 0,75 - 1,25 en incision dans l'intestin à partir du 1 au-dessous du sternum. Veillez à ne pas percer l'intestin ou mésentère (1 couche de la peau, 1 couche de tissu conjonctif, et 1 couche de muscle).
- Placez un drap avec un trou pré-découpé sur l'incision et placez un stade chirurgical stérile au-dessus du drap. Assurer l'ouverture aligne avec l'incision. Utiliser des applicateurs de coton-tige stérile pour localiser et extraire l'iléon à travers l'ouverture de scène chirurgicale.
- Tirez 6 - 8 fenêtres mésentériques à travers la scène en utilisant des applicateurs de coton-tige, et faire attention à ne pas toucher les fenêtres (Figure 1). Les tissus sont généralement récoltées à partir de la zone de l'iléon de l'intestin grêle, en commençant près du caecum. Gardez les tissus exposés humide avec une solution saline stérile chauffée au besoin à l'aide d'une seringue stérile au goutte à goutte la solution.
- Euthanasier le rat par injection intracardiaque de pentobarbital sodique (0,2 ml par rat). Avant de me retirerfenêtres senteric, assurent le rat est euthanasié en palpant le cœur; il devrait y avoir aucune impulsion.
- Retirer les tissus mésentère souhaités à l'aide des pinces pour saisir le coussinet adipeux et des ciseaux fins pour couper la fenêtre. Laissez une bordure de graisse (2 mm) autour de la fenêtre. Laver les tissus une fois dans réchauffé PBS stérile et une fois dans les médias.
- Retour iléon extériorisé à la cavité abdominale et de disposer des animaux selon les directives institutionnelles.
3. Mesentery Tissue Culture d'études de time-lapse
- Transfert des fournitures autoclavés de culture (voir section 1.1) et les tissus à une hotte à flux laminaire stérile.
- Utilisez des pinces pour transférer chaque tissu au sommet d'une membrane filtrante de polycarbonate. tissus d'appui par le coussinet adipeux pour éviter d'endommager le système vasculaire.
- répandre rapidement le tissu en utilisant le coussinet adipeux, en faisant attention à ne pas toucher la fenêtre. Inversez l'insert avec le tissu dans le fond d'une plaque à 6 puits et couvrir avec 3 ml de médias (Figure 1 ). média typique utilisé pour cette procédure comprend Essential Media minimum (MEM) avec 1% de pénicilline streptomycine (Penstrep) et 10% de sérum bovin fœtal (FBS). Les médias peuvent être complétés par d'autres sérums et / ou des facteurs de croissance pour stimuler l'angiogenèse.
- Répétez les étapes 3.2 à 3.3 pour chaque tissu et de la culture dans des conditions d'incubation standards (5% de CO 2, 37 ° C) pendant 5 jours.
4. Time-Lapse Imaging de Mesentery Tissue
- Le jour de l'imagerie, de compléter les supports dans chaque puits avec des conjugués BSI lectine et incuber dans des conditions standard de culture pendant 30 min. Laver les tissus à deux reprises avec des médias libres lectine. BSI-lectine tache restera visible sur le tissu mésentère pour 3 jours de culture.
- Transférer la plaque à un étage de microscope. Identifier les vaisseaux sanguins et lymphatiques en fonction de leur morphologie et la structure de réseau.
- Localiser une région de réseau souhaité sur chaque tissu et prendre des images. Prendre note de l'imagerieemplacement pour assurer la même région sera capturé pour les images suivantes. Si vous utilisez une platine motorisée, documenter les coordonnées.
- tissus Retour à l'incubateur et continuer à la culture jusqu'au point final souhaité. Répétez les étapes 4/1 à 4/3, au besoin en fonction des points souhaités de temps expérimentaux.
5. Tissue immunomarquage
- BSI-lectine Étiquetage
- Incuber les tissus pendant 30 min à 37 ° C avec 1:40 lectine conjuguée au FITC dans les médias (solution d'anticorps mL 2,5 par puits dans une plaque de 6 puits) suivie de deux rinçages avec les médias. Pour rinçages, ajouter des médias, puis remplacer immédiatement.
- Étiquetage en direct / Dead
- Incuber les tissus pendant 10 min à 37 ° C avec 1: 500 mM éthidium 2 homodimère-1 et 1: 500 1 mM calcéine AM dans les médias (solution d'anticorps mL 2,5 par puits dans une plaque de 6 puits) suivie de deux rinçages avec les médias.
- BSI-lectine / NG2 Étiquetage
- tissus Spread sur un microscope glissaiente (1 - 2 tissus / slide) et laisser sécher. Retirer l'excès de graisse avec un scalpel en appuyant fermement pour exciser la graisse.
- Fixer les tissus dans le méthanol froid pendant 30 min à -20 ° C. Laver les tissus avec du PBS (3 x 10 mn).
- Pour l'étiquetage des anticorps primaire incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 100 lapin anticorps polyclonaux de NG2 et 5% de sérum de chèvre normal (NGS). Laver les tissus avec du PBS (3 x 10 mn).
- Pour l'étiquetage des anticorps secondaire incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 100 chèvre anti-lapin CY2 conjugué anticorps (GAR-CY2) et 5% NGS. Laver les tissus avec du PBS (3 x 10 mn).
- Incuber les tissus pendant 30 min à température ambiante avec de la lectine 01:40 conjugué au FITC dans du PBS suivi par deux rinçages avec du PBS. Pour rinçages, ajouter du PBS, puis remplacer immédiatement.
- Pour monter les diapositives, couvrir les tissus avec 50:50 PBS et solution de glycérol et lieu lamelle sur le dessus. Sceller les bords de la lame à l'aide de vernis à ongles.
- LYVE-1 / PECAM étiquetage
- Étaler les tissus sur une lame de microscope (1 - 2 tissus / glissière) et laisser sécher. Retirer l'excès de graisse avec un scalpel en appuyant fermement pour exciser la graisse.
- Fixer les tissus dans le méthanol froid pendant 30 min à -20 ° C. Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn).
- Pour le marquage de l'anticorps primaire incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: anticorps monoclonal biotinylé anticorps CD31 200 de souris et 1: 100 polyclonal de lapin LYVE-1 anticorps dans du PBS + 0,1% de saponine + 2% de sérum albumine bovine (BSA) + 5% de NGS . Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn).
- Pour le marquage de l'anticorps secondaire, incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 500 d'anticorps streptavidine conjugué à Cy3 et 1: 100 GAR-CY2 dans du PBS + 0,1% de saponine + BSA 2% + 5% de NGS. Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn).
- Pour monter des diapositives, des tissus de couverture avec 50:50 PBS et de glycérol solution et placer une lamelle sur le dessus. Sceller les bords de la lame à l'aide de vernis à ongles.
- BrdU / BSI-lectine Étiquetage
- Ajouter 1 mg / mL BrdU aux médias et remplacer le support de tissu avec une solution de BrdU. Incuber pendant 2 h à 37 ° C.
- Étaler les tissus sur une lame de microscope (1 - 2 tissus / glissière) et laisser sécher. Retirer l'excès de graisse avec un scalpel en appuyant fermement pour exciser la graisse.
- Fixer les tissus dans le méthanol froid pendant 30 min à -20 ° C. Laver les tissus avec du PBS (3 x 10 mn).
- Dénaturer l'ADN de tissu dans du HCl 2 M pendant 1 h à 37 ° C. Laver les tissus dans du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn).
- Pour le marquage de l'anticorps primaire, l'incubation des tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 100 monoclonal de souris anti-BrdU dans du PBS + 0,1% de saponine + BSA 2% + 5% de NGS. Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn).
- Pour le marquage de l'anticorps secondaire, incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 100 d'anticorps de chèvre anti-souris conjugué à Cy3 (GAM-Cy3) dans du PBS + 0,1% de saponine + BSA 2% + 5% de NGS. Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn).
- Incuber les tissus pendant 30 min à température ambiante avec 1:40 lectine conjuguée au FITC dans du PBS suivi par deux rinçages avec du PBS.
- Pour monter des diapositives, des tissus de couverture avec 50:50 PBS et solution de glycérol et lieu lamelle sur le dessus. Sceller les bords de la lame à l'aide de vernis à ongles.
- BSI-lectine / étiquetage CD11b
- Étaler les tissus sur une lame de microscope (1 - 2 tissus / glissière) et laisser sécher. Retirer l'excès de graisse avec un scalpel en appuyant fermement pour exciser la graisse.
- Fixer les tissus dans le méthanol froid pendant 30 min à -20 ° C. Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn).
- Pour le marquage de l'anticorps primaire incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 100 souris anti-CD11b rat dans du PBS + 0,1% de saponine + BSA 2% + 5% de NGS. Laver les tissus avec du PBS + 0,1% de saponine (3 x 10 mn).
- Pour le marquage d'un anticorps secondaire incuber les tissus pendant 1 h à température ambiante avec 1: 100 GAM-Cy3 dans du PBS + 0,1% de saponine + BSA 2% + 5% de NGS. Laver les tissus avec du PBS+ 0,1% saponine (3 x 10 mn).
- Incuber les tissus pendant 30 min à température ambiante avec de la lectine 01:40 conjugué au FITC dans du PBS suivi par deux rinçages avec du PBS.
- Pour monter des diapositives, des tissus de couverture avec 50:50 PBS et solution de glycérol et lieu lamelle sur le dessus. Sceller les bords de la lame à l'aide de vernis à ongles.
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Résultats
Après 3 jours de culture, les tissus ont été marqués avec un kit mort en direct / viabilité / cytotoxicité pour démontrer la viabilité de la microvascularisation dans le modèle de culture mésentère de rat (figure 2A). La majorité des cellules présentes dans le mésentère est restée viable dans la culture où les cellules endothéliales ont été identifiées en fonction de leur emplacement dans les segments microvasculaires. La prolifération des cellules endothéliales a égalem...
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Discussion
Ce protocole documente une méthode pour utiliser le modèle de culture de mésentère de rat comme un ex vivo outil pour imagerie time-lapse de la croissance du réseau microvasculaire. Des travaux antérieurs dans notre laboratoire a établi l'utilisation de notre modèle pour 1) l' angiogenèse 8, 2) lymphangiogenèse 8, 3) les interactions cellulaires péricytes-endothélial 8, et 4) le dépistage des drogues anti-angiogénique
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la subvention 5-P20GM103629 des National Institutes of Health à WLM et au Tulane Center for Aging. Nous tenons à remercier Matthew Nice pour son aide dans l’édition du texte du protocole.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Drapé | Cardinal Health | 4012 | 12 » x 12 » Bio-Shield Regular Sterilization Wraps Manche de |
| scalpel Instrument | chirurgical Roboz | RS-9843 | Manche de scalpel, #3 ; Solide; |
| Lame chirurgicale stérile | Cincinnati Surgical | 0110 | Acier inoxydable ; Taille 10 |
| Plat de culture (60 mm) | Thermo Scientific | 130181 | 10/Sleeve |
| Graefe Forcep (pince à épiler incurvée) | Instrument chirurgical | Roboz RS-5135 | Micro Pince de dissection ; Dentelé; légère courbe ; Largeur de pointe de 0,8 mm ; |
| Pince Graefe de 4" de longueur (pince à épiler droite) | Instrument chirurgical Roboz | RS-5130 | Micro pince de dissection ; Dentelés, droits ; Largeur de pointe de 0,8 mm ; 4" de longueur |
| Noyes Micro ciseaux | Roboz Instrument chirurgical | RS-5677 | Noyes Micro Dissection Ciseaux à ressort ; pointes droites, acérées et émoussées ; Tranchant de 13 mm ; Largeur de pointe de 0,25 mm, longueur totale de 4 1/2 po |
| Coussinets de gaze | FisherBrand | 13-761-52 | Éponges de gaze de coton non stériles ; 4 po x 4 po Applicateurs à 12 plis |
| pointe de coton | FisherBrand | 23-400-124 | 6 po de longueur ; Manche en bois ; Plaque à usage unique à |
| 6 puits | Fisher Scientific | 08-772-49 | Fond plat avec couvercle à faible évaporation ; Polystyrène; |
| Seringue stérile apyrogène 5 mL | Fisher Scientific | 14-829-45 | embout Luer-Lok |
| Medical Action Industries Inc. | 01232 | Sachet pelable de 32 oz ; Bleu; | |
| plaque stériles à usage unique à 6 puits (inserts CellCrown) | SIGMA | Z681792-3EA | ; |
| membrane filtrante en polycarbonate | SIGMA | TMTP04700 | filtre à membrane isopore ; Polycarbonate; Hydrophile; 5.0 ; et micro ; m, 47 ; mm, White Plain |
| Nom | Entreprise | >Numéro de catalogue | >Comments/Description |
| Beuthanasia | Schering-Plough Animal Health Corp. Union (Commandé auprès de MWI Veterinary Supply) | MWI # : 011168 | Matière active : Par 100 ml, 390 mg de pentobarbital sodique, 50 mg de phénytoïne sodique ; |
| Kétamine | Fort Dodge Animal Health (Commandé auprès de MWI Veterinary Supply) | MWI # : 000680 | Kateset 100 mg/mL |
| Xylazine | LLOYD. Inc. (Commandé auprès de MWI Veterinary Supply) | MWI # : 000680 | Anased 100 mg/mL |
| Saline | Baxter | 2F7122 | |
| PBS | Invitrogen | 14040-133 | |
| MEM | Invitrogen | 11095080 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| BSA | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Saponin ; | SIGMA | S7900-100G | |
| Alcool isopropylique | Fisher Scientific | S25372 | |
| Opéra de povidone et d’iode | 82-226 | ||
| Acide chlorhydrique | SIGMA | 320331 | |
| Méthanol | Fisher Scientific | 67-56-1 | |
| Glycérol | Fisher Scientific | 56-81-5 | |
| FITC conjugué Lectine | SIGMA | L9381-2MG | |
| Anti-NG2 Chondroïtine sulfate Anticorps protéoglycane | SIGMA | AB5320 | |
| Anticorps PECAM (CD31) | BD Biosciences | 555026 | |
| LYVE-1 Anticorps | AngioBio Co. | 11-034 | |
| Anticorps conjugué à Cy2 de chèvre | Jackson ImmunoResearch | 111-585-144 | |
| Anticorps de chèvre anti-souris conjugué à Cy3 | Jackson ImmunoResearch | 115-227-003 | |
| Anticorps conjugué à la streptavidine | Cy3 Jackson ImmunoResearch | 016-160-084 | |
| Kit de viabilité/cytotoxicité vivant/mort | Invitrogen | L3224 | |
| Sérum de chèvre normal ; | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| 5-Bromo-2'-Deoxyuridine | SIGMA | B5002 | |
| Souris monoclonale Anti-Bromodeoxyuridine ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; ; Clone Bu20A | Dako | M074401-8 | |
| souris anti-rat CD11b ; | AbD Serotec | MCA275R |
Références
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Réimpressions et autorisations
