Une cellule de Blood Red Simple Lysis Méthode pour la création de B lymphoblastoïdes lignées cellulaires

Résumé

Une méthode de lyse simple, des globules rouges du sang pour établir B-LCLs a été développé avec une grande efficacité de l'immortalisation, ce qui nécessite une petite quantité de sang et un gain de temps de l'initiation à la cryoconservation.

Résumé

Il existe un certain nombre de méthodes pour la transformation des lymphocytes B par le virus d’Epstein Barr in vitro en lignées cellulaires immortalisées. Nous avons développé une nouvelle méthode avec une stratégie puissante et simple pour la mise en place des B-LCLs, la méthode de lyse des globules rouges. Cette méthode a simplifié la procédure de séparation PBMC avec l’élimination des globules rouges, et a utilisé aussi peu que 0,5 ml de sang total pour établir des lignées cellulaires immortalisées par l’EBV, qui peuvent proliférer jusqu’à un grand nombre de cellules dans un laps de temps relativement court avec un taux de réussite de 100 %. La méthode est simple, fiable, permet de gagner du temps et est applicable au traitement d’un grand nombre d’échantillons cliniques.

Introduction

Les lymphocytes B au repos pourraient être transformés in vitro par le virus d’Epstein-Barr (EBV) en lignées de lymphoblastoïdes B (LCL-B) à prolifération active. Les B-LCL sont similaires aux cellules germinales en termes de différenciation et de développement, et le taux de mutation somatique des B-LCL n’était que de 0,3 %¹, avec une altération génétique et phénotypique négligeable. Par conséquent, les B-LCL, en tant que substituts des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC), ont considérablement accéléré les progrès de l’étude génomique, transcriptomique et protéomique des maladies associées à l’EBV^2,3. De plus, les B-LCL ont également une application importante dans le criblage des anticorps monoclonaux^4,5.

Plusieurs méthodes ont été développées pour l’immortalisation des lymphocytes B par l’EBV. Les procédures les plus courantes comprennent l’isolement des lymphocytes B et l’utilisation de lignées cellulaires B95-8 pour produire de l’EBV infectieux. De l’isolement à la transformation, ces méthodes se déclinent en trois stratégies. Les lymphocytes sont séparés du sang frais par centrifugation à gradient de densité et transformation de l’EBV directement^6-8, appelée méthode de séparation par gradient de densité dans cette étude. Cependant, d’autres techniques surmontent la difficulté d’expédier du sang frais et utilisent une procédure de congélation des lymphocytes purifiés et de décongélation ultérieure et d’infection par^{l’EBV 9-11}. Le sang total cryoconservé peut également être utilisé pour l’isolement et la transformation des lymphocytes B^12,13. En plus de la centrifugation par gradient de densité pour séparer les lymphocytes B, certains chercheurs utilisent un trieur de cellules magnétique pour sélectionner les lymphocytes B¹². Cependant, la séparation magnétique est un processus coûteux, complexe et long. Bien que ces méthodes soient utiles pour immortaliser les lymphocytes B avec un taux de réussite élevé, la nécessité de traiter un grand nombre d’échantillons cliniques et le volume de sang relativement faible nécessitent une méthode plus simple pour l’établissement d’une lignée cellulaire permanente.

Une autre méthode moins couramment utilisée consiste à utiliser le sang total comme source de cellules nucléées pour l’infection par l’EBV et l’établissement de B-LCL. Ces méthodes simplifient la technique en omettant la procédure de séparation. Seule une petite quantité de sang total, qu’il soit frais^ou congelé^15,16, est suffisante pour obtenir les lignées cellulaires. Malheureusement, le succès varie considérablement entre les documents^{15 et 16} et plusieurs de nos tests de validation. De plus, les colonies transformées sont à peine reconnues au microscope en raison des grandes impuretés contaminantes. Ainsi, une méthode de transformation plus fiable est nécessaire.

Sur la base des considérations ci-dessus, nous avons développé une nouvelle méthode pour établir des LCL-B sans purification préalable des lymphocytes, appelée méthode de lyse des globules rouges. Cette méthode est pratique, permet de gagner du temps et s’applique à un grand nombre d’échantillons. Aussi peu que 0,5 ml de sang total a suffi pour obtenir des B-LCL qui sont facilement disponibles chez les nourrissons et les personnes âgées sans nuire de manière significative à leur santé.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le Comité d'éthique de l'Institut de génétique et de biologie du développement, et le protocole suit les directives institutionnelles pour le bien-être humain.

1. Préparation de EB Virus

1. Le jour 1, décongeler les cellules B95-8 et la culture dans 6 ml de milieu RPMI 1640 complet additionné de 10% de sérum bovin fœtal, 2 mM de L-glutamine et des antibiotiques (100 pg / ml de streptomycine, 100 U / ml de pénicilline) dans un T25 flacon de culture. Placer le flacon de culture dans 5% de CO ₂ incubateur à 37 ° C.
2. Le jour 2, observer la morphologie des cellules au microscope. Les cellules sont en bon état quand ils sont lumineux et rond. Ajouter 10 ml milieu RPMI 1640 complet.
3. Le jour 4, ajouter 10 ml frais milieu RPMI 1640 complet, puis transférer dans un flacon de culture T75.
4. Le jour 8, ajouter 20 ml milieu RPMI 1640 complet.
5. Maintenir les cellules pendant 8 jours sans ajouter du milieu frais, à savoir, la famine.
6. Le jour 16, observer les cellulesobservé au microscope. Recueillir les cellules dans un tube de 15 ml centrifugeuse, 12 mL / tube.
7. Cryo-préserver à -80 ° C pendant 1 h, puis décongeler rapidement à 37 ° C. Répéter 3 fois jusqu'à ce que les particules virales sont libérées à partir des cellules.
8. Centrifuger à 240 g pendant 10 min à température ambiante.
9. Filtrer le surnageant à travers un filtre de 0,22 um, aliquote, 12 mL / tube et conserver à -80 ° C.

2. Traitement de sang total avec Red Blood Cell Lysis Buffer

1. Ajouter 0,5 mL de sang total anticoagulé par EDTA · K ₂ à un tube de 15 ml.
2. Mettre 1 ml de tampon de lyse des globules rouges (filtré par filtre de 0,22 um et décongelés à la température ambiante avant utilisation) pour le sang total et bien mélanger. Placer le mélange à température ambiante pendant 4 min. Puis ajouter 5 - 7 ml de PBS 1x rapidement à la réaction d'arrêt.
3. Centrifuger à 240 g pendant 5 min à température ambiante. Les globules blancs précipitent au fond du tube.
4. Jeter le surnageant et laver la précipitation en ajoutant 7 ml 1640 de base. Centrifuger pendant 5 min à 240 xg à la température ambiante. Répéter deux fois.
5. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 300 milieu de transformation ul (milieu RPMI 1640 contenant 20% de sérum de fœtus bovin et 10 ug / ml de phytohémagglutinine (PHA)).

3. EBV Infection

1. Ajouter 60 ul de 20 ug / ml de cyclosporine A (CsA) à la suspension cellulaire.
2. Rapidement dégeler une partie aliquote de l'EBV à 37 ° C. Ajouter 240 ul VEB à la suspension cellulaire.
3. Bien mélanger et placer la suspension cellulaire à une plaque de 96 puits, 200 ul par puits. Pour éviter l'évaporation, ajouter 200 ul PBS 1x à chaque bien autour de la plaque de 96 puits. Placer la plaque dans un incubateur à _CO2 de 5% à 37 ° C.

4. Expansion et Cryoconservation de B-LCLs

1. Changer la moitié du milieu une fois par semaine pour le premier mois après l'infection par l'EBV. Seul un laye épaisr des fragments de cellules est visible au microscope au jour 7 (figure 2). Après un mois de l' infection à EBV, des amas de cellules lymphoblastoïdes sont visibles sous une épaisse couche de fragments de cellules au microscope (Figure 2).
2. Changer la moitié du milieu tous les 3 jours jusqu'à ce que les agrégats de cellules sont bien visibles au microscope (Figure 2). En règle générale, ce processus prend 10 à 20 jours.
3. Après le mélange, pipeter les cellules et transférer à la plaque de 24 puits. Doubler le volume du milieu de culture RPMI 1640 complet pendant qu'elle vire au jaune. Ce processus dépend du taux de croissance cellulaire.
4. Par la suite, transférer les cellules à T25 flacon de culture. Doubler le volume du milieu de culture telle qu'elle vire au jaune jusqu'à ce que le volume du milieu augmente à 10 - 15 ml.
5. Changer moyenne 24 h avant la congélation. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 240 x g. Compter les cellules avec un compteur de cellules et le gel à une densité de 5 à 10 x 10 ⁶ / ml dans frsolution mère ozen contenant 90% de FBS et 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO). Congeler à un taux de 1 ° C par minute à -80 ° C, puis les transférer directement dans l'azote liquide.

5. 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényl-tétrazolium , le bromure de (MTT) ¹⁷

1. Préparer une suspension cellulaire unique B-LCL avec le milieu 1640 contenant 10% de sérum de veau foetal. Seed 3 x 10 ⁴ cellules par puits sur la plaque de 96 puits, 100 pl par puits.
2. Placer la plaque dans 5% de CO ₂ incubateur à 37 ° C pendant 12 à 16 heures.
3. Ajouter MTT (5 mg / ml) dans les puits dans lesquels les cellules sont en croissance et à l'abri de la lumière pendant 4 h à 37 ° C.
4. Centrifugeuse plaque de cellule pendant 10 min à 168 x g.
5. Retirer le surnageant et ajouter 100 ul de DMSO par puits.
   NOTE: Soyez prudent. Ne touchez pas les cristaux de colorant en forme d'aiguilles.
6. Agiter la plaque pendant 10 minutes à basse vitesse pour dissoudre complètement les cristaux.
7. l'absorption de la mesure à 570 nm paren utilisant un spectrophotomètre de microplaque.

Résultats

Au cours du processus de transformation, les changements morphologiques des cellules sont visualisées par microscopie optique (Figure 2). De petites grappes de cellules étaient clairement visibles par le procédé de séparation par gradient de densité au bout de 7 jours après l'infection, alors que seule une couche épaisse de fragments cellulaires sont visibles à partir de la méthode de la lyse des globules rouges. Cependant, des amas de cellules lymphoblastoïdes sont visi...

Discussion

Nous rapportons ici le développement d'un nouveau procédé d'immortalisation de lymphocytes B humains à partir de sang total par lyse des globules rouges et la viabilité cellulaire établie de B-LCL a été évaluée par le test MTT. Les résultats ont montré que la viabilité des cellules B-LCL établies par la méthode de la lyse des globules rouges est beaucoup plus élevé que celui du procédé de séparation par gradient de densité. L'avantage majeur de la méthode de la lyse des globules rouges est qu'il est simp...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Centrifugeuse	Techcomp	CT6T	Centrifugation
Compteur de cellules automatisé  ;	Countstar	; IC 1000  ;	Pour le comptage cellulaire  ;
Spectrophotomètre de microplaques Epoch	BioTek Instruments	SN263839	Pour mesurer l’absorbance
96 puits cluster de culture cellulaire	Corning Incorporated	3599	Plaques de polystyrène
24 puits cluster de culture cellulaire	Corning Incorporated	3524	Plaques de polystyrène
25 cm2 flacon de culture cellulaire	Nest	707001	Polystyrène& nbsp ;
FBS	Gibco	10270	Composant des B-LCLs medium
RPMI Medium 1640	Gibco	31800-022	Pour les B-LCLs medium
L-Glutamine  ;   ;	Amresco	0374	Composant des B-LCLs moyen
100x streptomycine pénicilline solution BioRoYeeBRY-2309	BioRoYee	BRY-2309	Composant des B-LCLs medium
Ficoll paque plus	GE  ; Soins de santé	17-1440-03	Pour in vitro isolement des lymphocytes
PHA-M	Sigma	L8902	Pour stimuler la prolifération des lymphocytes
Cyclosporin A	Caïmans  ; Produit chimique	12088	Pour inhiber l’effet cytotoxique des lymphocytes T
Tampon de lyse des globules rouges	Tiangen	RT122-01	Pour lyser les globules rouges
MTT	Amresco	0793	Pour la détection de la viabilité cellulaire
DMSO	Sigma	D2650	Pour la congélation des cellules