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Les modèles aigus et chroniques de l'hyperglycémie dans le poisson-zèbre: une méthode pour évaluer l'impact de l'hyperglycémie sur la neurogénèse et la biodisposition des molécules radiomarquées

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DOI :

10.3791/55203

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26 juin 2017

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1UMR 1188 Diabète athérothombose Thérapie Réunion Océan Indien (DéTROI), Saint-Denis de La Réunion, France, Université de La Réunion, INSERM, 2RIPA (Radiochimie et Imagerie du Petit Animal), Cyclotron de la Réunion Océan Indien CYROI, 3CHU de La Réunion

Dans cet article

Résumé

Ce travail décrit des méthodes pour établir des modèles hyperglycémiques aigus et chroniques dans le poisson zèbre. L'objectif est d'étudier l'impact de l'hyperglycémie sur les processus physiologiques, tels que la neurogénèse constitutive et induite par les blessures. Le travail souligne également l'utilisation du poisson zèbre pour suivre les molécules radiomarquées (ici, [ 18 F] -FDG) en utilisant PET / CT.

Résumé

L'hyperglycémie est un problème de santé majeur qui entraîne une dysfonction cardiovasculaire et cérébrale. Par exemple, il est associé à des problèmes neurologiques accrus après un accident vasculaire cérébral et se révèle nuire aux processus neurogéniques. Fait intéressant, le poisson zèbre adulte est apparu récemment comme un modèle pertinent et utile pour imiter l'hyperglycémie / diabète et pour enquêter sur la neurogenèse constitutive et régénératrice. Ce travail fournit des méthodes pour développer des modèles d'hyperglycémie de poissons zèbres pour explorer l'impact de l'hyperglycémie sur la prolifération des cellules cérébrales dans des conditions de réparation homéostatique et cérébrale. L'hyperglycémie aiguë est établie en utilisant l'injection intrapéritonéale de D-glucose (2,5 g / kg de poids corporel) dans le poisson zèbre adulte. L'hyperglycémie chronique est induite par l'immersion du poisson zèbre adulte dans du D-glucose (111 mM) contenant de l'eau pendant 14 jours. Des mesures au niveau du glucose sanguin sont décrites pour ces différentes approches. Méthodes pour étudier l'impact de l'hyperglycémie sur un constitutifLa neurogenèse régénérative, en décrivant la blessure mécanique du télencephalon, la dissection du cerveau, l'encastrement de la paraffine et la section avec un microtome, et la réalisation de procédures d'immunohistochimie, sont démontrées. Enfin, la méthode d'utilisation du poisson zèbre comme modèle pertinent pour étudier la biodistribution de molécules radiomarquées (ici, [ 18 F] -FDG) en utilisant PET / CT est également décrite.

Introduction

L'hyperglycémie est définie comme des taux excessifs de glycémie. Bien que cela puisse refléter une situation de stress aigu, l'hyperglycémie est également une condition qui conduit souvent à un diagnostic de diabète, un trouble chronique de la sécrétion d'insuline et / ou de la résistance. En 2016, le nombre d'adultes atteints de diabète a atteint 422 millions dans le monde et chaque année, 1,5 million de personnes meurent de cette maladie, ce qui en fait un problème de santé majeur 1 . En effet, le diabète incontrôlé entraîne plusieurs troubles physiologiques affectant le système cardio-vasculaire, les reins et les systèmes nerveux périphérique et central.

Fait intéressant, l'hyperglycémie aiguë et chronique peut altérer la cognition et contribuer à la fois à la démence et à la dépression 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . De plus, l'admission des patients wL'hyperglycémie a été associée à de pires résultats fonctionnels, neurologiques et de survie après un accident vasculaire ischémique 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Il a également été démontré que l'hyperglycémie / diabète affecte la neurogénèse chez les adultes, un processus menant à la génération de nouveaux neurones, en impactant l'activité des cellules souches neurales et la différenciation neuronale, la migration et la survie 2 , 12 .

Contrairement aux mammifères, les poissons télésoyeux, comme le poisson zèbre, présentent une activité neurogénique intense dans l'ensemble du cerveau et présentent une capacité exceptionnelle pour la réparation du cerveau à l'âge adulte 13 , 14 , 15 , 16 . Notamment, de telles capacités sont possibles en raison de la persistance du neuCellules tronquées / progénitrales, y compris la glande radiale et les neuroblastes 17 , 18 , 19 . En outre, le poisson zèbre a récemment émergé comme modèle pour étudier les troubles métaboliques, y compris l'obésité et l'hyperglycémie / diabète 20 , 21 , 22 .

Bien que le poisson zèbre soit un modèle bien reconnu d'hyperglycémie et de neurogénèse, peu d'études ont étudié l'impact de l'hyperglycémie sur l'homéostasie cérébrale et la fonction cognitive 12,23. Pour déterminer l'impact de l'hyperglycémie sur la prolifération de cellules cérébrales induite par des lésions constitutives, un modèle d'hyperglycémie aiguë a été créé grâce à l'injection intraperitoneale de D-glucose. En outre, un modèle d'hyperglycémie chronique a été reproduit par l'immersion des poissons dans de l'eau additionnée de wIth D-glucose 12 . Le poisson-zèbre présente de nombreux avantages dans la recherche. Ils sont bon marché, faciles à soulever et transparents pendant les premiers stades de développement, et leur génome a été séquencé. Dans le cadre de ce travail, ils présentent également plusieurs avantages supplémentaires: (1) ils partagent des processus physiologiques similaires avec les humains, ce qui en fait un outil essentiel pour la recherche biomédicale; (2) ils permettent une étude rapide de l'impact de l'hyperglycémie sur l'homéostasie du cerveau et la neurogénèse, compte tenu de leur activité neurogénique répandue et forte; Et (3) ils sont un modèle alternatif, ce qui permet de réduire le nombre de mammifères utilisés dans la recherche. Enfin, le poisson zèbre peut être utilisé comme modèle pour tester la biodistribution des molécules radiomarquées et des agents thérapeutiques potentiels utilisant le PET / CT.

L'objectif global de la procédure suivante est de documenter visuellement comment mettre en place des modèles d'hyperglycémie aiguë et chronique chez le poisson zèbre, utiliser zebLe rape pour évaluer le remodelage du cerveau dans des conditions hyperglycémiques et surveiller les molécules radiomarquées (ici, [ 18 F] -FDG) en utilisant du PET / CT.

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Protocole

Le poisson zèbre de type sauvage adulte ( Danio rerio ) a été maintenu dans des conditions de photopériode standard (14/10 h lumière / sombre) et de température (28 ° C). Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux lignes directrices de la Communauté européenne et de la Communauté européenne pour l'utilisation des animaux dans la recherche (86/609 / EEC et 2010/63 / EU) et ont été approuvées par le Comité local d'éthique pour l'expérimentation animale.

1. Établissement d'un modèle d'hyperglycémie aiguë dans le poisson zèbre

  1. Préparer une solution mère de tricaine (MS-222) en dissolvant 400 mg de poudre de tricaine dans 97,9 ml d'eau et 2,1 ml de tampon Tris / HCl 1 M (pH 9). Ajustez le pH à 7 et aliquote pour le stockage à -20 ° C.
  2. Préparez une anesthésie pour le poisson zèbre adulte en mettant 5 mL de tricaine (solution mère) dans 100 mL d'eau de poisson (concentration finale de tricaine: 0.02%).
  3. Transférer un poisson zèbre (3 à 6 mois) de son réservoir à l'anesthésie jusqu'à ce qu'il cesse de bouger.
  4. RéDéplacez le poisson à l'aide d'une pipette coupée et séchez-le rapidement sur du papier absorbant.
  5. Peser le poisson.
  6. Préparez une seringue de D-glucose dissous dans 1X PBS et injectez 50 μL de D-glucose (2,5 g / kg de poids corporel).
    NOTE: Par exemple, un poisson de 0,6 g recevra 50 μL de solution de D-glucose / PBS à 3%.
  7. Mettez le poisson sur le dos et insérez l'aiguille de la seringue dans la cavité intrapéritonéale.
  8. Poussez lentement la solution D-glucose / PBS, puis rallumez le poisson dans l'eau.
  9. Vérifiez le poisson jusqu'à ce qu'il récupère complètement. Remettez-le dans son réservoir jusqu'à ce que le temps requis pour effectuer la mesure de la glycémie soit atteint.
    NOTE: La glycémie est mesurée 1,5 h après l'injection.

2. Établissement d'un modèle d'hyperglycémie chronique dans le poisson zébré

  1. Préparez un réservoir de 2 L d'eau de poisson propre.
  2. Dissoudre 40 g de D-glucose dans les 2 L d'eau de poisson pour une concentration finale en D-glucose de111 mM.
  3. Plongez entre 5 et 7 poissons zèbres adultes dans l'eau contenant du D-glucose.
  4. Remplacer l'eau de poisson D-glucose tous les 2 jours afin d'éviter la croissance de bactéries ou d'autres micro-organismes.
  5. Après 14 jours de traitement, placez le poisson brièvement dans de l'eau douce pour éliminer le D-glucose à l'extérieur du corps avant de prendre la mesure du niveau de glycémie.

3. Mesurer les taux de glycémie dans le poisson zèbre

  1. Couvrir le poisson avec de la glace pour une euthanasie rapide.
    REMARQUE: Ne pas utiliser une overdose de tricaine, car cela induit de grandes variations dans le taux de glycémie. Ne laissez pas le poisson dans la glace pendant trop longtemps, car cela entraînera le coagulation du sang.
  2. Essuyez le poisson avec du papier absorbant pour éliminer toute l'eau et éviter toute dilution de sang pendant la mesure de la glycémie.
  3. Retirez un oeil en utilisant des pinces de dissection et attendez jusqu'à ce que la cavité de l'oeil soit remplie de sang.
  4. Mettre une bande de test sur un glucomètre et iNsert la bande dans la cavité de l'œil.
  5. Mesurer les taux de glycémie.

4. Analyse de la prolifération des cellules cérébrales suite à une hyperglycémie

  1. Solutions et tampons: exigences et préparation
    1. Préparer 1 L de 1x PBS en ajoutant 100 ml de PBS 10x à 900 ml d'H 2 O distillé (dH 2 O) et mélanger.
    2. Préparer 1x PBS avec 0,2% de détergent (PBS-T, voir la table des matériaux).
      REMARQUE: Pour préparer 1 L de PBS-T, ajouter 2 mL de détergent (voir la Table des matériaux ) à 1 L de PBS.
    3. Préparez une série d'éthanol (100% x 2, 95%, 85%, 70%, 50% et 30%) et 0,85% de NaCl.
    4. Préparer le tampon de blocage: PBS-T contenant 0,5% à 1% de poudre de lait.
      REMARQUE: Pour préparer 200 ml de tampon de blocage, ajouter 2 g de poudre de lait à 200 ml de PBST.
    5. Préparer un tampon de récupération d'antigène, citrate de sodium.
      NOTE: Pour préparer 1 L de tampon de citrate de sodium, ajouter 2,94 g de citrate de sodium triSel de sodium déshydraté à 1 L de dH 2 0. Ajuster le pH à 6 avant le remplissage à 1 L.
    6. Préparer un tampon de 4% de paraformaldehyde-PBS, en ajoutant 4 g de paraformaldéhyde à 100 ml de 1x PBS. Mettez-le sous agitation à 58-60 ° C jusqu'à ce qu'il se dissout complètement.
  2. Préparation de l'échantillon pour l'immunohistochimie: fixation et déshydratation
    1. Après avoir mesuré le taux de glycémie, séparez la tête du corps en coupant la tête derrière les branchies.
      Note: Alternativement, le cerveau peut être directement extrait et congelé pour d'autres expériences, telles que l'extraction de l'ARNm.
    2. Fixer les têtes pendant une nuit à 4 ° C dans du paraformaldéhyde à 4% dissous dans du PBS (PFA-PBS).
    3. Le lendemain, lavez brièvement les têtes dans PBS.
    4. Dissectez soigneusement le cerveau à l'aide d'un microscope. Rincez les têtes fixes avec du PBS et utilisez une aiguille pour fixer une tête sous un microscope à dissection. Retirer les yeux et le haut du crâne avec une pince. CarefuLly extraire le cerveau et le placer dans 1x PBS.
    5. Laver successivement les cerveaux fixes avec 1x PBS pendant 30 minutes, NaCl 0,85% pendant 30 minutes, EtOH à 70% / NaCl à 0,85% (v / v) pendant 15 minutes, EtOH à 70% pendant 15 minutes (deux fois), 85% d'EtOH pendant 20 Min, 95% d'EtOH pendant 20 min, et 100% d'EtOH pendant 20 min (deux fois). Incuber pendant une nuit dans une solution finale à 100% d'EtOH.
      NOTE: Les cerveaux déshydratés peuvent rester pendant plusieurs mois dans 100% d'EtOH à 4 ° C avant l'encastrement de la paraffine.
  3. Préparation de l'échantillon pour l'immunohistochimie: préparation des tissus pour l'incorporation de paraffine
    1. Placez le cerveau dans un petit bécher en verre.
      REMARQUE: N'utilisez pas de récipient en plastique, car le toluène peut endommager certains plastiques.
    2. Retirer l'éthanol et le remplacer par du toluène, car le cerveau doit être totalement récupéré par le toluène. Effectuer deux bains de 30 minutes de toluène.
    3. Retirez le toluène et placez le cerveau dans une cassette d'encastrement. Mettez la cassette fermée dans les béchers de la série de paraffines fondues à 58 à 60 ° C (30 min dans chaque bécher de paraffine). Activez les pinces d'inclusion du réchauffement. À la fin des bains de paraffine, sortez la cassette et versez une certaine paraffine liquide dans un moule.
    4. Verser la paraffine fondue dans un moule et placer le cerveau à l'intérieur. Orientez le cerveau en utilisant les pinces d'inclusion réchauffante, en utilisant l'orientation antéro-postérieure du cerveau comme guide. Laissez la paraffine durcir sur la partie de refroidissement de la machine d'encastrement.
    5. Pour des raisons techniques, positionnez les cerveaux le long de l'axe antéro-postérieur. Après avoir démasqué le bloc de paraffine, recouper et réparer sur une cassette, avec la paraffine fondue dans l'orientation appropriée pour permettre une coupe transversale.
    6. Insérez le bloc de paraffine dans le bras du microtome. Couper des sections de 50 μm d'épaisseur jusqu'à ce que le niveau d'échantillon du cerveau soit atteint. Coupez le bloc de paraffine pour obtenir un trapèze et ajustez l'épaisseur de coupe à 7 μm. Recueillir les rubans de paraffine à l'aide de pinceaux et les placer sur pap non noirEr. Coupez-les doucement toutes les 3 à 4 sections.
    7. Mettez une glissière sur une plaque chauffante et recouvrez-la avec de l'eau dH 2 O.
    8. Placez doucement les rubans coupés sur l'eau. Retirer l'eau avec un papier absorbant absorbant lorsque les rubans de paraffine sont suffisamment étalés / déployés. Retirez les dernières gouttes mécaniquement. Retirez l'eau des lames et laissez-les sécher pendant au moins 3 h sur la plaque chauffante à environ 30-40 ° C.
  4. Procédure d'immunohistochimie
    1. Retirer la paraffine en plaçant des sections dans trois récipients de xylène pendant 7 minutes chacun.
    2. Réhydratez les sections en mettant les diapositives dans deux récipients d'EtOH à 100% pendant 2 min chacun, puis des bains d'EtOH à 95%, 85% d'EtOH, 70% d'EtOH et 30% d'EtOH pendant 30 s chacun. Enfin, mettez brièvement les diapositives dans dH 2 O et deux fois dans PBS pendant 5 minutes chacune.
    3. Effectuer la récupération de l'antigène en incubant les sections dans le tampon de citrate dans un micro-ondes (2 min à 500 W) jusqu'àLe tampon commence à bouillir. Laissez les glissières récupérer à température ambiante pendant 15 min.
    4. Laver trois fois dans PBST, 5 min chacun, et bloquer les sections pendant 45 minutes dans du PBST contenant 1% de lait. Incuber pendant la nuit avec des anticorps primaires ( p. Ex. Antigène nucléaire de cellule proliférante (PCNA) pour la coloration cellulaire proliférante; 1/100) dilué dans un tampon de blocage ( c'est-à-dire PBST, 1% de lait).
    5. Laver trois fois dans le PBST, 5 min chacun, et incuber les sections pendant 90 min avec des anticorps secondaires appropriés ( p. Ex. Alexa Fluor 488; 1/200) de chèvre anti-souris dilué dans un tampon de blocage et avec DAPI (1/500).
    6. Laver trois fois dans le PBST, 5 min chacun, et monter les diapositives avec un support de montage fluorescent (voir la table des matériaux).
    7. Analyser la coloration en utilisant un microscope épifluorescent et / ou confocal.
    8. Quantifier la prolifération des cellules cérébrales sur au moins trois sections cérébrales successives d'une région d'intérêt dans au moins troisImports.
      REMARQUE: En variante, l'incorporation du cerveau peut être effectuée dans l'agarose pour procéder à une section de vibratome et à une immunohistochimie flottante, comme décrit précédemment 24 .
  5. Étude de l'impact de l'hyperglycémie sur les mécanismes de réparation du cerveau
    NOTE: Alternativement, l'étude de la réparation du cerveau sous hyperglycémie aiguë et chronique peut être effectuée après une blessure par plaidoirie du télénéfaloïde, comme décrit précédemment 24 , 25 , 26 . Brièvement:
    1. Anesthésier le poisson zèbre adulte avec la tricaine.
    2. Placez le poisson sous un microscope à dissection avec de la lumière.
    3. Tenez le poisson d'une main.
    4. D'autre part, insérez une seringue 30 G verticalement à travers le crâne dans la région médiane de l'hémisphère telencephalique droit.
    5. Remettre les poissons dans de l'eau poisson fraiche, de l'eau additionnée de glucose D-glucose (111MM), ou contrôler l'eau de poisson. Permettre au poisson de survivre pendant 7 jours après la blessure.
      REMARQUE: reportez-vous à l'étape 4 pour le reste de la procédure.

5. Imagerie de la Biodistribution de molécules radiomarquées par PET / CT dans le poisson-zèbre: Fluorodéoxyglucose ([18F] -FDG) pour analyser le métabolisme du glucose

  1. Préparez une seringue de 50 μL contenant 20 MBq d'une solution saline de [18F] -FDG.
  2. Placez la seringue derrière l'écran de radioprotection.
  3. Anesthésier un poisson zèbre adulte avec de la tricaine.
  4. Placez le poisson derrière un écran de protection contre les rayonnements.
  5. Injecter [18F] -FDG dans la cavité intrapéritonéale. Essuyez le site d'injection avec un petit morceau de papier de soie pour éviter la détection de résidu [18F] -FDG qui pourrait fuir le ventre du poisson.
  6. Utilisez un étalon radio-isotopique pour mesurer l'activité restante contenue sur la seringue et le tissu pour calculer la dose injectée exacte.
  7. Placez le poisson sur unEw, petit morceau de tissu absorbant imbibé de tricaine et enveloppé doucement. Placez le poisson avec le tissu absorbant sur le lit de l'imageur PET / CT.
  8. Insérez le lit dans le système d'imagerie PET / CT et commencez l'acquisition.
  9. Procéder à la réalisation de l'acquisition PET / CT.
  10. À la fin de la procédure, remettre les poissons dans une petite quantité d'eau de poisson fraîche.
    NOTE: Alternativement, après l'injection [18F] -FDG, le poisson peut être ramené dans une petite quantité d'eau douce pendant 10 min à 1 h pour faciliter la diffusion de [18F] -FDG avant d'anesthésier le poisson encore une fois pour le PET / Imagerie CT.

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Résultats

En utilisant les procédures décrites dans cet article, l'injection intrapéritonéale de D-glucose (2,5 g / kg de poids corporel) a été réalisée sur du poisson zèbre adulte et a entraîné une augmentation significative des taux de glycémie 1,5 h après l'injection ( figure 1A ). 24 h après l'injection, les taux de glycémie étaient similaires entre les poissons D-glucose et PBS injectés 12 . Pour le traitement chronique, le poi...

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Discussion

Ce travail décrit diverses méthodes pour établir des modèles aigus et chroniques d'hyperglycémie dans le poisson zèbre. Les principaux avantages de ces procédures sont les suivants: (1) ils permettent une réduction du nombre de mammifères utilisés pour la recherche, (2) ils sont simples à mettre en place et à mettre en œuvre rapidement, et (3) ils sont économiques. Par conséquent, de tels modèles permettent d'étudier l'impact de l'hyperglycémie sur un grand nombre d'animaux pour étudier son impact su...

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Déclarations de divulgation

Aucun conflit d'intérêts potentiel n'a été divulgué.

Remerciements

Nous remercions grandement la Direction des Usages du Numérique (DUN) de l'Université La Réunion pour avoir édité la vidéo (en particulier Jean-François Février, Eric Esnault et Sylvain Ducasse), Lynda-Rose Mottagan pour la voix off, Mary Osborne-Pellegrin pour la révision La voix off, et la plate-forme CYROI. Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Université La Réunion (Bonus Qualité Recherche, Dispositifs incitatifs), du Conseil Régional de La Réunion, de l'Union Européenne (CPER / FEDER) et de l'association Philancia. ACD est récipiendaire d'une bourse de bourses du ministère de l'Éducation Nationale, de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche, Université de La Réunion (Contrat Doctorat).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1mL Luer-Lok SeringueBD, États-Unis309628
4',6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI)Sigma-Aldrich, AllemagneD8417
7 mL bijou container plain labDutscher, France080171
D-glucoseSigma-Aldrich, Allemagne67021
Appareil photo numériqueLife Sciences, JaponHamamatsu ORCA-ER
Moules de base jetables  ;Simport, CanadaM475-2
Âne anti-lapin Alexa fluor 488Life Technologies, États-UnisA21206
Centre d’encastrementThermo Scientific, États-UnisShandon Histocentre 3
Microscope à fluorescenceNikon, JaponEclipse 80i
Fluorodésoxyglucose (18F-FDG)Cyclotron, France
Bandelette de test de glucomètreLifeScan, FranceOne-Touch 143 Ultra
Goat anti-souris Alexa fluor 594Life Technologies, USAA11005
In-Vivo Imaging SystemTriFoil Imaging, CanadaTriumph Trimodality  ;
MicrotomeThermo Scientific, USAMicrom HM 355 S Souris
monoclonale anti-PCNADAKO, USA clonePC10
Paraformaldéhyde (PFA)Sigma-Aldrich, AllemagneP6148-500G
Lapin polyclonal anti-GFAPDAKO, USA Z033429
Banc de séchage sur lamesElectrothermique, USAMH6616
Chlorurede sodium Sigma-Aldrich, AllemagneS9888
Citrate de sodium sel trisodique déshydraté  ;Prolabo, France27833.294
Aiguille stérileBD Microlance 330 G 1/2 ; 0.3 mm× ; 13 mm
Student Dumont #5 ForcepsFine Science Tools91150-20
Ciseaux chirurgicaux d’étudeFine Science Tools91400-14
Superfros Plus Gold Slides ThermoScientific, USAFT4981GLPLUS
Microscope chirurgicalLeica, FranceM320-F12
Cassettes d’enrobage tissulaireSimport, CanadaM490-10
Support d’enrobage tissulaireLeicaBiosystems, USA39602004
ToluèneSigma-Aldrich, Allemagne244511
Tricaine MS-222Sigma-Aldrich, AllemagneA5040
Triton X100Sigma-Aldrich, AllemagneX100-500 mL
Vectashield moyen  ;Vector Laboratories, États-UnisH-1000
XyleneSigma-Aldrich, Allemagne534056
Souchede poisson AB
fort>Tampon de phosphate salin (10X PBS) pH 7,4 (pour 1 litre)Pour préparer 10X PBS, ajoutez les sels suivants et complétez à 1 litre avec de l’eau
distilléeChlorure de potassium (MM : 74.55 g/mol) : 2.00 gSigma-Aldrich, Allemagne746436
Phosphate de potassium monobasique (MM : 136,09 g/mol) : 2.40gSigma-Aldrich, Allemagne795488
Chlorure de sodium (MM : 58,44 g/mol) : 80,00 g  ; Sigma-Aldrich, AllemagneS9888
Phosphate de sodium dibasique (MM : 141,96 g) : 14,40 gSigma-Aldrich, Allemagne795410
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Références

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