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Article de méthode

Visualisation des variations du cycle cellulaire et détermination de nucléation dans postnatales cardiomyocytes

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DOI :

10.3791/55204

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24 février 2017

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1Institute of Physiology I, University of Bonn

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire dans les cardiomyocytes, nous présentons des protocoles utilisant deux lignées de souris transgéniques : les souris transgéniques Myh6-H2B-mCh, pour l’identification sans équivoque des noyaux de cardiomyocytes, et les souris CAG-eGFP-anillin, pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire.

Résumé

Les cardiomyocytes sont sujets à des variations du cycle cellulaire, telles que l’endoréduplication (cycles continus de synthèse de l’ADN sans caryokinésie ni cytokinèse) et la mitose acytocinétique (caryokinèse mais pas de cytokinèse). De telles variations atypiques du cycle cellulaire aboutissent à des cellules polyploïdes et multinucléées plutôt qu’à une division cellulaire. Par conséquent, pour déterminer le renouvellement et la régénération cardiaques, il est d’une importance cruciale d’identifier correctement les noyaux des cardiomyocytes, le nombre de noyaux par cellule et l’état de leur cycle cellulaire. Cela est particulièrement vrai pour l’utilisation de marqueurs nucléaires pour identifier l’activité du cycle cellulaire, tels que les analogues de la thymidine Ki-67, PCNA ou pHH3. Nous présentons ici des méthodes de reconnaissance des cardiomyocytes et de leur nucléarité et de détermination de l’activité de leur cycle cellulaire. Nous utilisons deux systèmes transgéniques publiés : la lignée de souris transgéniques Myh6-H2B-mCh, pour l’identification sans équivoque des noyaux de cardiomyocytes, et la lignée de souris CAG-eGFP-anilline, pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire. Combinés, ces deux systèmes facilitent l’étude de la régénération et de la plasticité cardiaques.

Introduction

L'identification correcte des noyaux de cardiomyocytes et l'état du cycle cellulaire est d'une importance cruciale pour la détermination du chiffre d'affaires du muscle cardiaque et de la régénération. Cela est particulièrement vrai pour l'utilisation de marqueurs nucléaires, tels que pHH3, Ki-67, ou des analogues de la thymidine pour identifier l'activité du cycle cellulaire. Comme la capacité proliférative des cardiomyocytes de mammifères adultes est très faible 1, une fausse identification d'un noyau positif pour un marqueur d'un noyau de cardiomyocytes de prolifération pourrait faire une différence cruciale dans l'issue d'un essai de prolifération. En outre, les cardiomyocytes sont sujettes à des variations du cycle cellulaire, tels que endoréduplication et la mitose acytokinetic qui conduisent à des cellules polyploïdes et multinucléées plutôt que dans la division cellulaire. À cette fin, l'interprétation de la coloration des anticorps contre des marqueurs du cycle cellulaire communs ne sont pas concluantes dans tous les cas.

Ici, nous présentons les méthodes pour la ligne droite-forwa reconnaissance rd des cardiomyocytes de souris et de leur nucléarité dans des cellules isolées indigènes et des coupes de tissus épais aux stades postnataux et des adultes par l'identification sans équivoque de leurs noyaux. À cette fin, une lignée de souris transgéniques avec une expression spécifique de cardiomyocytes d'une protéine de fusion consistant en histone H2B humaine et mCherry sous le contrôle du promoteur Myh6 (Myh6-H2B-MCH) a été utilisé 2. Le croisement de cette ligne de souris avec une lignée de souris transgénique de l'indicateur de la prolifération, dans laquelle l'expression d'une protéine de fusion eGFP anillin est sous le contrôle de l'ubiquité promoteur d'actine de poulet avec un activateur de CMV (ACG-eGFP anillin), permet la détermination de l'état du cycle cellulaire. Anillin la protéine d'échafaudage est spécifiquement exprimée dans le cycle cellulaire des cellules actives 3 et son différentiel localisation subcellulaire au cours du cycle cellulaire permet un suivi en temps réel, progression du cycle cellulaire avec une résolution élevée de la phase Mef "> 4. Par conséquent, les souris transgéniques doubles peuvent être utilisées pour établir une discrimination entre les cardiomyocytes qui prolifèrent et celles qui subissent des variations du cycle cellulaire. Cela montre particulièrement utile dans le criblage de substances induisant la prolifération in vitro.

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Protocole

Toutes les procédures de ce protocole impliquant des animaux étaient en conformité avec les normes d'éthique de l'Université de Bonn et conformes aux lignes directrices de la directive 2010/63 / UE du Parlement européen sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques.

1. In Vitro Visualisation de l' activité du cycle cellulaire en postnatale cardiomyocytes

  1. Postnatale cardiomyocytes dissociation
    1. préparations pré-expérimentales
      1. Préparer un milieu de culture (IMDM, 1% Pénicilline / Streptomycine, 1% d'acides aminés non essentiels, 0,1% de β-mercaptoéthanol); moyen 1: ajouter FCS à 2%; moyen 2: ajouter FCS à 20%.
      2. Enduire une boîte de culture de 96 puits (zone demi-croissance: 15 mm 2) avec 0,1% de gélatine dans une solution PBS.
    2. Coeur dissection
      1. Préparer une boîte de Pétri avec 15 ml de PBS et le stocker sur la glace. Stériliser deux pinces et de petits ciseaux en les mettant dans un endroit sec stérilisateur à billes de verre.
      2. Sacrifiez souris transgéniques néonatales (CAG-eGFP-anillin / Myh6-H2B-MCH) par décapitation. Ouvrez le thorax, disséquer le coeur, comme décrit dans Ehler et al. 2013 (J Exp Vis .; (79):. 50154 doi: 10,3791 / 50154), et de le transférer à la PBS glacé. Passez à la prochaine souris.
      3. Si l'on utilise des paires de reproduction non homozygotes, identifier les coeurs transgéniques avec un microscope à fluorescence. Mettre les cœurs dans du PBS sous un microscope à fluorescence. Vérifiez expression eGFP-anillin (Ex .: 488 nm; Em .: 509 nm) et d'expression H2B-MCH (Ex .: 587 nm; Em .: 610 nm) avec les filtres appropriés.
    3. l'isolement des cardiomyocytes
      1. Dissocier les cœurs sélectionnés en utilisant le kit coeur de dissociation néonatale. Incuber l'enzyme mélange 1 à 37 ° C pendant 5 min. Pour obtenir 1 mL du mélange enzymatique finale, ajouter 945 ul de mélange enzyme 1 à 55 ul de mélange enzymatique 2.
      2. Transférer jusqu'à 4 coeurs de souris P1 - P3 ou jusqu'à 2 cœurs de souris - P4 P6 à un r 1,5 mLtube eaction contenant 1 ml de mélange d'enzymes et de couper le coeur en petits morceaux avec des ciseaux. Transférer la solution dans 15 ml de tubes de réaction.
      3. Incuber à 37 ° C pendant 15 min. Afin de maximiser le contact entre le tissu et les enzymes, mettre le tube de 15 ml à peu près horizontalement dans l'incubateur. Mélanger par pipetage 5 - 10 fois vers le haut et vers le bas avec une pipette de 5 mL. Répétez cette étape trois fois.
      4. Ajouter 7,5 ml de milieu 2 (20% de FCS) pour arrêter la réaction enzymatique. Filtrer la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire de 70 pm. Rincer le filtre de cellules avec 3 ml de milieu 2.
      5. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 × g pendant 15 minutes et jeter le surnageant. Reprendre le culot dans 500 ul de milieu 1; la lyse des cellules rouges du sang ne sont pas requis pour d'autres expériences. Pipeter 10 uL de la suspension cellulaire dans une chambre de comptage de cellules et de déterminer le nombre de cellules.
      6. Pour une plaque de 96 puits: graines de 10.000 cellules par puits dans 120 pi de milieu 1 (2% de FCS). Endroitles cellules dans un incubateur (37 ° C et 5% de CO 2) et procéder immédiatement à la transfection.
  2. Transfection des cardiomyocytes néonataux avec ARNsi ou miARN
    1. Essuyez un banc avec une solution de décontamination RNase pour éliminer les RNases. Nettoyer le matériel suivant avec une solution de décontamination RNase: 10 pi, 100 pi et 200 pi-pipettes et une boîte de glace. Thaw siARN actions aliquotes (100 uM) sur la glace.
    2. Préparer 2 uM des stocks de travail de SI / miARN dans un milieu sérique réduite (98 pi de milieu sérique réduit + 2 pl de siRNA 100 uM de stock). Le stock de travail doit être utilisé le jour même. La congélation est déconseillée.
    3. Ajouter 4 pi du 2 uM Stock à 6 pi de milieu sérique réduit à un tube de réaction de 0,5 mL (montant pour un 96 puits; si final / concentration miARN dans 140 ul: ~ 57 nM). Choisissez un volume approprié pour le nombre de puits pour être transfectées avec un certain si / miARN.
    4. Préparer un mélange maître du réactif de transfection. Utiliser 10 ul (0,6 ul de réactif de transfection + 9,4 ul de milieu sérique réduit) pour chaque puits (96 puits au total).
    5. Ajoutez le si / miRNA mélanger au mélange de réactifs de transfection. Incuber pendant 5 min sur la glace. Pipet 20 ul dans chaque puits. Incuber les cellules pendant 48 h à 37 ° C et 5% de CO 2, puis remplacer le milieu dans chaque puits avec 120 pi de milieu 1. Après 24 h ou plus, passez à la fixation et immunofluorescence.
  3. La fixation et la coloration par immunofluorescence
    1. Retirer le milieu et laver les cellules une fois avec du PBS. Recouvrir les cellules avec une solution de formaldehyde à 4% pendant 20 min. Enlever la solution de formaldéhyde et laver les cellules une fois avec du PBS, puis les couvrir avec du PBS pour le stockage ou procéder à immunocoloration.
    2. Laisser incuber avec l'anticorps primaire (concentration selon les instructions du fabricant) dans 0,2% de Triton-X et le sérum d'âne à 5% pendant au moins 2 h.Si la coloration pour les α-actinine (dilution 1: 400; anti-α-actinine monoclonal), la tache nuit à 4 ° C.
    3. Retirer l'anticorps primaire et laver 3 fois avec du PBS. Diluer l'anticorps secondaire dans une solution de Hoechst 1: 400 et on incube pendant 1 h à température ambiante à l'abri de la lumière. Retirer l'anticorps, laver avec du PBS 3 fois, et couvrir les cellules avec du PBS pour le stockage à 4 ° C.
  4. La microscopie confocale vidéo
    1. Utiliser un microscope confocal pour l'acquisition de l'image. Ouvrez le logiciel d'imagerie. Ouvrez "Paramètres A1plus" et cochez les cases pour Ch1, Ch2 et Ch3. Réglez CH1 à DAPI, Ch2 à eGFP, Ch3 à Cy3, et Ch4 à Cy4 en cliquant sur le menu déroulant.
      1. Pour chaque canal, cliquez sur HV et mettez-le à 80 en utilisant la barre de défilement. Réglez le décalage à 0 en utilisant les barres de défilement, et cliquez sur le bouton "Home" pour régler le sténopé à la position de la maison. Définissez la taille de numérisation à 1,024 x 1,024 en cliquant sur le menu déroulant.
      2. Cliquez optimize pour ouvrirfenêtre "XYZ Setup Taille". Cochez la case "Parfait Voxel" sous "Etape suggéré (z)". Augmenter les intensités laser jusqu'à ce que l'image est ni sous-exposée ni surexposée.
        NOTE: Par exemple; Ch1 (DAPI): 16%, Ch2 (eGFP): 12%, Ch3 (Cy3): 100%, Ch4 (Cy5): 1%. Régler le décalage pour tous les canaux à 0.
    2. Prenez des photos en utilisant un objectif 20x (200x de grossissement). Numériser une grande image constituée d'images de tuiles (par exemple, 3 x 3).
      1. Dans le logiciel d'imagerie, allez à "acquérir" et choisissez "Scan grande image" dans le menu déroulant. Sous "Zone", choisissez "position actuelle est au coin supérieur gauche" dans le menu déroulant et régler "Nombre de champs dans X et Y" à 3 x 3. Cliquez sur "Scan".
  5. L'analyse d'image
    1. Définir le nombre de noyaux de cardiomyocytes en comptant les signaux de H2B-Ch et du nombre de cardiomyocytes en comptant les signaux α-actinine.
      1. Cliquez sur "Mesure" et choisissez "Mesure manuelle" dans le menu déroulant. Choisissez "Comtes" dans le menu déroulant suivant. Cliquez sur les noyaux avec des signaux H2B-MCH, marquant ainsi et de les compter. Faites de même pour les cellules α-actinine positif pour obtenir le nombre de cardiomyocytes.
    2. Count S / G2 cardiomyocytes de phase avec les signaux eGFP-anillin nucléaires (eGFP-anillin + / H2BmCh + noyaux). Cliquez sur "Mesure" et choisissez "Mesure manuelle" dans le menu déroulant. Choisissez "Comtes" dans le menu déroulant suivant. Marquer les noyaux avec des signaux eGFP-anillin et signaux H2B-MCH en cliquant sur eux.
    3. Comptez les cardiomyocytes avec des signaux spécifiques mitose eGFP-anillin (par exemple, la figure 1F et G), tels que les signaux cytoplasmiques, anneaux contractiles et midbodies. Cliquez sur "Mesure" et choisissez "Mesure manuelle" dans le menu déroulant. Choisissez "compte" de la prochaine pulMenu ldown. Mark cardiomyocytes avec des signaux spécifiques mitose eGFP-anillin (par exemple, la figure 1F et G), des signaux cytoplasmiques, anneaux contractiles et midbodies en cliquant sur eux.

2. Détermination de nucléation dans les cardiomyocytes adultes par Langendorff Dissociation et coupes de tissus épais

  1. Isolement des cardiomyocytes adultes par Langendorff dissociation
    1. Préparatifs avant la dissection coeur
      1. Remplir une seringue d'insuline (aiguille de calibre 30) avec de l'héparine (20 unités / g de poids corporel). Attrapez la souris par la peau du cou. Soulever et tourner la souris vers l'arrière pour exposer l'abdomen pour injection.
      2. Effectuer une injection intrapéritonéale. Placez la souris hépariné dans la cage et attendre au moins 15 minutes avant de commencer la dissection du cœur. Rincer et aérer l'appareil de Langendorff avec 5 - 10 ml de tampon de perfusion (tampon de perfusion: 135 mM de NaCl, 4 mM de KCl, 1 mM MgCl2 mM de HEPES, 2,5, 5 mM de glucose et 25 mM MBD dans ddH 2 O, ajuster le pH à 7,4 avec du NaOH).
    2. Coeur dissection
      1. Préparer un cm 10 boîte de Pétri avec frais (4 ° C) PBS et placez-le sur la glace. Remplir et ventiler une seringue de 1 ml relié à un (calibre 20) canule avec du PBS. Fixer la canule avec la pâte à modeler à la frontière de la boîte de Pétri. Placez la pointe de la canule légèrement au-dessous de la surface du PBS.
      2. Sacrifiez la souris par dislocation cervicale. Essuyer l'abdomen avec une solution d'éthanol à 70%. Faire une incision à partir du milieu de l'abdomen au sternum avec des ciseaux chirurgicaux. Retirez le diaphragme et couper le thorax au niveau bilatéral avec des ciseaux chirurgicaux.
      3. Soulever et fixer le sternum avec une aiguille de calibre 20, ouvrir la cavité thoracique, et de saisir doucement le cœur avec une pince anatomique. Soulevez le cœur et le retirer des poumons et la vascularisation en coupant les vaisseaux des voies de sortie.
        REMARQUE: Pour identifier l'aorte, positionner le cœursa face ventrale vers le haut. Cela diminue la distance entre les deux oreillettes, de sorte que l'aorte avec ses branches peut être trouvé entre les oreillettes. Selon l'architecture individuelle de coeur, les branches peuvent être supprimées si la branche principale de l'aorte est encore assez longtemps.
      4. Transférer le cœur à la boîte de 10 cm de Pétri contenant réfrigéré PBS (voir étape 2.1.2.1). Cathétériser cœur en tirant l'aorte ascendante sur une canule d'injection G20x1 ½, qui a été émoussée par un multi-outil oscillant pour éviter des dommages aux tissus. Fixer l'aorte avec un fil sur la canule. Rincer délicatement le cœur avec du PBS pour éliminer l'excès de sang en poussant le piston de la seringue. Un léger élargissement du cœur doit être visible.
    3. coeur dissociation Langendorff
      1. Connectez le coeur canulée rapidement à l'adaptateur de verrouillage Luer au niveau du dispositif de perfusion Langendorff. Perfuser le cœur avec 30 ml de tampon de perfusion oxygéné à 37 ° C pendant 5 min avec une vitesse de 1 goutte / s de débit. thdébit e peut être adaptée en régulant le débit de O 2 dans l'appareil de Langendorff en utilisant la soupape de réduction de pression (pression comprise entre 0 et 200 mbar).
      2. Préparer immédiatement un tampon de digestion avant utilisation: tampon de perfusion avec 6 U collagénase B, 10.000 unités de trypsine, et 50 uM de CaCl2. Retirer le tampon de perfusion et de commencer la digestion enzymatique en ajoutant 30 ml de tampon de digestion à chaud (37 ° C) et oxygénées.
        REMARQUE: La quantité de collagénase B a besoin d'être titrée en fonction de l'activité des différents lots.
      3. Régler le débit à une vitesse de 1 goutte / s et digérer le coeur pendant 10-13 min. Pour éviter toute contamination, ne pas utiliser de nouveau le efflux. Transférer le coeur dans une boîte de Petri de 10 cm avec 5 ml de tampon de digestion. Disséquer le tissu manuellement avec une pince en tenant le coeur avec une paire de pinces et en utilisant l'autre paire de déchirer le cœur en petits morceaux.
        NOTE: A ce stade, les oreillettes peut être séparé, coupé en petitsdes pièces (avec des ciseaux à iris), et digérés pendant 30 min dans 750 pi de tampon de digestion dans l'incubateur à 37 ° C afin d'obtenir des cellules auriculaires isolées. Pour obtenir des cardiomyocytes auriculaires purs, pipettes haut et bas à plusieurs reprises à l'aide d'une pipette de 1 ml. Arrêter la réaction enzymatique par addition de 750 ul de solution d'arrêt.
      4. Mettre un terme à la digestion en ajoutant 5 ml de solution d'arrêt (tampon de perfusion avec 5% de FBS et 50 uM de CaCl2). En utilisant une pipette sérologique, on filtre la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire de 100 um et recueillir les cellules dans un tube à centrifuger de 50 mL. Centrifuger la suspension cellulaire filtré à 80 g pendant 1 min à température ambiante.
      5. Jeter le surnageant et remettre en suspension doucement le culot cellulaire dans 10 ml de solution d'arrêt à l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml. Centrifuger la suspension cellulaire à 80 g pendant 1 min à température ambiante.
      6. Après centrifugation, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de milieu de culture (IMDM avec 20% FCS, 0,1 mM d'acides aminés non essentiels, 50 pg / ml de pénicilline et de streptomycine, et 0,1 mM de β-mercaptoéthanol) pour la mise en culture. Sinon, passez à l'étape 2.2, "immunofluorescence," et fixer les cellules.
      7. Pour la fixation sur des plaques à 24 puits, la plaque 10 000 de cellules isolées par puits à 8 pg / ml de lamelles de laminine enrobées dans des plaques à 24 puits avec 500 pi de milieu de culture à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant au moins 3 h .
  2. Immunofluorescence sur cardiomyocytes Langendorff isolés en suspension
    1. Fix cardiomyocytes Langendorff isolés dans 1 ml de 4% PFA dans PBS, pH 7,4, pendant 15 min à température ambiante. Centrifuger la suspension cellulaire à 800 g pendant 2 min à température ambiante, retirer le fixateur, et laver les cellules deux fois avec du PBS.
    2. Resuspendre les cardiomyocytes fixes dans 1 ml de PBS et soit procéder à la coloration par immunofluorescence ou de les stocker dans 500 ul de PBS par puits surune plaque de 24 puits à 4 ° C. Transférer une partie de la suspension des cellules (~ 100-200 ul) dans un tube de microcentrifugation. Centrifuger la suspension cellulaire à 800 g pendant 2 min à température ambiante et jeter le surnageant.
    3. Perméabiliser, bloc, et colorer les cellules avec un anticorps primaire contre-α actinine en ajoutant 200 pi d'anticorps primaire dilué 1: 400 dans du PBS avec 0,2% de Triton X-100 et 5% de sérum d'âne pendant 1 h à température ambiante.
    4. Centrifuger à 800 g pendant 2 min à température ambiante et jeter le surnageant. Laver le culot cellulaire avec du PBS et on centrifuge à 800 g pendant 2 min à température ambiante. Jeter le surnageant et incuber dans 200 pi d'Alexa Fluor-conjugué anticorps secondaire (anti-souris IgG1) dilué 1: 400 dans le colorant Hoechst (solution de travail: 1 pg / mL) pendant 1 h à température ambiante, à l'abri de la lumière.
    5. Centrifuger à 800 g pendant 2 min à température ambiante et jeter le surnageant. Répétez cette étape. Protéger l'échantillon de la lumière. Resuspend les cellules dans 200-500 ul de PBS et transférer 100 - 300 • ul de la suspension cellulaire dans un puits d'une chambre de microscopie. Fermez le couvercle de la chambre et de stocker les cellules à 4 ° C jusqu'à ce que l'imagerie. Protéger de la lumière.
  3. Analyse de la nucléarité des cardiomyocytes Langendorff isolés
    1. Prendre des images à partir cardiomyocytes α-actinine-colorées avec un objectif 25X, ce qui correspond à un grossissement de 250X. Comptez le nombre de H2B-MCH + noyaux seulement dans les cardiomyocytes qui sont régulièrement colorées par α-actinine et montrent en forme de tige morphologie typique et sont donc supposés être intact.
    2. Comptez au moins 100 cardiomyocytes de trois coeurs différents. Calculer le pourcentage de mononucléaires, binucléaire et cardiomyocytes tricycliques.
      NOTE: En règle générale, les cellules binucléaires devrait faire autour de 80 - 90%, tandis que les cellules tricycliques et ceux avec un plus grand nombre de noyaux sont rares (<1% dans les cardiomyocytes Langendorff isolés, <3% en tranches épaisses). cardiomyocytes auriculaires sont nettement plus petites que les cardiomyocytes ventriculaires. Habituellement, les cellules mononucléaires représentent 90% de la population totale.
  4. L'isolement, la fixation et la cryoconservation des cœurs adultes en tant que préparation pour tranches épaisses
    1. Assembler un appareil de perfusion pour la fixation en raccordant une seringue de 50 ml à un robinet d'arrêt à 3 voies avec un tube d'extension Heidelberger et un deuxième robinet d'arrêt à 3 voies. Fixer la seringue dans une position de manière à ce que le flux unique est activée par la gravité. Remplir le système avec 15 ml de PBS.
    2. Suivez les étapes 2.1.2.1-2.1.2.4, «préparation de coeur." Raccorder la canule d'injection G20x1 ½ avec le coeur à l'adaptateur Luer du dispositif de perfusion de PBS rempli sans bulles d'air et on perfuse avec du PBS. Remplir le système avec 10 - 15 ml de formaldéhyde à 4% dans PBS, qui est ensuite perfusés à travers le cœur. Immersion fixer le coeur dans une solution de formaldéhyde à 4% du jour au lendemain.
    3. Remplacer le formaldéhyde à 4%la solution avec du PBS et on lave le coeur dans du PBS sur un agitateur horizontal à 150 tours par minute pendant 8 heures à la température ambiante. Remplacez le PBS avec une solution de saccharose à 20% à déshydrater le coeur pendant la nuit à 4 ° C.
    4. Geler le coeur dans le milieu de cryo-enrobage dans un petit moule.
      1. Mettre en place un bécher rempli de 2-méthylbutane et le placer dans une boîte avec de la glace sèche. Mettre le coeur dans un moule préalablement congélation à moitié rempli d'cryo milieu d'enrobage et le couvrir complètement avec cryo milieu d'inclusion. Placez délicatement le moule dans le bécher froid, empêchant le contact du milieu de cryo-enrobage avec le 2-méthylbutane. Stocker le tissu congelé à -80 ° C jusqu'à utilisation.
  5. Préparation des tranches de coeur épais
    1. Utilisez la configuration suivante dans un cryotome: une température de l'objet de -18 à -20 ° C, une température de chambre de -21 à -23 ° C, un angle de compensation sur le porte-couteau de 4 °, et des lames de microtome Feather R35.
    2. Prenez le o cryoconservésrgan du récipient de congélation et de le fixer sur le disque de l'échantillon avec un milieu de cryo-enrobage en utilisant le plateau de congélation rapide. Positionner le coeur d'une manière telle que la découpe commence au sommet.
    3. Coupez les tranches de 50 um jusqu'à ce qu'un plan de coupe régulière est atteint et l'orgue devient visible. Couper 50-uM des tranches de tissu en utilisant le cryotome en mode manuel avec une vitesse lente et avec la plaque anti-roulis placé sur le couteau. tranches de montage sur des lames de microscope salins traité. Laissez les tranches sécher pendant 30 min à température ambiante et de stocker les lames à -80 ° C ou de teinture directement.
  6. La coloration des tranches épaisses de coeur (noyaux et des membranes cellulaires)
    1. Traiter des tranches de coeur avec la RNase A (20 ug / ml) dans du tampon de lavage (NaCl 0,5 M, Tris 0,1 M pH 7,5, et EDTA 50 mM) dans une cuve pendant 1 h à 37 ° C. Incuber les tranches dans 0,2% de Triton-X dans le tampon de lavage pendant 30 min à température ambiante. Laver les tranches deux fois pendant 5 min à chaque fois dans un tampon de lavage dans une cuvette sur unAgitateur horizontal à température ambiante.
    2. Tache pendant une nuit avec 1 uM à-PRO3 iodure (642/661) et de la fluorescéine couplé à l'agglutinine de germe de blé (WGA, 1: 100) dans du tampon de lavage à 4 ° C. Laver les tranches trois fois pendant 5 min chacun avec un tampon de lavage dans des cuvettes sur un agitateur horizontal et les couvrir avec de l'alcool de polyvinyle milieu de montage avec un réactif anti-décoloration et une lamelle de verre.
  7. Acquisition d'image
    1. Idéalement, utiliser un laser confocal à balayage microscope inversé équipé d'un NA objectif 40X / 1.15 eau-trempage. Recherche par oeil pour une zone dans la tranche qui se compose de cardiomyocytes alignés longitudinalement; à cet effet, le canal fluorescéine-WGA (488 nm Ex) est le mieux adapté.
      REMARQUE: Cette étape est essentielle, car les limites supérieures et inférieures des cardiomyocytes doivent être visibles dans le z-stack pour des analyses ultérieures. La profondeur d'imagerie est limitée à environ 30 nm et l'épaisseur de la tranche est de 50 pm, il est impossible d'imsections d'âge de ces cellules (longueur de la cellule: ~ 120 um).
    2. Réglez la configuration du logiciel d'imagerie. Ouvrez le logiciel d'imagerie. Ouvrez A1plus Paramètres et cochez les cases pour Ch2, Ch3 et Ch4. Set Ch2 à EGFP, Ch3 à Alx546 et Ch4 à Alx647 en cliquant sur le menu déroulant.
      1. Pour chaque canal, cliquez sur HV et mettez-le à 80 en utilisant la barre de défilement. Réglez le décalage à 0 en utilisant les barres de défilement. Cliquez sur le bouton "Home" pour régler le sténopé à la position de la maison. Définissez la taille de numérisation à 1,024 x 1,024 en cliquant sur le menu déroulant, puis cliquez sur l'optimisation pour ouvrir la fenêtre "XYZ Setup Taille". Cochez la case "Parfait Voxel" sous "Etape suggéré (z)".
    3. Cliquez sur "scan live" et ajuster les intensités laser en cliquant sur les barres de défilement sur les canaux individuels. Cochez la case «série Z» dans la fenêtre «ND Acquisition» et cliquez sur la case "défini par bouton en haut". Définir le haut etbouton de la z-stack en cliquant sur les boutons appropriés après ajustement de la mise au point sur le microscope. Définissez la largeur z étape à 0,5 um.
      REMARQUE: La profondeur de la pile z est limité par la pénétration optique dans le tissu et le rapport signal sur bruit.
    4. Allez dans "Paramètres" A1plus et définir la ligne moyenne / Integral à 2-4 en cliquant sur le menu déroulant. Peaufinez les intensités laser; le trou d'épingle doit être aussi faible que possible en vue d'image dans un plan focal.
  8. Analyse de nucléation
    1. Ouvrez le logiciel d'analyse d'images et de charger le z-stack d'intérêt.
    2. Déterminer manuellement nucléation dans les z-piles en faisant défiler les différentes couches de l'empilement, afin d'identifier les cellules qui se trouvent complètement à l'intérieur de la pile; tel est le cas lorsque la coloration WGA est visible dans toutes les dimensions. Comptez le nombre de noyaux (la plupart d'entre eux seront binucléaire) et marquer la cellule analysée par une annotation dans le logiciel.
    3. Déterminer le nombre de noyaux CM (H2B-MCH +) et les noyaux totaux (TO-PRO3 +) dans les reconstructions 3D pour les canaux individuels (Figure 2D). Dans le logiciel d'imagerie, cliquez sur "Binary" et choisissez "Définir Seuil 3D" dans le menu déroulant. Choisissez dans le menu déroulant canal soit Alx546 pour le nombre de noyaux CM ou Alx647 pour le nombre de noyaux totaux. En cliquant sur les flèches appropriées, définir le programme à "4x Smooth", 1x Nettoyer et remplir les trous ON. Cochez la case "Taille" et le mettre à 5 um en utilisant la barre de défilement. Réglez le seuil en utilisant la barre de défilement jusqu'à ce que des objets distincts apparaissent.
      NOTE: Après l'application de la fragmentation, la fenêtre des résultats montre une table d'événements quantifiés et une fragmentation de couleur de l'image. Comme certains noyaux contacter directement les uns des autres, corriger manuellement le résultat de mesure automatique pour les doublets, qui pourrait ne pas être correctement séparés par le logiciel.

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Résultats

Afin d'analyser les effets de siRNA / miARN sur l'activité du cycle cellulaire de cardiomyocytes postnatales in vitro, les cardiomyocytes de souris Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin double transgéniques ont été isolés le jour postnatal 3 (P3) et transfectées avec activité induisant le cycle cellulaire miR199 5 ARNsi de p27 et FZR1 ARNsi. Par rapport au témoin négatif (figure 1A), les images de miR199- (figure 1B) et...

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Discussion

Il y a une controverse quant à savoir si cardiomyocytes sont en mesure de réintégrer le cycle cellulaire et de diviser après une blessure et pendant l'homéostasie tissulaire. Les valeurs pour le chiffre d' affaires de base de cardiomyocytes ont été donnés dans la plage comprise entre 1% 1 et 80% 7. De plus , après une lésion cardiaque, l'induction de l' activité du cycle cellulaire et la production de nouveaux cardiomyocytes ont été signalés dans la zone de...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Nous remercions S. Grünberg (Bonn, Allemagne) et P. Freitag (Bonn, Allemagne) pour leur assistance technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Boîte de Pétri 10 cmSarstedt821472
100 µ ; Crépine à cellules mBecton Dickinson GmbH/Falcon352360
Monxime de 2,3-butanedione (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ ; canule d’injection, StericanBraun, Melsungen4657519
de calibre 20Becton Dickinson GmbH301300
Plaques à 24 puitsBecton Dickinson GmbH/Falcon353047
2-Méthyl-butaneCarl Roth GmbH + Co. KG3927.1
solution de formaldéhyde à 37 %AppliChem GmbH  ;A0936,1000
Robinet d’arrêt à 3 voiesB. Braun Medical Inc.16494C
Seringue de 50 mLB. Braun Medical Inc.8728810F
70 % éthanolOtto Fischar GmbH27669
Anticorps secondaire conjugué à Alexa-FluorJackson ImmunoResearch115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53, souris IgGSigma-Aldrich, SteinheimA7811
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Microplaque de culture cellulaire, 96 puits, Demi-zoneGreiner bio-one675986
Collagenase BRoche11088815001
microscope confocal Eclipse Ti-ECryostat Nikon
CM 3050SLeica
Jackson Immuno Research, Suffolk, GB017-000-121
Dulbecco’s Phosphate Buffered SalineSigma-AldrichD8537
EDTASigma-AldrichE4884
sérum de veau fœtalPromoCell, Heidelberg
Solution de formaldéhyde (4 %)PanReac AppliChemA3697
Gélatine de peau de porc, Type ASigma-Aldrich, SteinheimG2500
lamelles de verreVWR631-0146
GlucoseSigma-AldrichG7021
Tube d’extension HeidelbergerIMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
Heparin-NatriumRatiopharm5394.02.00
HEPESSigma-AldrichH3375
HistoBond lames de microscopeMarienfeld0810000
Hoechst 33342 (1  ; mg/mL)Sigma Aldrich, TaufkirchenB2261
Seringue à insulineBecton Dickinson GmbH300334
Iscove' s ModifiéDulbecco' s Medium (IMDM)Gibco/Life Technologies, Darmstadt21980-032
KClSigma-AldrichP9333
LamininCorning354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse TiNikoninstruments, Dü ;
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies, Darmstadt13778075
Souris IgG Cy5 (âne)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2Sigma-AldrichM8266
microcentrifugeuse tubeSarstedt72690
Mini shakerVWR12620-940
mirVana miRNA mimic, has-miR199a-3pAmbion/Thermo Fischer Scientific4464066
Biopsie MouleSakura Finetek/ VWR4565
M-slide 8-well ibiTreatibidi80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
négatif control(ARN brouillé)Ambion/Thermo Fischer ScientificAM4611
Kit de dissociation cardiaque néonataleMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments, Dü ;
Acides aminés non essentiels, NEAAGibco/Life Technologies, Darmstad11140-035
Opti-MEM, Sérum réduitMedium Gibco51985-026
P21-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
P27-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
Pénicilline/StreptomycineGibco/Life Technologies, Darmstadt15140-122
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Sigma-Aldrich, Steinheim14190-094
Milieu de montage à l’alcool polyvinylique avec DABCO® ;, anti-décolorationSigma-Aldrich10981
RNase AQiagen1007885
RNaseZapInvitrogen/Life Technologies, DarmstadtAM9780
récipients pour échantillonsVitlab80731
Pipette sérologiqueGreiner607180
logiciel NIS ElementsNikon
SucroseSigma-AldrichS0389
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek/ VWR25608-930
ToPro3 iodure (642/661)Moléculaire sondes/ThermoFisher ScientificT3605
TrisSigma-AldrichT1503
Triton XFluka93418
Triton X-100Fluka93418
TrypsineSigma-AldrichT1426
Agglutinine de germe de blé (WGA) Fluorescéine marquée VectorLaboratoriesVEC-FL-1021-5
Anticorps anti-alpha-actinineSigma-AldrichA7811
&beta ;-MercaptoéthanolSigma-Aldrich, SteinheimM3148
aiguille Sérum d’âne sseldorfsseldorf

Références

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33(2015).
  3. Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
  4. Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076(2012).
  5. Eulalio, A., et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration. Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).
  6. Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
  7. Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).
  8. Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).
  9. Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
  10. Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation. J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).
  11. Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).

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