Method Article

Visualisation des variations du cycle cellulaire et détermination de nucléation dans postnatales cardiomyocytes

DOI:

10.3791/55204

⸱

February 24th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Physiology I, University of Bonn

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire dans les cardiomyocytes, nous présentons des protocoles utilisant deux lignées de souris transgéniques : les souris transgéniques Myh6-H2B-mCh, pour l’identification sans équivoque des noyaux de cardiomyocytes, et les souris CAG-eGFP-anillin, pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire.

Abstract

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Les cardiomyocytes sont sujets à des variations du cycle cellulaire, telles que l’endoréduplication (cycles continus de synthèse de l’ADN sans caryokinésie ni cytokinèse) et la mitose acytocinétique (caryokinèse mais pas de cytokinèse). De telles variations atypiques du cycle cellulaire aboutissent à des cellules polyploïdes et multinucléées plutôt qu’à une division cellulaire. Par conséquent, pour déterminer le renouvellement et la régénération cardiaques, il est d’une importance cruciale d’identifier correctement les noyaux des cardiomyocytes, le nombre de noyaux par cellule et l’état de leur cycle cellulaire. Cela est particulièrement vrai pour l’utilisation de marqueurs nucléaires pour identifier l’activité du cycle cellulaire, tels que les analogues de la thymidine Ki-67, PCNA ou pHH3. Nous présentons ici des méthodes de reconnaissance des cardiomyocytes et de leur nucléarité et de détermination de l’activité de leur cycle cellulaire. Nous utilisons deux systèmes transgéniques publiés : la lignée de souris transgéniques Myh6-H2B-mCh, pour l’identification sans équivoque des noyaux de cardiomyocytes, et la lignée de souris CAG-eGFP-anilline, pour distinguer la division cellulaire des variations du cycle cellulaire. Combinés, ces deux systèmes facilitent l’étude de la régénération et de la plasticité cardiaques.

Introduction

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L'identification correcte des noyaux de cardiomyocytes et l'état du cycle cellulaire est d'une importance cruciale pour la détermination du chiffre d'affaires du muscle cardiaque et de la régénération. Cela est particulièrement vrai pour l'utilisation de marqueurs nucléaires, tels que pHH3, Ki-67, ou des analogues de la thymidine pour identifier l'activité du cycle cellulaire. Comme la capacité proliférative des cardiomyocytes de mammifères adultes est très faible 1, une fausse identification d'un noyau positif pour un marqueur d'un noyau de cardiomyocytes de prolifération pourrait faire une différence cruciale ....

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Protocol

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Toutes les procédures de ce protocole impliquant des animaux étaient en conformité avec les normes d'éthique de l'Université de Bonn et conformes aux lignes directrices de la directive 2010/63 / UE du Parlement européen sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques.

1. In Vitro Visualisation de l' activité du cycle cellulaire en postnatale cardiomyocytes

  1. Postnatale cardiomyocytes dissociation
    1. préparations pré-expérimentales
      1. Préparer un milieu de culture (IMDM, 1% Pénicilline / Streptomycine, 1% d'acides aminés non essentiels, 0,1% de β-mercaptoéthanol); moyen 1: ajout....

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Results

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Afin d'analyser les effets de siRNA / miARN sur l'activité du cycle cellulaire de cardiomyocytes postnatales in vitro, les cardiomyocytes de souris Myh6-H2B-MCH / CAG-eGFP-anillin double transgéniques ont été isolés le jour postnatal 3 (P3) et transfectées avec activité induisant le cycle cellulaire miR199 5 ARNsi de p27 et FZR1 ARNsi. Par rapport au témoin négatif (figure 1A), les images de miR199- (figure 1B) et

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Discussion

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Il y a une controverse quant à savoir si cardiomyocytes sont en mesure de réintégrer le cycle cellulaire et de diviser après une blessure et pendant l'homéostasie tissulaire. Les valeurs pour le chiffre d' affaires de base de cardiomyocytes ont été donnés dans la plage comprise entre 1% 1 et 80% 7. De plus , après une lésion cardiaque, l'induction de l' activité du cycle cellulaire et la production de nouveaux cardiomyocytes ont été signalés dans la zone de.......

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Disclosures

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Acknowledgements

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Nous remercions S. Grünberg (Bonn, Allemagne) et P. Freitag (Bonn, Allemagne) pour leur assistance technique.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Boîte de Pétri 10 cmSarstedt821472
100 µ ; Crépine à cellules mBecton Dickinson GmbH/Falcon352360
Monxime de 2,3-butanedione (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ ; canule d’injection, StericanBraun, Melsungen4657519
de calibre 20Becton Dickinson GmbH301300
Plaques à 24 puitsBecton Dickinson GmbH/Falcon353047
2-Méthyl-butaneCarl Roth GmbH + Co. KG3927.1
solution de formaldéhyde à 37 %AppliChem GmbH  ;A0936,1000
Robinet d’arrêt à 3 voiesB. Braun Medical Inc.16494C
Seringue de 50 mLB. Braun Medical Inc.8728810F
70 % éthanolOtto Fischar GmbH27669
Anticorps secondaire conjugué à Alexa-FluorJackson ImmunoResearch115-605-205
Alpha-Aktinin EA-53, souris IgGSigma-Aldrich, SteinheimA7811
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Microplaque de culture cellulaire, 96 puits, Demi-zoneGreiner bio-one675986
Collagenase BRoche11088815001
microscope confocal Eclipse Ti-ECryostat Nikon
CM 3050SLeica
Jackson Immuno Research, Suffolk, GB017-000-121
Dulbecco’s Phosphate Buffered SalineSigma-AldrichD8537
EDTASigma-AldrichE4884
sérum de veau fœtalPromoCell, Heidelberg
Solution de formaldéhyde (4 %)PanReac AppliChemA3697
Gélatine de peau de porc, Type ASigma-Aldrich, SteinheimG2500
lamelles de verreVWR631-0146
GlucoseSigma-AldrichG7021
Tube d’extension HeidelbergerIMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
Heparin-NatriumRatiopharm5394.02.00
HEPESSigma-AldrichH3375
HistoBond lames de microscopeMarienfeld0810000
Hoechst 33342 (1  ; mg/mL)Sigma Aldrich, TaufkirchenB2261
Seringue à insulineBecton Dickinson GmbH300334
Iscove' s ModifiéDulbecco' s Medium (IMDM)Gibco/Life Technologies, Darmstadt21980-032
KClSigma-AldrichP9333
LamininCorning354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse TiNikoninstruments, Dü ;
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies, Darmstadt13778075
Souris IgG Cy5 (âne)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2Sigma-AldrichM8266
microcentrifugeuse tubeSarstedt72690
Mini shakerVWR12620-940
mirVana miRNA mimic, has-miR199a-3pAmbion/Thermo Fischer Scientific4464066
Biopsie MouleSakura Finetek/ VWR4565
M-slide 8-well ibiTreatibidi80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
négatif control(ARN brouillé)Ambion/Thermo Fischer ScientificAM4611
Kit de dissociation cardiaque néonataleMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments, Dü ;
Acides aminés non essentiels, NEAAGibco/Life Technologies, Darmstad11140-035
Opti-MEM, Sérum réduitMedium Gibco51985-026
P21-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
P27-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
Pénicilline/StreptomycineGibco/Life Technologies, Darmstadt15140-122
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Sigma-Aldrich, Steinheim14190-094
Milieu de montage à l’alcool polyvinylique avec DABCO® ;, anti-décolorationSigma-Aldrich10981
RNase AQiagen1007885
RNaseZapInvitrogen/Life Technologies, DarmstadtAM9780
récipients pour échantillonsVitlab80731
Pipette sérologiqueGreiner607180
logiciel NIS ElementsNikon
SucroseSigma-AldrichS0389
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek/ VWR25608-930
ToPro3 iodure (642/661)Moléculaire sondes/ThermoFisher ScientificT3605
TrisSigma-AldrichT1503
Triton XFluka93418
Triton X-100Fluka93418
TrypsineSigma-AldrichT1426
Agglutinine de germe de blé (WGA) Fluorescéine marquée VectorLaboratoriesVEC-FL-1021-5
Anticorps anti-alpha-actinineSigma-AldrichA7811
&beta ;-MercaptoéthanolSigma-Aldrich, SteinheimM3148
aiguille Sérum d’âne sseldorfsseldorf

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell ....

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