Ici, nous présentons une méthode de montage polyvalente qui permet l’imagerie à long terme en accéléré du développement postérieur du corps d’embryons de poisson-zèbre vivants sans perturber le développement normal.
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Article de méthode
Une méthode de montage polyvalent pour l'imagerie à long terme du développement Zebrafish
Dans cet article
Résumé
Résumé
embryons de poisson zèbre offrent un système expérimental idéal pour étudier les processus morphogénétiques complexes en raison de leur facilité d'accès et de transparence optique. En particulier, l'allongement du corps postérieur est un processus essentiel dans le développement embryonnaire par lequel de multiples déformations des tissus agissent ensemble pour diriger la formation d'une grande partie de l'axe du corps. Afin d'observer ce processus en imagerie time-lapse à long terme, il est nécessaire d'utiliser une technique de montage qui permet un soutien suffisant pour maintenir les échantillons dans l'orientation correcte pendant le transfert au microscope et acquisition. En outre, le montage doit également assurer la liberté de mouvement suffisante pour l'excroissance de la région postérieure du corps sans affecter son développement normal. Enfin, il doit y avoir un certain degré de polyvalence de la méthode de montage pour permettre l'imagerie sur diverses imagerie set-ups. Ici, nous présentons une technique de montage pour l'imagerie du développement du corps postérieur elongation dans le zebrafish D. rerio. Cette technique implique des embryons de telle sorte que les régions tête et jaune sac sont presque entièrement inclus dans agarose de montage, tout en laissant la région postérieure du corps pour allonger et se développer normalement. Nous allons montrer comment cela peut être adapté à la verticale, inversé et vertical microscopie optique-feuille set-ups. Bien que ce protocole met l'accent sur les embryons pour l'imagerie du corps postérieur de montage, il pourrait facilement être adapté pour l'imagerie en direct de plusieurs aspects du développement du poisson zèbre.
Introduction
Postérieur corps d'allongement est un processus essentiel dans le développement embryonnaire de l'embryon qui se prolonge pour former une partie importante de l'axe du corps. Il est un exemple d'un processus complexe par lequel morphogénétique comportements cellulaires multiples agissent de façon coordonnée pour générer la morphogenèse au niveau des tissus individuels. Ces déformations du tissu différentiel agissent alors ensemble pour produire l'allongement du corps postérieur au niveau de l'ensemble de la structure. Pour comprendre comment ces processus sont contrôlés et coordonnés au cours du développement, nous devons être en mesure de sui....
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Protocole
1. Préparation des solutions et Pulled Verre aiguille
- Faire une solution 25x stock de Tricaine (3-amino ester éthylique de l'acide benzoïque, également appelé le 3-aminobenzoate) à 4 mg / ml dans 20 mM Tris pH 8,8 et apporter cette solution est à pH 7. aliquote de 4 ml et conserver à -20 ° C.
NOTE: L'anesthésie Tricaine agit de préférence sur les canaux sodiques voltage-dépendants neuronaux bloquant ainsi des contractions musculaires et le mouvement 6. - Préparer une solution de travail de tricaïne à une concentration finale de 0,17 mg / ml dans du milieu d'embryon E3. 7
NOTE....
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Résultats
Le protocole décrit ci-dessus détaille une technique versatile pour le montage des embryons de poisson zèbre pour l'imagerie laps de temps à long terme. Un exemple de ceci est représenté sur la figure 2A et d' animation / vidéo Figure 1. Les embryons ont été injectés au stade 1 cellule avec l'ARNm codant pour la protéine fluorescente photoconvertible kikumeGR. Au stade 15 somites, ils ont été montés comme décrit ci-dessus et imagée pendant 12.......
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Discussion
Cette technique de montage permet embryons à conserver encore pendant le transfert au microscope et plus des expériences d'imagerie time-lapse à long terme visant à la suite postérieure allongement du corps à des échelles de longueur multiples. En outre, il est souple en ce qu'elle permet d'imagerie sur la microscopie en position verticale et inversée set-up, et une suggestion est faite pour savoir comment cela peut être adapté en outre pour SPIM orienté verticalement.
Une étape .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Estelle Hirsinger : Financement de base de l’Institut Pasteur et de l’Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger est du Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon a été financé par l’Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), puis une bourse Roux (Institut Pasteur) puis une bourse AFM-Téléthon (numéro 16829). Il est maintenant soutenu par une bourse Sir Henry Dale du Wellcome Trust et de la Royal Society.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| CONSOMMABLES | |||
| Plats à fond de verre | Mattek | P35-1.5-10-C | Boîte de Pétri de 35 mm, micropuits de 10 mm. N° 1.5 Capillaires en verre |
| de couverture pour aiguilles d’injection | ; Sutter ; | BF 120-94-10 | Nous utilisons du verre orosilicate avec filament, OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, longueur 10 cm. Cependant, les aiguilles à filament ne sont pas nécessaires et la plupart des aiguilles standard d’injection devraient fonctionner. |
| Micro-scalpel | Feather | P-715 | Scalpel ophtalmique jetable Micro Feather avec manche en plastique |
| Pipettes | 230 mm de long | ||
| RÉACTIFSTricaïne | |||
| Sigma-Aldrich | A5040 | ||
| Agarose à bas point de fusion | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| < SOLIDE>ÉQUIPEMENT | |||
| Pince fine ; | FINE SCIENCE TOOLS GMBH ; | 11252-30 ; | Dumont #5 |
| Extracteur d’aiguille ; | Sutter ; | P97 | Extracteur d’aiguille à filament chauffant |
| Microscope binoculaire de dissection | Leica | S8 Apo |
Références
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmen....
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Réimpressions et autorisations
