L'agrégation magnétique de cellules souches 3D et bioréacteurs Maturation pour Cartilage régénération

Résumé

Chondrogenèse de cellules souches nécessite un réglage fin des conditions de culture. Nous présentons ici une approche magnétique pour les cellules de condensation, une étape essentielle pour initier chondrogenèse. De plus, nous montrons que la maturation dynamique dans un bioréacteur applique une stimulation mécanique aux constructions cellulaires et améliore la production de la matrice extracellulaire cartilagineuse.

Résumé

Ingénierie Cartilage reste un défi en raison des difficultés à créer un implant fonctionnel in vitro similaire au tissu natif. Une approche récemment exploré pour le développement de substituts autologues implique la différenciation des cellules souches en chondrocytes. Pour lancer ce chondrogenèse, un degré de compactage des cellules souches est nécessaire; Par conséquent, nous avons démontré la faisabilité de cellules magnétiquement à condensation, à l'intérieur des échafaudages épais et sans échafaudage, en utilisant des sources de champ magnétique miniaturisé attracteurs cellulaires. Cette approche magnétique a également été utilisé pour guider la fusion globale et de construire sans échafaudage, organisé, en trois dimensions (3D) tissus de plusieurs millimètres en taille. En plus d'avoir une taille accrue, le tissu formé par fusion à entraînement magnétique a présenté une augmentation significative de l'expression du collagène II, et on a observé une tendance similaire pour l'expression de l'aggrécane. Comme le cartilage natif a été soumis à des forces tchapeau influencé sa structure 3D, la maturation dynamique a également été réalisée. Un bioréacteur qui fournit des stimuli mécaniques a été utilisé pour la culture des échafauds magnétique ensemencés sur une période de 21 jours. maturation des bioréacteurs largement améliorée chondrogenèse dans les échafauds cellularisées; la matrice extracellulaire obtenue dans ces conditions a été riche en collagène de type II et aggrécane. Ce travail présente le potentiel d'innovation de la condensation magnétique des cellules souches marquées et la maturation dynamique dans un bioréacteur pour une meilleure différenciation chondrogénique, les deux sans échafaudage et à l'intérieur de polysaccharide échafauds.

Introduction

Les nanoparticules magnétiques sont déjà utilisés dans la clinique comme agents de contraste pour l'imagerie par résonance magnétique (IRM), et leurs applications thérapeutiques garder en expansion. Par exemple, il a récemment été démontré que les cellules marquées peuvent être manipulées in vivo en utilisant un champ magnétique externe et peuvent être dirigées et / ou maintenues à un site défini d'implantation ^{1, 2, 3.} Dans la médecine régénérative, ils peuvent être utilisés pour concevoir des tissus organisés in vitro ^4, y compris le tissu vasculaire ^{5, 6, 7, 8} os, cartilage et ^9.

Le cartilage articulaire est immergé dans un environnement aseptique, ce qui rend la réparation des composants de la matrice extracellulaire sont très limitées lorsque les dommages se produisent. Pour cette raison, recherch se concentre actuellement sur l'ingénierie des remplacements de cartilage hyalin qui peuvent être implantés sur le site de défaut. Afin de produire un remplacement autologue, certains groupes de recherche étudient l'utilisation de chondrocytes autologues en tant que source de cellules ^{10, 11,} tandis que d' autres mettent l' accent sur la capacité des cellules souches mésenchymateuses (MSC) de se différencier en chondrocytes ^{12, 13.} Dans des études antérieures récapitulés ici, nous avons choisi MSC, comme prélèvement de moelle osseuse est assez simple et ne nécessite pas le sacrifice de chondrocytes en bonne santé, qui risquent de perdre leur phénotype ^14.

Une première étape essentielle pour initier la différenciation chondrogénique des cellules souches est leur condensation. Les agrégats cellulaires sont couramment formés en utilisant soit la centrifugation ou la culture de Micromass ^15; Cependant, ces procédés de condensation neither présenter le potentiel de créer des agrégats de cellules à l'intérieur des échafaudages d'épaisseur, ni la possibilité de contrôler la fusion des agrégats. Dans cet article, nous décrivons une approche novatrice de condensation des cellules souches en utilisant un marquage magnétique MSC et attraction magnétique. Cette technique a été prouvée pour former des constructions 3D sans échafaudage par l' intermédiaire de la fusion des agrégats avec l'autre pour obtenir un tissu cartilagineux échelle millimétrique ^9. ensemencement magnétique de échafauds épais et grand a également permis la possibilité d'augmenter la taille du tissu d'ingénierie, la conception d'une forme plus facilement utile pour l'implantation et la diversification du potentiel pour les applications cliniques de réparation du cartilage. Ici, nous détaillons le protocole pour l'ensemencement magnétique du MSC en supports poreux constitués de polysaccharides naturels, le pullulane et le dextrane, les échafaudages précédemment utilisé pour confiner des cellules souches ^{16, 17.} la différenciation chondrogénique était finally effectuée dans un bioréacteur pour assurer la diffusion des éléments nutritifs et de gaz en continu dans le noyau de la matrice des échafaudages ensemencés avec une densité élevée de cellules. En plus de fournir des éléments nutritifs, les facteurs de croissance chondrogéniques, et le gaz aux cellules, le bioréacteur a offert la stimulation mécanique. Dans l'ensemble, la technologie magnétique pour confiner les cellules souches, combinée à la maturation dynamique dans un bioréacteur, peut améliorer considérablement la différenciation chondrogénique.

Protocole

1. La construction des dispositifs magnétiques

REMARQUE: Les dispositifs utilisés pour l' ensemencement des cellules varient en fonction de l'application (Figure 1). Pour former des agrégats, le nombre de cellules est limité à 2,5 x 10 ⁵ / agrégat, de sorte que les pointes magnétiques doivent être très minces (750 um de diamètre). Pour les semences 1,8 cm ^2/7 échafauds mm d'épaisseur, les aimants doivent être plus grands (3 mm de diamètre) et assureront la migration des cellules à travers les pores de l'échafaudage.

1. Construction d'un dispositif à micro-aimants pour la formation d' agrégats (figure 1A)
   1. Faire des micro-trous avec un foret de 0,8 mm à travers des plaques d'aluminium (3 cm de diamètre et de 6 mm d'épaisseur).
   2. Insérer une pointe magnétique (750 um de diamètre) dans chaque trou de la plaque.
   3. Placez ce disque sur un aimant néodyme permanent, qui assure l'aimantation à saturation.
2. La construction d'un dispositif d'ensemencement d'échafaudage ( Figure 1B)
   1. Couper le polystyrène dur en 2,4 cm ² carrés.
   2. Insérez 9 petits aimants (3 mm de diamètre, 6 mm de long) à une distance égale sur une zone de surface de 1,6 cm ^_2.
   3. Placez cet appareil sur un aimant néodyme permanent.

2. Tige marquage des cellules

NOTE: Les cellules souches ont été marquées avec 0,1 mM de nanoparticules magnétiques pendant 30 min (2,6 ± 0,2 pg fer / cellule) pour former des agrégats, alors qu'ils ont été marquées avec 0,2 mM de nanoparticules magnétiques pendant 30 min (5 ± 0,4 pg fer / cellule) aux plants échafauds. Ces concentrations de nanoparticules et des temps d'incubation ont été utilisés précédemment et publié pour les cellules MSC et d' autres ^{18, 19,} et il a été déterminé que les nanoparticules touchées ni la viabilité cellulaire , ni la capacité de différenciation MSC. La masse de fer incorporée par les cellules souches a été mesurée par simple-cell magnétophorèse ^{19, 20.}

1. Culture de cellules souches mésenchymateuses humaines (MSC) dans un milieu de croissance de cellules souches mésenchymateuses intégral (MSCGM) à 37 ° C et 5% de CO ₂ , jusqu'à proximité de la confluence (~ 90%).
2. Préparer la solution magnétique de marquage en mélangeant 0,1 ou 0,2 mM d' oxyde de fer revêtu de citrate-maghémite (γFe ₂ O _3; core: 8 nm de diamètre) dans du milieu de 5A de McCoy sans sérum modifié au Roswell Park Memorial Institute (RPMI) sans glutamine et contenant 5 mM de citrate de sodium.
3. Jeter le milieu, laver les cellules avec du milieu RPMI exempt de sérum sans glutamine, et ajouter 10 ml de solution de nanoparticules d'oxyde de fer par 150 cm ² flacon de culture, le volume minimum nécessaire pour couvrir toutes les cellules.
4. Incuber pendant 30 min à 37 ° C et 5% de CO _2, puis jeter la solution de nanoparticules. Rincer pendant 5 min avec du milieu RPMI exempt de sérum sans glutamine à internaliser le nanoparticles encore attachés à la membrane plasmatique.
5. Jeter le milieu RPMI et ajouter 25 ml de milieu complet MSCGM par flacon. Incuber pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO _2.

3. Ensemencement cellulaire magnétique

1. préparer fraîchement le moyen chondrogénique utilisant Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) de glucose élevé avec de la L-glutamine par addition de 50 uM d'acide L-ascorbique-2-phosphate, 0,1 uM de dexaméthasone, 1 mM de pyruvate de sodium, 0,35 mM de L-proline, 1% de culture universelle supplément contenant de l'insuline, de la transferrine humaine et de l'acide sélénieux (ITS-Premix), et 10 ng / ml facteur transformant-bêta de croissance 3 (TGF-β3).
2. Détacher les cellules magnétiques en utilisant 8 ml de 0,05% de trypsine-EDTA par 150 cm ² flacon de culture et centrifuger les cellules dissociées à 260 x g pendant 5 min. Aspirer le moyen et compter les cellules remises en suspension.
3. Placer une boîte de Pétri de culture cellulaire à fond en verre (35 mm) au-dessus des deux dispositifs magnétiques.
4. À Mformer des agrégats agnetically, ajouter 3 ml de milieu chondrogénique à la boîte de Petri et déposer doucement le plus petit volume possible (pas plus de 8 ul) contenant 2,5 x 10 ⁵ cellules marquées par agrégat (jusqu'à 16 agrégats peuvent être déposés). Laisser la boîte de Pétri pendant 20-30 min sans le déplacer, ce qui permet de former des sphéroïdes, puis placer le dispositif complet, y compris la boîte de Petri contenant des 16 agrégats dans l'incubateur à 37 ° C et 5% de CO _2.
5. agrégats de contrôle de formulaire suivant le même protocole et remplacer le milieu par du milieu complet sans chondrogénique TGF-β3.
   1. Pour générer la construction d'agrégat 3D, placer 2 agrégats en contact le jour 8 pour former 8 doublets et d'initier la fusion. Le jour 11, fusion 2 doublets pour former 4 quadruplés. Enfin, les 4 quadruplés fusible le jour 15 pour obtenir la structure finale.
   2. Dans le même temps, former des agrégats par centrifugation de 2,5 x 10 ⁵ cellules souches marquées à 26015; g pendant 5 min dans des tubes de 15 ml avec 1,5 ml de milieu chondrogénique avec ou sans TGF-β3 (pour l'échantillon et de contrôle, respectivement).
6. Pour magnétiquement échafauds de semences, placer chaque échafaudage séché dans une boîte de Petri. Utilisation des échafaudages poreux de polysaccharide en pullulane / dextran ^21. Pour chaque échafaudage, diluer 2 x 10 ⁶ cellules souches marquées dans 350 ul de milieu chondrogénique sans TGF-β3 et la pipette soigneusement les cellules sur l'échafaudage.
   1. Incuber pendant 5 min à 37 ° C pour permettre la pénétration cellulaire complète à l'intérieur de l'échafaudage, puis ajouter doucement 3 ml de milieu chondrogénique avec ou sans TGF-β3 (pour l'échantillon ou du contrôle, respectivement) à la boîte de Petri.
   2. Incuber l'échafaudage cellularisée sur son dispositif magnétique à 37 ° C et 5% de CO ₂ pendant 4 jours pour permettre la migration des cellules à travers les pores de l' échafaudage et de confinement.
7. Dans le même temps, les semences échafaudages avec 2 x 10 ⁶ cellules souches marquées suivant la même méthode et laisser incuber sans l'aimant pour obtenir échafauds uniformément ensemencés comme témoins positifs.

4. Différenciation en chondrocytes

NOTE: Après 4 jours d'incubation, retirez les aimants et continuer la maturation chondrogénique soit dans une boîte de Petri (conditions statiques) ou dans un bioréacteur (conditions dynamiques). Des échantillons de contrôle négatifs sont arrivés à échéance dans des conditions statiques avec un milieu chondrogénique sans TGF-β3.

1. Dans des conditions statiques, garder les échafauds cellularisées ou d'agrégats dans la même boîte de Petri. Changer le support chondrogénique deux fois par semaine pendant 21 jours.
2. Dans des conditions dynamiques, préparer le bioréacteur.
   1. Couper un tube en silicone à la longueur appropriée selon le protocole du fabricant.
   2. Autoclave tous les matériaux: chambre de culture de 500 ml, tubes, rotateur deux voies, et des cages.
   3. Placez les pièces dans un bioréacteur microbio stérilestation logique de sécurité. Connectez le tuyau aux rotateurs 2 voies et à la chambre de culture suivant les instructions du fabricant.
   4. Transférer délicatement les échafauds cellularisées dans des cages stérilisées à l'aide d'une spatule stérile. Placez 2 par cage échafauds. Lorsque les cages sont prêts, les insérer dans les aiguilles du couvercle pour les empêcher de se déplacer pendant la rotation supplémentaire. Remplir la chambre de culture avec du milieu chondrogénique et le fermer avec le couvercle contenant les cages.
3. Mettre en marche la pompe péristaltique pour remplir le tube avec le milieu chondrogénique et pour éliminer les bulles d'air.
4. Placer et fixer la chambre remplie dans le moteur du bioréacteur et tourner sur l'ordinateur, qui commande les rotations à la fois du bras et de la chambre.
5. Appliquer une vitesse de rotation de 5 tours par min (rpm) sur le bras et la chambre. Régler la pompe péristaltique à un débit de 10 tours par minute pour l'alimentation continue des échafaudages cellularisées.

5. Extraction de l'ARN et l'analyse d'expression génique

REMARQUE: avant l'extraction de l'ARN, digérer les échafauds avec une solution enzymatique.

1. Préparer 1 ml de solution enzymatique par addition de 100 ul de pullulanase (40 U / ml) et 50 ul de dextranase (60 mg / ml) à 850 ml de milieu DMEM exempt de sérum.
2. Rincer les échafauds deux fois avec du milieu DMEM exempt de sérum, éliminer le milieu et ajouter 800 ul de la solution enzymatique par échafaudage. Incuber pendant 15-30 minutes à 37 ° C sous agitation douce.
3. Lorsque l'échafaudage est complètement dissous, le transfert de la solution contenant les cellules à un tube de 1,5 ml, centrifuger à 300 g pendant 10 min, aspirer soigneusement le milieu, rincer deux fois avec stérile 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS), centrifuger à 300 x g pendant 10 min, et remettre en suspension les cellules dans la solution d'isolement d'ARN.
4. Pour extraire l'ARN à partir des agrégats, placer les sphéroïdes dans la solution d'isolement d'ARN etécraser complètement les utilisant un homogénéisateur avant d'effectuer l'extraction d'ARN.
5. Isoler l'ARN en utilisant un kit d'extraction d'ARN total selon les instructions du fabricant.
6. Synthétiser de l'ADN complémentaire à partir de 400 ng d'ARN total en utilisant la transcriptase inverse selon les instructions du fabricant, en utilisant des amorces aléatoires de 250 ng, 1 pi de mélange de dNTP (10 mM chacun), et 40 U / ml d'inhibiteur de RNase; le volume final de la réaction est de 20 pi. A la fin de la réaction, ajouter 80 ul d'eau distillée pour obtenir un volume final de 100 pi.
7. Pour la réaction en chaîne par polymérase quantitative (PCR), en utilisant un mélange de PCR contenant un réactif fluorescent pour quantifier l'expression relative des gènes d'intérêt, tels que l'aggrécane (AGC) et le collagène II (Col II), avec 10 × ADNc dilué. Normaliser les niveaux d'expression génique avec le gène ribosomique de référence protéine, Grand, P0 (RPLP0). Effectuer les calculs avec le 2 ^- formule ^AACtOù AACt = ACt de l'état différencié - signifie ACt de condition de commande, et chaque ACt représente le CT du gène d'intérêt - le CT du gène de référence (RPLP0).
8. Déterminer les mesures statistiques comme les valeurs moyennes ± l'écart-type de la moyenne (SEM). Effectuer l'analyse avec n ≥ 2 expériences indépendantes. Utilisez le test t de Student pour analyser les différences statistiques entre les granulés centrifugés et magnétiques (* fusions p <0,05). Déterminer l'importance avec pour analyser les différences statistiques entre les échafauds différenciés et avec l'échafaudage de contrôle test de Kruskal-Wallis (une ANOVA non paramétrique) (* p <0,05).

6. Analyse anatomopathologique

1. Rincer les échafaudages cellularisées ou d'agrégats avec 1 x PBS stérile, les fixer dans 10% de solution de formaline pendant 1 h à température ambiante, puis rincer avec 1 x PBS.
2. Retirez le PBS, intégrer les échantillons dans cuttin optimaleg composé de température (OCT), et les congeler dans un bain d'isopentane immergé dans de l'azote liquide. Conserver l'échantillon à -20 ° C. Couper les échantillons avec un cryostat pour obtenir 8 um cryosections pour les agrégats ou de 12 pm pour les échafaudages cellularisées.
3. Colorer les cryosections avec une solution de bleu de toluidine à 0,5% pendant 2 minutes, rincer à l'eau du robinet, déshydrater avec 100% d'éthanol, en utilisant du toluène clarifier, et monter les lames avec un support de montage pour la microscopie optique.

Résultats

Tout d' abord, les agrégats peuvent être formés individuellement à l' aide des micro-aimants par dépôt de 2,5 x 10 ⁵ cellules souches marquées (Figure 2A). Ces agrégats individuels (~ 0,8 mm de diamètre) peuvent ensuite être fusionnées dans des structures plus grandes, grâce à la fusion séquentielle, induite magnétiquement. Par exemple, le jour 8 de maturation chondrogénique, les agrégats ont été placés en contact deux à deux pour former des doublets; quadrupl...

Discussion

Tout d'abord, parce que les techniques présentées ici reposent sur l'intériorisation de nanoparticules magnétiques, une question importante est le résultat des nanoparticules une fois qu'ils se localisent dans les cellules. Il est vrai que les nanoparticules de fer peuvent déclencher une toxicité potentielle ou la capacité de différenciation réduite en fonction de leur taille, le revêtement et le temps d'exposition ^{19, 22.} Cependant, plusieurs ét...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nanoparticules d’oxyde de fer (maghemite) (&gamma ;-Fe2O3)	PHENIX - Université Paris 6	Fabriqué et donné par C. Mé ; Diamètre	moyen de 8,1 nm et charge de surface négative
Échafaudages polysaccharidiques Pullulan/Dextran	LIOAD - Université Nantes	Fabriqué et donné par C. Le Visage	Préparé à partir d’un mélange 75:25 de pullulan/dextran dans des conditions alcalines (10  ; M NaOH). Porosité : 185-205 et micro ; m; Épaisseur : 7  ; mm; Superficie : 1,8 cm2.
Système de régénération TisXell	QuinXell Technologies	QX900-002	Bioréacteur biaxial avec chambre de culture de 500 mL
Cage pour échafaudages : Histosette II M492  ;	VWR	720-0909
Cellules souches mésenchymateuses (CSM)	Lonza	PT-2501	lots indépendants ont été utilisés
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	Pour le milieu complet, ajoutez le BulletKit fourni (contenant du sérum, de la glutamine et des antibiotiques) au DMEM moyen MSCGM
avec Glutamax I	Life Technologies	31966-021	Sans pyruvate de sodium, sans HEPES
RPMI medium 1640, sans Glutamine	Life Technologies	31870-025	Sans pyruvate de sodium, sans HEPES
PBS sans CaCl2 sans MgCl2	Life Technologies	14190-094
0,05 % Trypsine-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Pénicilline (10,000  ; U/mL) / streptomycine (10 000 et micro ; g/mL)	Life Technologies	15140-122
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
Sodium pyruvate solution 100 mM	Sigma	S8636
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Préparer la solution concentrée (25 mM) dans de l’eau distillée de manière extemporanée
L-Proline	Sigma	P5607	Préparez la solution mère de 175 mM diluée dans de l’eau distillée et conservez-la à 4 ° ; C
Dexaméthasone	Sigma	D4902	Préparez la solution mère de 1 mM diluée dans de l’éthanol à 100 % et conservez-la à -20 °C. ° ; C
TGF-bêta 3 protéine 10  ; et micro ; g	Interchim	30R-AT028
Citrate trisodique	VWR	33615.268	Préparez le 1  ; M solution mère diluée dans de l’eau distillée et stockée à 4  ; ° ; C
Pullulanase de Bacillus acidopullulyticus	Sigma	P2986
Dextranase de Chaetomium erraticum	Sigma	D0443
NucleoSpin Kit d’extraction d’ARN	Macherey-Nagel	740955.5
SuperScript II Transcriptase inverse	Life Technologies	18064-014
Aléatoire Apprêt - Hexamère  ;	Promega	C1181	500 & micro ; g/mL : Utiliser du 1/2 dilué et mettre 1 µ ; L par échantillon
ARN recombinants dans l’inhibiteur de ribonucléase	Promega	N2511	40 U/µ ; L : mettre 1 & micro ; L par échantillon
de mélange de nucléotides dNTP de PCR (10  ; mM chacun)	Roche	10842321
SyBr Green PCR Master Mix	Life Technologies	4368708
Step One Plus Real-Time PCR System	Life Technologies	4381792
Formalin solution 10 % neutre tamponnée	Sigma	HT5012
OCT solution	VWR	361603E
Isopentane	Sigma	M32631
Bleu toluidine O	VWR	1.15930.0025
Éthanol absolu	VWR	20821.310
Toluène	VWR	1.08323.1000
Milieu de montage Pertex	Histolab	840
RPLP0 Amorce pour qPCR	Eurogentec		5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3' ; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'Aggrecan
Primer pour qPCR	Eurogentec		5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3' ; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'Collagen
II Primer pour qPCR	Eurogentec		5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3' ; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'