Caractérisation biophysique des fonctions flagellaire moteur

Résumé

Des découvertes récentes suggèrent que les moteurs flagellaires bactériens détectent une variété de signaux environnementaux et se remodèlent en réponse. Les tests de billes discutés ici devraient aider à expliquer le rôle du remodelage dans l’adaptation cellulaire aux facteurs de stress environnementaux.

Résumé

Le rôle des moteurs flagellaires dans la motilité bactérienne et la chimiotaxie est bien compris. Des découvertes récentes suggèrent que les moteurs flagellaires sont capables de se remodeler en réponse à une variété de stimuli environnementaux et font partie des déclencheurs de colonisation de surface et d’infections. Les mécanismes précis par lesquels les moteurs remodèlent et favorisent l’adaptation cellulaire dépendent probablement des attributs moteurs clés. La technique de suivi des billes basée sur le photomultiplicateur présentée ici permet une caractérisation biophysique précise des fonctions motrices, y compris les adaptations de la vitesse du moteur et de la dynamique de commutation. Cette approche offre l’avantage d’un suivi en temps réel et la possibilité de sonder le comportement moteur sur de longues durées. Les protocoles discutés peuvent être facilement étendus à l’étude des moteurs flagellaires chez une variété d’espèces bactériennes.

Introduction

Les moteurs flagellaires permettent aux cellules de nager en tournant des filaments extracellulaires hélicoïdaux. La quantité de couple que le moteur peut générer pour une longueur donnée du flagelle (c’est-à-dire la charge visqueuse) détermine les vitesses de nage. D’autre part, sa capacité à changer le sens de rotation contrôle la migration cellulaire en réponse aux produits chimiques, un processus connu sous le nom de chimiotaxie. La chimiotaxie et la motilité étant des facteurs de virulence ^1-3, les moteurs flagellaires ont été bien caractérisés au fil des années ⁴. De plus en plus de preuves suggèrent maintenant que le moteur agit c....

Protocole

1. Préparation des cellules

1. Faire croître des cultures de nuit de la souche désirée portant l'allèle collant fliC ^15,22 dans du bouillon de tryptone (TB, 1 % de peptone, 0,5 % de NaCl), puis réaliser une inoculation à une dilution de 1:100 dans 10 mL de TB frais. Faire croître la culture à 33 °C dans un incubateur agité jusqu'à une DO₆₀₀ = 0,5.
2. Centrifuger les cellules à 1 500 x g pendant 5 à 7 min et redisperser vigoureusement le culot dans 10 mL de tampon de mobilité stérilisé par filtration (MB ; tampon phosphate 10 mM : 0,05-0,06 M NaCl, 10^-4 M EDTA, 1 µM méthionine, pH 7,0).
3. Répéter l'étape....

Résultats

Le dispositif du photomultiplicateur est illustré dans la figure 1A. Il est important que les photomultiplicateurs (PMT) présentent une grande sensibilité dans la gamme de longueurs d'onde diffusées par les billes d'intérêt. Les PMT utilisés ici fonctionnent dans les domaines visible et proche infrarouge, et ont permis de détecter la lumière diffusée par des billes éclairées par une source lumineuse au tungstène halogène. Les conditions d'éclairage et les tensions d'alime.......

Discussion

Afin de faciliter le suivi du talon attaché et l’estimation correcte des couples moteurs, les informations suivantes doivent être examinées. Lors de la réalisation de ces mesures avec des cellules flagellées, le cisaillement est une étape critique. Le cisaillement réduit le filament flagellaire à un simple talon, garantissant ainsi que la charge visqueuse sur le moteur est principalement due au bourrelet et peut être estimée avec une erreur de 10 % ¹⁶. Le cisaillement améliore également les chances de trouver .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution de poly-L-lysine (0,1 %)	Sigma-Aldrich	P8920	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US
Microsphères de polybilles	Polysciences, Inc.	7307	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US
Seringue Luer Slip Tip 1 mL	Exel Int.	26048	http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge Becton	, Dickinson and Company	427565	http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp
Tube en polyéthylène	Harvard Apparatus	59-8325	http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html
Photomultiplicateur Tubes	Hamamatsu	R7400U-20	Plage de réponse spectrale de 300 à 920 nm, longueur d’onde de crête 630 nm,  ; 0,78 ns temps de réponse  ; http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
3 fentes de précision de 1 mm	Edmund Optics	NT39-908	2 fentes montées perpendiculairement l’une à l’autre sur des tubes photomultiplicateurs
Oscilloscope	Tektronix	TBS 1032B D’autres	marques sont acceptables. Oscilloscope numérique, série TBS 1000B, 2 analogiques, 30 MHz, 500 MSPS, 2,5 kpts  ; http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
Filtre LP/HP 8 pôles	Krohn-Hite	3384	Les marques alternatives sont acceptables. Une gamme de fréquences de 0,1 Hz à 200 kHz est recommandée.   ;   ; http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
Microscope Optiphot	Nikon	NA	N’importe quel microscope à phase verticale ou inversée peut être utilisé. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50 (R :T) Cube Beamsplitter	ThorLabs	BS013