Des découvertes récentes suggèrent que les moteurs flagellaires bactériens détectent une variété de signaux environnementaux et se remodèlent en réponse. Les tests de billes discutés ici devraient aider à expliquer le rôle du remodelage dans l’adaptation cellulaire aux facteurs de stress environnementaux.
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Article de méthode
Caractérisation biophysique des fonctions flagellaire moteur
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le rôle des moteurs flagellaires dans la motilité bactérienne et la chimiotaxie est bien compris. Des découvertes récentes suggèrent que les moteurs flagellaires sont capables de se remodeler en réponse à une variété de stimuli environnementaux et font partie des déclencheurs de colonisation de surface et d’infections. Les mécanismes précis par lesquels les moteurs remodèlent et favorisent l’adaptation cellulaire dépendent probablement des attributs moteurs clés. La technique de suivi des billes basée sur le photomultiplicateur présentée ici permet une caractérisation biophysique précise des fonctions motrices, y compris les adaptations de la vitesse du moteur et de la dynamique de commutation. Cette approche offre l’avantage d’un suivi en temps réel et la possibilité de sonder le comportement moteur sur de longues durées. Les protocoles discutés peuvent être facilement étendus à l’étude des moteurs flagellaires chez une variété d’espèces bactériennes.
Introduction
Les moteurs flagellaires permettent aux cellules de nager en tournant des filaments extracellulaires hélicoïdaux. La quantité de couple que le moteur peut générer pour une longueur donnée du flagelle (c’est-à-dire la charge visqueuse) détermine les vitesses de nage. D’autre part, sa capacité à changer le sens de rotation contrôle la migration cellulaire en réponse aux produits chimiques, un processus connu sous le nom de chimiotaxie. La chimiotaxie et la motilité étant des facteurs de virulence 1-3, les moteurs flagellaires ont été bien caractérisés au fil des années 4. De plus en plus de preuves suggèrent maintenant que le moteur agit comme un mécanocapteur – il détecte mécaniquement la présence de substrats solides 5,6. Cette capacité aide probablement à déclencher la colonisation de surface et les infections 5,7. En conséquence, les mécanismes par lesquels le moteur détecte les surfaces et initie la signalisation sont importants 8,9.
Le moteur flagellaire peut être facilement étudié en attachant le flagelle à un substrat et en observant la rotation cellulaire. Une telle attache a été réalisée pour la première fois par Silverman et Simon, qui ont travaillé avec un mutant polyhook chez E. coli et ont réussi à fixer des crochets à des substrats de verre avec des anticorps anti-crochet 10. Le test sur cellules attachées a permis aux chercheurs d’étudier les réponses de l’interrupteur moteur à une variété de stimuli chimiques. Par exemple, Segall et ses collègues ont stimulé chimiquement des cellules attachées à l’aide de pipettes iontophorétiques. Les changements correspondants dans lebiais CW (la fraction du temps pendant laquelle les moteurs tournent dans le sens des aiguilles d’une montre, CW) leur ont permis de mesurer la cinétique d’adaptation dans le réseau de chimiotaxie 11,12. Bien que le test des cellules captives ait été efficace pour étudier les réponses des commutateurs, il n’a pu offrir des informations sur la mécanique motrice que sur une gamme limitée de charges visqueuses 13. Pour surmonter ce problème, Ryu et ses collègues ont attaché des billes sphériques en latex à des bouts de filament sur des cellules collées à des surfaces. Les billes ont ensuite été suivies à l’aide d’une interférométrie à focale arrière avec des pièges optiques faibles 14. En travaillant avec des billes de différentes tailles, les chercheurs ont pu étudier le moteur sur une gamme beaucoup plus large de charges. Ce test a ensuite été amélioré par Yuan et Berg, qui ont mis au point une technique de suivi de billes basée sur un photomultiplicateur combinée à un éclairage laser en fond noir. Leur méthode a permis de suivre des nanobilles d’or attachées qui étaient si minuscules (~ 60 nm) que les résistances visqueuses externes étaient plus faibles par rapport aux résistances visqueuses internes à la rotation 15,16. Cela a conduit à la mesure des vitesses maximales réalisables chez E. coli (~ 300 Hz). Chez V. alginolyticus, des dosages similaires ont permis de mesurer les vitesses de rotation à des charges visqueuses intermédiaires (~ 700 Hz) 17. En permettant de mesurer les réponses motrices sur toute la gamme possible de charges visqueuses (de la charge nulle au quasi-décrochage), les tests de billes ont fourni un outil biophysique important pour comprendre le processus de génération de couple 18,19.
Récemment, nous avons modifié le test de Yuan-Berg pour inclure des pinces optiques qui nous ont permis d’appliquer des stimuli mécaniques précis à des moteurs individuels 6. En utilisant cette technique, nous avons montré que les générateurs de force qui font tourner le moteur sont des mécanocapteurs dynamiques - ils se remodèlent en réponse aux changements de charges visqueuses. Il est possible qu’une telle détection de charge déclenche la différenciation cellulaire en bactéries grouillantes, bien que les mécanismes restent flous. Il est également probable que les moteurs flagellaires d’autres espèces soient également mécanosensibles 20, bien que les preuves directes manquent. Ici, nous discutons de l’approche basée sur le photomultiplicateur (PMT) pour suivre la rotation des billes de latex attachées à des filaments flagellaires 15. Par rapport au suivi avec des caméras ultrarapides, la configuration du photomultiplicateur est avantageuse car il est relativement simple de suivre des billes uniques en temps réel et sur de longues durées. Il est particulièrement utile lors de l’étude du remodelage à long terme dans les complexes moteurs flagellaires en raison de stimuli environnementaux 21. Bien que nous détaillions les protocoles spécifiquement pour E. coli, ils peuvent être facilement adaptés à l’étude des moteurs flagellaires chez d’autres espèces.
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Protocole
1. Préparation des cellules
- Faire croître des cultures de nuit de la souche désirée portant l'allèle collant fliC 15,22 dans du bouillon de tryptone (TB, 1 % de peptone, 0,5 % de NaCl), puis réaliser une inoculation à une dilution de 1:100 dans 10 mL de TB frais. Faire croître la culture à 33 °C dans un incubateur agité jusqu'à une DO600 = 0,5.
- Centrifuger les cellules à 1 500 x g pendant 5 à 7 min et redisperser vigoureusement le culot dans 10 mL de tampon de mobilité stérilisé par filtration (MB ; tampon phosphate 10 mM : 0,05-0,06 M NaCl, 10-4 M EDTA, 1 µM méthionine, pH 7,0).
- Répéter l'étape 1.2 deux fois supplémentaires et redisperser le culot final dans 1 mL de MB.
- Cisailler la suspension en la faisant passer environ 75 fois entre deux seringues munies d'adaptateurs de calibre 21 à 23, reliées par un tube en polyéthylène (7 à 12 cm de long, diamètre intérieur de 0,58 mm). Limiter le temps total de cisaillage à 30 à 45 s.
- Centrifuger les cellules cisaillées à 1 500 x g pendant 5 à 7 min et redisperser le culot dans 100 à 500 µL de MB.
2. Préparation des lames
- Préparer une chambre d'imagerie en sandwichant deux bandes adhésives doubles entre une lame de couverture et une lame de microscope. Pour les tests de chimiotaxie, utiliser toute chambre microfluidique permettant l'échange de MB et de stimulants chimiques.
- Ajouter une solution de poly-L-lysine à 0,01 % dans la chambre, puis rincer délicatement les surfaces avec du MB (80 - 100 µL) après 5 minutes.
- Ajouter 40 µL de la suspension cellulaire dans la chambre et laisser suffisamment de temps pour l'attachement à la surface en verre (7 - 8 min). Éliminer les cellules non attachées en ajoutant 100 µL de MB d'un côté de la chambre, tout en aspirant la solution à l'aide d'un papier filtre depuis l'autre côté.
- Ajouter 10 - 15 µL de billes de latex dans la chambre et laisser aux billes un temps suffisant pour se déposer et s'attacher aux cellules (7 - 8 min). Rincer délicatement avec 100 µL de MB, comme décrit à l'étape 2.3, afin d'éliminer les billes non fixées. Utiliser une gamme de tailles de billes pour les expériences, à condition qu'un bon contraste soit disponible.
3. Suivi des billes
- Placez l'échantillon sur la platine du microscope et examinez la surface à la recherche de billes fixées aux moteurs. Utilisez un objectif de 40X en contraste de phase pour effectuer les observations, bien que la microscopie en contraste de phase ne soit pas indispensable. Sinon, utilisez l'imagerie en champ clair, à condition de conserver un contraste suffisant pour distinguer clairement une bille brillante sur un fond sombre.
- Une fois une bille sélectionnée, déplacez latéralement la platine afin de positionner la bille dans un coin prédéterminé, comme indiqué dans Figure 1B. Positionnez toutes les billes dans le même coin afin de s'assurer que le sens de rotation de la bille est correctement connu. La trajectoire idéale de la bille est approximativement circulaire, mais des trajectoires elliptiques sont acceptables.
- Conservez une fréquence d'échantillonnage supérieure au double de la fréquence de rotation du moteur afin d'éviter les erreurs liées au repliement de spectre (aliasing). Dans cette étude, utilisez un moteur tournant à 50 Hz et échantillonnez à une fréquence 10 fois supérieure (500 Hz), afin d'obtenir un signal lisse.
4. Analyse des données
- Centrer et ajuster les tensions de sortie du PMT et corriger l'ellipticité des trajectoires à l'aide de transformations affines si nécessaire 23. Utiliser une analyse du spectre de puissance pour déterminer les vitesses de rotation 17.
- Déterminer les angles polaires, θ(t) = atan (y(t)/x(t)). Évaluer les variations des vitesses des moteurs et les changements au cours du temps en calculant ω
14. - Appliquer un filtre médian pour lisser les données de vitesse du moteur. Une fenêtre de filtrage couvrant deux rotations complètes est recommandée 23,24.
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Résultats
Le dispositif du photomultiplicateur est illustré dans la figure 1A. Il est important que les photomultiplicateurs (PMT) présentent une grande sensibilité dans la gamme de longueurs d'onde diffusées par les billes d'intérêt. Les PMT utilisés ici fonctionnent dans les domaines visible et proche infrarouge, et ont permis de détecter la lumière diffusée par des billes éclairées par une source lumineuse au tungstène halogène. Les conditions d'éclairage et les tensions d'alime...
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Discussion
Afin de faciliter le suivi du talon attaché et l’estimation correcte des couples moteurs, les informations suivantes doivent être examinées. Lors de la réalisation de ces mesures avec des cellules flagellées, le cisaillement est une étape critique. Le cisaillement réduit le filament flagellaire à un simple talon, garantissant ainsi que la charge visqueuse sur le moteur est principalement due au bourrelet et peut être estimée avec une erreur de 10 % 16. Le cisaillement améliore également les chances de trouver ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient Howard Berg pour le don du microscope de suivi de billes/photomultiplicateurs et la Texas A&M Engineering Experiment Station pour les fonds.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Solution de poly-L-lysine (0,1 %) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Microsphères de polybilles | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Seringue Luer Slip Tip 1 mL | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge Becton | , Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Tube en polyéthylène | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplicateur Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Plage de réponse spectrale de 300 à 920 nm, longueur d’onde de crête 630 nm, ; 0,78 ns temps de réponse ; http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3 fentes de précision de 1 mm | Edmund Optics | NT39-908 | 2 fentes montées perpendiculairement l’une à l’autre sur des tubes photomultiplicateurs |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B D’autres | marques sont acceptables. Oscilloscope numérique, série TBS 1000B, 2 analogiques, 30 MHz, 500 MSPS, 2,5 kpts ; http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| Filtre LP/HP 8 pôles | Krohn-Hite | 3384 | Les marques alternatives sont acceptables. Une gamme de fréquences de 0,1 Hz à 200 kHz est recommandée. ; ; http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Microscope Optiphot | Nikon | NA | N’importe quel microscope à phase verticale ou inversée peut être utilisé. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R :T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
Références
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Réimpressions et autorisations
