Reprogrammation conditionnelle de cellules Pediatric Human oesophagien épithéliales pour utilisation en génie tissulaire et recherche sur les maladies

Summary

Expansion des cellules épithéliales humaines oesophagiennes pédiatriques en utilisant la reprogrammation conditionnelle fournit aux enquêteurs avec une population spécifique au patient des cellules qui peuvent être utilisées pour l'ingénierie des constructions oesophagiennes pour l'implantation autologue pour traiter des défauts ou des blessures et servir de réservoir pour des essais de criblage thérapeutique.

Abstract

L’identification et l’extension de cellules spécifiques au patient en culture pour une utilisation dans l’ingénierie tissulaire et l’investigation des maladies peuvent être très difficiles. L’utilisation de divers types de cellules souches pour dériver les types de cellules d’intérêt est souvent coûteuse, longue et très inefficace. De plus, les types de cellules indésirables doivent être éliminés avant d’utiliser cette source de cellules, ce qui nécessite une autre étape du processus. Afin d’obtenir suffisamment de cellules épithéliales œsophagiennes pour concevoir la lumière d’une construction œsophagienne ou pour cribler des approches thérapeutiques pour traiter les maladies de l’œsophage, les cellules épithéliales œsophagiennes natives doivent être développées sans modifier leur expression génétique ou leur phénotype. La reprogrammation conditionnelle du tissu épithélial œsophagien offre une approche prometteuse pour l’expansion des cellules épithéliales œsophagiennes spécifiques au patient. De plus, ces cellules n’ont pas besoin d’être triées ou purifiées et retourneront à un état épithélial mature après les avoir retirées de la culture de reprogrammation conditionnelle. Cette technique a été décrite dans de nombreuses études de dépistage du cancer et permet une expansion indéfinie de ces cellules sur plusieurs passages. La possibilité d’effectuer des tests de dépistage de l’œsophage contribuerait à révolutionner le traitement des maladies œsophagiennes pédiatriques comme l’œsophagite à éosinophiles en identifiant le mécanisme déclencheur à l’origine des symptômes du patient. Pour les patients qui souffrent d’une malformation congénitale, d’une maladie ou d’une lésion de l’œsophage, cette source cellulaire pourrait être utilisée comme moyen d’ensemencer une construction synthétique pour l’implantation afin de réparer ou de remplacer la région affectée.

Introduction

ingénierie tissulaire oesophagien et éosinophiles oesophagite (EoE) ont fait l'objet de la recherche dans de nombreux laboratoires au cours de la dernière décennie. Malformations congénitales, telles que atrésie de l' œsophage, sont observés chez environ 1 sur 4000 naissances vivantes, ce qui se traduit dans le développement incomplet de l'oesophage menant à l'incapacité de manger ^1. L'incidence et la prévalence de EoE ont été à la hausse depuis l'identification de l'entité de la maladie en 1993. L'incidence de EoE variait de 0,7 à 10 / 100.000 par année-personne et la prévalence variait de 0,2 à 43 / 100.000

Protocol

biopsies oesophagiennes ont été obtenus après le consentement éclairé a été obtenu à partir des parents / tuteurs des patients pédiatriques et en conformité avec comité d'examen institutionnel (IRB # 13-094).

1. Instruments stérilisant et Gélatine Solution

1. forceps autoclaves, lames de rasoir et des ciseaux avant tissus de manutention pour éviter la contamination.
2. Pour 200 ml de solution de gélatine à 0,1%, mélanger 200 ml d'eau distillée avec 0,2 g de gélatine. Autoclave et refroidir avant de l'utiliser.

2. Coating Tissue Culture Plaques

1. Environ 2 h avant l'isolement des cellul....

Results

Un résumé des principales étapes de l' isolement des cellules épithéliales de l' œsophage de biopsies de patients est résumée à la figure 1. Les colonies de cellules épithéliales se formeront dans environ 4-5 jours et seront entourés par des cellules nourricières de fibroblastes (figure 2A). Etant donné que ces colonies élargissent leur fusion avec les autres pour former des colonies plus grandes colonies (figure 2B). Une fois que les cu.......

Discussion

Les étapes les plus importantes dans le but d'isoler et d'étendre les cellules épithéliales de l'œsophage à partir de biopsies de patients sont: 1) dissociant de manière adéquate le tissu biopsie à la mort cellulaire minimale; 2) assurer un inhibiteur de roche est ajouté au milieu de culture cellulaire à chaque changement de milieu; 3) Ne pas utiliser plus de cellules nourricières que recommandé; 4) maintenir une culture aseptique propre; et 5) les cellules de passage juste avant d'atteindre la confluenc.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primocin	InVivogen	ant-pm2
Isopentane	Sigma Aldrich	277258-1L
Gélatine de peau porcine	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
	Cryomold TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific
Tubes coniques de 15 mL	Denville Scientific	C1017-p
Kératinocytes complets Sans sérum Medium	Thermofisher Scientific	10724011
Pénicilline Streptomycine	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
Solution d’insuline	Sigma Aldrich	I9278-5ml
Facteur de croissance épidermique humain (EGF)	Peprotech	AF-100-15
(Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Moyen  ;	Thermofisher Scientific	11765054
Sérum fœtal de bovin	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific	17105041
0.05 % Trypsine-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0.25 % Trypsine-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100 mm Plats	Denville Scientific	T1110-20
Antennes paraboliques 150 mm	Denville Scientific	T1115
50 mL Coniques	Denville Scientific	; C1062-9  ;
Pastilles salines tamponnées au phosphate	Fisher Scientific	BP2944-100
Pipettes	Fisher Scientific	1367811D
Pipettes 10 mL	Fisher Scientific	1367811E
Pipettes	Fisher Scientific	1367811
9" Pipettes Pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 Cellules	ATCC	CRL1658