Reprogrammation conditionnelle de cellules Pediatric Human oesophagien épithéliales pour utilisation en génie tissulaire et recherche sur les maladies

Résumé

Expansion des cellules épithéliales humaines oesophagiennes pédiatriques en utilisant la reprogrammation conditionnelle fournit aux enquêteurs avec une population spécifique au patient des cellules qui peuvent être utilisées pour l'ingénierie des constructions oesophagiennes pour l'implantation autologue pour traiter des défauts ou des blessures et servir de réservoir pour des essais de criblage thérapeutique.

Résumé

L’identification et l’extension de cellules spécifiques au patient en culture pour une utilisation dans l’ingénierie tissulaire et l’investigation des maladies peuvent être très difficiles. L’utilisation de divers types de cellules souches pour dériver les types de cellules d’intérêt est souvent coûteuse, longue et très inefficace. De plus, les types de cellules indésirables doivent être éliminés avant d’utiliser cette source de cellules, ce qui nécessite une autre étape du processus. Afin d’obtenir suffisamment de cellules épithéliales œsophagiennes pour concevoir la lumière d’une construction œsophagienne ou pour cribler des approches thérapeutiques pour traiter les maladies de l’œsophage, les cellules épithéliales œsophagiennes natives doivent être développées sans modifier leur expression génétique ou leur phénotype. La reprogrammation conditionnelle du tissu épithélial œsophagien offre une approche prometteuse pour l’expansion des cellules épithéliales œsophagiennes spécifiques au patient. De plus, ces cellules n’ont pas besoin d’être triées ou purifiées et retourneront à un état épithélial mature après les avoir retirées de la culture de reprogrammation conditionnelle. Cette technique a été décrite dans de nombreuses études de dépistage du cancer et permet une expansion indéfinie de ces cellules sur plusieurs passages. La possibilité d’effectuer des tests de dépistage de l’œsophage contribuerait à révolutionner le traitement des maladies œsophagiennes pédiatriques comme l’œsophagite à éosinophiles en identifiant le mécanisme déclencheur à l’origine des symptômes du patient. Pour les patients qui souffrent d’une malformation congénitale, d’une maladie ou d’une lésion de l’œsophage, cette source cellulaire pourrait être utilisée comme moyen d’ensemencer une construction synthétique pour l’implantation afin de réparer ou de remplacer la région affectée.

Introduction

ingénierie tissulaire oesophagien et éosinophiles oesophagite (EoE) ont fait l'objet de la recherche dans de nombreux laboratoires au cours de la dernière décennie. Malformations congénitales, telles que atrésie de l' œsophage, sont observés chez environ 1 sur 4000 naissances vivantes, ce qui se traduit dans le développement incomplet de l'oesophage menant à l'incapacité de manger ^1. L'incidence et la prévalence de EoE ont été à la hausse depuis l'identification de l'entité de la maladie en 1993. L'incidence de EoE variait de 0,7 à 10 / 100.000 par année-personne et la prévalence variait de 0,2 à 43 / 100.000 ^2. Une nouvelle approche chirurgicale attrayant pour le traitement à long gap atrésie de l'œsophage consiste à générer des constructions de tissu pour l'implantation en utilisant les propres cellules du patient. Ces cellules en association avec des échafaudages synthétiques vont générer une construction autologues qui ne nécessite pas la suppression immunitaire. Certains groupes ont déjà commencé à enquêter sur les États-Unise des cellules souches ressemblant à oesophagien ingénierie tissulaire ^3, ainsi que l'utilisation de cellules épithéliales de l' œsophage natifs pour repeupler la muqueuse ^4-7. Les maladies qui sont présents dans l'oesophage des patients pédiatriques sont souvent difficiles à diagnostiquer ou étudier sans intervention. En outre, les modèles animaux utilisant ou in vitro immortalisés modèles de lignées cellulaires pour les maladies pédiatriques comme EoE n'englobent la pathogenèse de la maladie exacte ou des différences spécifiques aux patients ^8. Par conséquent, la possibilité d'étudier le processus de la maladie d'un patient in vitro afin d'identifier des antigènes de la maladie de déclenchement spécifiques, évaluer les mécanismes sous - jacents et d' enquêter sur les traitements médicamenteux serait nouveau et fournir aux cliniciens des informations qui peuvent aider dans le traitement des patients.

Il y a eu de nombreux types de cellules autologues ou spécifiques à un patient qui ont été proposés pour une utilisation en tissuingénierie e et étudier la pathogenèse de la maladie humaine. Toutefois, certains de ces types de cellules sont limitées dans leur capacité à générer suffisamment de cellules d'un phénotype spécifique pour ensemencer un grand échafaudage ou d' effectuer un débit élevé des études in vitro. L'utilisation de cellules souches pluripotentes ou multipotentes a été le sujet de discussion de recherche beaucoup, cependant, les limites et les lacunes pour l' utilisation de ces cellules ont été bien décrits ^9. L'utilisation de cellules souches embryonnaires humaines est fortement débattue et présente de nombreuses questions éthiques. Plus important encore , ces cellules forment des tératomes, qui sont semblables à une tumeur, si elles ne sont pas différenciés de leur état pluripotentes avant de les livrer dans un hôte vivant ^10. En outre, l'utilisation de cellules souches embryonnaires ne serait pas le patient spécifique et peut déclencher une réponse allogénique et la nécessité d' une suppression immunitaire ^10. Les cellules souches pluripotentes induites (CISP) sont des cellules pluripotentes qui peuventdériver à partir des cellules d'un patient. des cellules somatiques telles que les cellules de la peau, peuvent être amenés à un état pluripotent en utilisant une variété de techniques d'intégration et de non-intégratifs. Ces cellules servent alors comme une source de cellules spécifiques au patient pour l'ingénierie tissulaire ou d'une enquête de la maladie. L'intégration du matériel génétique indésirable dans ces cellules est une préoccupation beaucoup ont décrit et même si les séquences sont complètement CSPi enlevés semblent conserver une "mémoire" épigénétique vers le type de cellule à partir de laquelle ils sont dérivés ^11. Ces cellules vont également former des tératomes in vivo si non différenciée avant la transplantation ^11. De nombreux protocoles de différenciation ont été étudiés en se concentrant sur les lignées épithéliales ^{12, 13, 14,} cependant, il est très important de noter que les types cellulaires résultantes à la fin de la différenciation ne sont pas homogènes et oeul possèdent une fraction du type cellulaire d'intérêt. Cela se traduit par un faible rendement et la nécessité de purifier le type cellulaire souhaité. Bien que CSPi sont une source potentielle de cellules spécifiques au patient, le processus pour obtenir un type d'intérêt soit pour l'ingénierie tissulaire ou d'une enquête de la maladie cellulaire est très inefficace.

Des cellules épithéliales humaines ont été isolées avec succès à partir d' une variété de deux tissus malades et non malades dans le corps humain , y compris: ¹⁵ poumon, du sein ^16, l' intestin grêle ^{17, 18} côlon, de la vessie et de l' œsophage ^{19 20.} Il est important de noter que les cellules humaines primaires ont un nombre fini de passages dans lesquels le phénotype est maintenu ^{21, 22.} Malheureusement, cela signifie que le nombre de cellules nécessaires pour la recherche de la maladie ou pour l'ensemencement d'un échafaudage d'ingénieriepour l'implantation ne peut pas être atteint. Par conséquent, de nouvelles techniques sont nécessaires pour étendre les cellules du patient, tout en conservant un phénotype épithélial. Reprogrammation conditionnelle des cellules épithéliales normales et cancéreuses en utilisant des cellules nourricières et inhibiteur de ROCK a été décrite en 2012 par Liu et al. ^{2 3.} Cette technique a été utilisée pour développer des cellules épithéliales cancéreuses obtenues à partir de biopsies de la prostate et le cancer du sein en utilisant des cellules nourricières irradiées, inhibiteurs de ROCK et moyennes de reprogrammation conditionnelle. L'objectif était de générer suffisamment de cellules pour des tests in vitro tels que le dépistage des drogues. Cette technique est capable de se dilater par les cellules épithéliales indéfiniment "reprogrammation" de ces cellules à une tige ou à l'état géniteur analogue, ce qui est très proliférative. Il a été démontré que ces cellules sont non tumorigènes et ne possèdent pas la capacité de former des tératomes ^{23, 24.} En outre, aucundes anomalies chromosomiques ou les manipulations génétiques étaient présents après repiquage ces cellules en culture en utilisant cette technique ^{23, 24.} Plus important encore, ces cellules ne sont capables de se différencier dans le type cellulaire natif d'intérêt. Par conséquent, cette technique offre un grand réservoir de cellules épithéliales spécifiques au patient pour enquête sur la maladie ou l'ingénierie tissulaire, sans la nécessité d'immortalisation.

L'obtention d'un tissu épithélial d'un organe spécifique afin d'étudier les processus de la maladie est souvent limitée et pas toujours possible en raison du risque patient. Pour les patients souffrant d'une maladie de l'oesophage ou de défauts, la récupération de biopsie endoscopique est une approche mini-invasive pour l'obtention d'un tissu épithélial qui peut être dissocié et conditionnellement reprogrammé pour fournir une source de cellules indéfinie qui est spécifique à la muqueuse de l'oesophage du patient. Ceci permet alors d'études in vitrodes cellules épithéliales pour évaluer les processus de la maladie et l'écran pour thérapeutiques potentiels. Un processus de la maladie qui pourrait grandement bénéficier de cette approche est éosinophile oesophagite, qui a été décrit comme une maladie allergique de l'œsophage ^8. Des tests d'allergie ainsi que des approches thérapeutiques pourraient être évalués in vitro en utilisant les propres cellules épithéliales du patient et ces données peuvent ensuite être transférés sur le médecin traitant pour élaborer des plans de traitement individualisés. La technique de reprogrammation conditionnelle en combinaison avec l'obtention de biopsies endoscopiques chez des patients pédiatriques offre la possibilité d'étendre les cellules épithéliales normales de l'œsophage chez un malade indéfiniment. Cette source de la cellule pourrait donc être associé avec des échafaudages naturels ou synthétiques pour fournir une option chirurgicale spécifique au patient pour des défauts, d'une maladie ou d'un traumatisme. Avoir un nombre de cellules indéfinie permettrait ingénieur des constructions oesophagiennes qui possèdent un tout réensemencéeslumen avec les cellules épithéliales de l'œsophage, afin de contribuer à faciliter la régénération des types de cellules restantes.

Protocole

biopsies oesophagiennes ont été obtenus après le consentement éclairé a été obtenu à partir des parents / tuteurs des patients pédiatriques et en conformité avec comité d'examen institutionnel (IRB # 13-094).

1. Instruments stérilisant et Gélatine Solution

1. forceps autoclaves, lames de rasoir et des ciseaux avant tissus de manutention pour éviter la contamination.
2. Pour 200 ml de solution de gélatine à 0,1%, mélanger 200 ml d'eau distillée avec 0,2 g de gélatine. Autoclave et refroidir avant de l'utiliser.

2. Coating Tissue Culture Plaques

1. Environ 2 h avant l'isolement des cellules, ajouter suffisamment de 0,1% de gélatine pour couvrir une boîte de culture tissulaire (100 mm) et on incube à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire.
   REMARQUE: Ces plaques peuvent également être faits à l'avance et conservées dans l'incubateur avant de les utiliser.

3. Faire Enzyme Solution pour Dissociation

1. Environ 30 minutes avant l'isolement des cellules, pesez10 unités de dispase sur une balance sur la base des unités par milligramme de concentration sur le flacon. Placer la poudre dans un tube de 15 ml conique avec 10 ml de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et placer dans un bain d'eau à 37 ° C.

4. Making milieu de culture cellulaire

1. Pour 50 ml de milieu de reprogrammation conditionnelle, mélanger les ingrédients suivants dans un tube stérile conique: 35 ml de F12 (Ham moyenne), 11,5 ml de DMEM, 0,5 ml de L-glutamine, 0,5 mL de 100x pénicilline / streptomycine, 2,5 ml de sérum de fœtus bovin (FBS), 250 ug d'insuline humaine, 500 ng de facteur de croissance épidermique humain (EGF).
2. Pour 500 ml de 3T3 moyen, mélanger 50 ml de FBS, 5 ml de 100x pénicilline / streptomycine et 5 ml de L-glutamine avec 500 ml de DMEM.
3. Pour 500 ml de milieu sans sérum kératinocytes, dégeler EGF et de l'extrait d'hypophyse bovine (BPE) suppléments (fournis avec les médias). Ajouter les suppléments au ml bouteille de milieu de base 500 et ajouter 5 ml de 100x pénicilline / streptomycine

5. la mise en culture et en irradiant cellules 3T3 comme un chargeur Source

1. Préparer le milieu 3T3, comprenant en DMEM 10% de FBS, 1 x pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine.
2. Culture des cellules 3T3 dans les tissus traités flacons T-75 au moins 3 jours avant l'arrivée des échantillons de patients.
   1. Juste avant l'arrivée des échantillons de patients, en utilisant des cellules 3T3 trypsiniser 5 ml de 0,25% de trypsine-EDTA par flacon et incuber à 37 ° C pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que la plupart des cellules sont flottantes
3. Ajouter 5 ml de 3T3 moyen pour arrêter la réaction. Aspirer la suspension cellulaire et le transférer vers un tube de 15 ml conique. Spin pendant 5 min à 300 x g.
4. Aspirer le milieu et remettre en suspension les cellules dans un volume défini de bleu trypan pour le comptage des cellules. Combiner 10 pi de cellules avec 10 pi de bleu trypan pour exclure les cellules mortes. Charge 10 pi de cette solution sur un hémocytomètre pour le comptage des cellules.
   NOTE: Pour cette protocol, la densité d'ensemencement des cellules 3T3 irradiés est de 10.900 cellules par ^cm2, ce qui est égal à 600.000 cellules par plaque de 100 mm.
5. Aliquoter le nombre de cellules nécessaires à la plaque d'une plaque de 100 mm par échantillon du patient et remettre en suspension dans 25 ml de milieu 3T3 dans un tube de 50 ml conique et irradier avec 3000 rads.
6. irradiation Après, les cellules de spin bas pendant 5 min à 300 xg et resuspendre dans un milieu de reprogrammation conditionnelle à 5 ml par plaque de 100 mm.
7. Réglez le tube de côté jusqu'à le placage des cellules du patient a lieu plus tard dans le protocole (voir étape 7.6).

6. Obtention, conservation et de transport pédiatrique oesophagiennes Biopsies

1. Ajouter 5 ml de milieu sans sérum kératinocytes avec 100 pg / mL primocin 15 tubes coniques mL et l'amener à l'établissement médical sur la glace.
   REMARQUE: Ces tubes de support peuvent être stockés à 4 ° C pendant jusqu'à 2 mois.
2. Obtenir environ 8 biopsies œsophagiennes au timoi de l'endoscopie et séparée comme suit:
   1. Placez six biopsies dans le cône 15 ml contenant du milieu sans sérum de kératinocytes avec 100 pg / mL primocin et le placer sur la glace mouillée.
   2. Placer une biopsie dans 5 ml de formol tamponné et le placer sur la glace mouillée.
   3. Placez une biopsie dans une petite biopsie cryomoule avec optimal composé de température de coupe.
      1. Abandonner immédiatement ce moule dans un bécher d'isopentane placé dans de l'azote liquide. Une fois congelé, placez le cryomoule dans un sac de spécimen et stocker sur la glace sèche dans un récipient en mousse de polystyrène.
3. Placer les tubes contenant des biopsies dans le milieu ou le formol dans un sac refermable, puis dans une boîte d'expédition contenant de la glace humide. Sceller et étiqueter la boîte avec une étiquette de biohazard et le transporter au laboratoire.
   NOTE: Le conteneur qui contient la glace sèche et la biopsie congelée est également scellé et étiqueté avec une étiquette de biohazard.

7. traitementTissu du Patient pour la culture et l'analyse en aval

1. À l'arrivée au laboratoire, transférer la biopsie congelés sur glace sèche à -80 ° C congélateur pour la coupe en aval ou l'extraction d'ARN. Placer l'échantillon dans le formol. Conserver dans un 4 ° C réfrigérateur et permettre de fixer une nuit.
2. Faites tourner les biopsies restantes vers le bas à 300 xg, et aspirer le milieu. Ajouter 10 ml de dispase solution au tube conique, sceller et laisser incuber à 37 ° C dans un bain-marie pendant 15 min.
3. Après l'incubation, tourner les biopsies vers le bas à 300 x g. Aspirer les moyennes et resuspendre biopsies dans 5 ml de 0,05% de trypsine-EDTA.
4. Transférer le 5 ml de trypsine-EDTA contenant les biopsies à une plaque stérile de 100 mm et émincer les biopsies à l'aide de 2 lames de rasoir stérilisées aussi fine que possible.
5. Transférer le 5 ml de trypsine-EDTA contenant des biopsies émincées à un nouveau ml conique 15. Rincer la plaque deux fois avec un 5 ml de plus de 0,05% de trypsine-EDTA et ajouter à la partie coniquetube. Incuber le tube pendant 10 minutes dans un bain-marie à 37 °.
6. Après l'incubation, tourner les biopsies vers le bas à 300 xg (1,4 RPM) pendant 5 min et aspirer le milieu. Ajouter 5 ml de milieu de reprogrammation conditionnelle au tube conique, ainsi que le 5 mL de milieu de reprogrammation conditionnelle contenant les cellules nourricières irradiées (voir étape 5.7).
7. Ajouter un inhibiteur de roche (1 pl / ml) à 10 ml de suspension cellulaire et de la plaque après l'aspiration de la gélatine de la capsule de culture tissulaire. Incuber à 37 ° C.

8. La culture et les cellules expansibles

1. Après environ 5 jours de culture, aspirez le milieu initial contenant les morceaux hachés-biopsie et rincer le plat 2-3 fois avec 5 ml de PBS stérile. Ajouter un nouveau moyen à la plaque y compris inhibiteur de ROCK à 10 uM.
2. Après avoir atteint 70% de confluence, développez les cellules. Ajouter 5 ml de 0,05% de trypsine-EDTA à la plaque et incuber dans un incubateur à 37 ° pas plus de 2,5 min pour éliminer les edes cellules nourricières e. À la suite de cette incubation, aspirer le trypsine-EDTA et rincer la plaque avec 5 ml de PBS.
3. Aspirer le PBS et ajouter 5 ml de 0,25% de trypsine-EDTA à la plaque et incuber pendant 5-10 minutes ou jusqu'à ce que les cellules sont lâches de la plaque. Ajouter des quantités égales de moyenne à la plaque pour arrêter la réaction et de transférer la totalité du fluide à un tube de 50 ml conique et centrifuger à 300 xg pendant 5 min.
4. Resuspendre les cellules dans un volume déterminé de milieu de reprogrammation conditionnel et mélanger 10 ul de la suspension avec 10 pi de bleu trypan. Comptez sur un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules.
5. Pour développer des cellules, ajouter 1 million de cellules humaines de l'œsophage à une plaque de 150 mm avec 1,2 million irradier des cellules 3T3 dans un volume total de 15 ml. Ajouter inhibiteur de ROCK fraîche à 10 uM et ajouter la suspension cellulaire à un 150 mm plat revêtu de gélatine.

9. Cellules congeler et conserver Human oesophagien épithéliales

1. Pour un milieu de congélation, ajouter 10%DMSO à un milieu de reprogrammation conditionnelle. Après trypsinisation et comptage, aliquoter les cellules de geler dans un nouveau tube de 50 ml conique et centrifuger à 300 xg pendant 5 min.
2. Aspirer le moyen et ajouter le milieu de congélation à un volume de 2 ml par cryovial. Une fois que la suspension cellulaire est homogène, aliquote de 10 ⁶ cellules cyrovials pré-étiquetés. Placer dans un récipient de congélation à -80 ° C pendant au moins 24 heures avant le déplacement des flacons de stockage d'azote liquide à long terme.

Résultats

Un résumé des principales étapes de l' isolement des cellules épithéliales de l' œsophage de biopsies de patients est résumée à la figure 1. Les colonies de cellules épithéliales se formeront dans environ 4-5 jours et seront entourés par des cellules nourricières de fibroblastes (figure 2A). Etant donné que ces colonies élargissent leur fusion avec les autres pour former des colonies plus grandes colonies (figure 2B). Une fois que les cu...

Discussion

Les étapes les plus importantes dans le but d'isoler et d'étendre les cellules épithéliales de l'œsophage à partir de biopsies de patients sont: 1) dissociant de manière adéquate le tissu biopsie à la mort cellulaire minimale; 2) assurer un inhibiteur de roche est ajouté au milieu de culture cellulaire à chaque changement de milieu; 3) Ne pas utiliser plus de cellules nourricières que recommandé; 4) maintenir une culture aseptique propre; et 5) les cellules de passage juste avant d'atteindre la confluenc...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Primocin	InVivogen	ant-pm2
Isopentane	Sigma Aldrich	277258-1L
Gélatine de peau porcine	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
	Cryomold TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific
Tubes coniques de 15 mL	Denville Scientific	C1017-p
Kératinocytes complets Sans sérum Medium	Thermofisher Scientific	10724011
Pénicilline Streptomycine	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
Solution d’insuline	Sigma Aldrich	I9278-5ml
Facteur de croissance épidermique humain (EGF)	Peprotech	AF-100-15
(Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Moyen  ;	Thermofisher Scientific	11765054
Sérum fœtal de bovin	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific	17105041
0.05 % Trypsine-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0.25 % Trypsine-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100 mm Plats	Denville Scientific	T1110-20
Antennes paraboliques 150 mm	Denville Scientific	T1115
50 mL Coniques	Denville Scientific	; C1062-9  ;
Pastilles salines tamponnées au phosphate	Fisher Scientific	BP2944-100
Pipettes	Fisher Scientific	1367811D
Pipettes 10 mL	Fisher Scientific	1367811E
Pipettes	Fisher Scientific	1367811
9" Pipettes Pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 Cellules	ATCC	CRL1658