Genome Montage et différenciation dirigée des hPSCs pour Interrogation Déterminants Lineage dans le développement du pancréas humain

Résumé

Protocoles pour générer des lignes de mutants HPSC en utilisant la plate-forme iCRISPR et de différencier hPSCs dans les cellules ß-like glucose-sensibles sont décrits. La combinaison de la technologie d'édition génome avec une différenciation HPSC dirigée fournit une plate-forme puissante pour l'analyse systématique du rôle des déterminants de la lignée dans le développement humain et de la progression de la maladie.

Résumé

Interrogation fonction des gènes dans l'auto-renouvellement ou la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) offre une plate-forme précieuse à la compréhension du développement humain et à disséquer les mécanismes de la maladie dans un plat. Pour tirer profit de cette application potentielle nécessite des outils efficaces génome d'édition pour générer des mutants HPSC dans les gènes associés à la maladie, ainsi que in vitro protocoles de différenciation HPSC pour produire dans les types de cellules pathologiques pertinentes qui récapitulent étroitement leurs homologues in vivo. Une plate - forme génome-montage efficace pour hPSCs nommé iCRISPR a été développé par le ciblage TALEN à médiation d'une cassette d'expression cas9 dans le locus AAVS1. Ici, les protocoles pour la génération de lignées cas9 HPSC inductibles en utilisant des cellules cultivées dans un milieu chimiquement défini et un état libre dispositif d'alimentation sont décrites. Les procédures détaillées pour l'utilisation du système iCRISPR pour knockout de gène ou des altérations génétiques précises dans hPSCs, soit par nsur homologue extrémité de jonction (NHEJ) ou par des modifications de nucleotides précises à l'aide d'un modèle d'homologie de réparation dirigée (HDR), respectivement, sont inclus. Ces procédures techniques comprennent des descriptions de la conception, la production et la transfection d'ARN de guidage CRISPR (ARNg); la mesure du taux de mutation CRISPR ou par T7E1 RFLP essais; et la mise en place et la validation des lignées mutantes clonales. Enfin, nous procédures de chronique de différenciation HPSC dans les cellules ß-pancréatiques comme glucose sensible en imitant dans le développement embryonnaire du pancréas vivo. La combinaison de la technologie iCRISPR avec une différenciation HPSC dirigée permet l'examen systématique de la fonction des gènes pour approfondir notre compréhension des mécanismes de développement et de la maladie du diabète pancréatique.

Introduction

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) ont la capacité à la fois l'auto-renouvellement et donner lieu à tous les dérivés des trois lignées germinales embryonnaires. Ils fournissent une ressource précieuse pour la thérapie de remplacement cellulaire et la modélisation de la maladie en servant de plate-forme unique pour récapituler les processus cellulaires dans un contexte de développement humain. Ils sont également une source de cellules expérimentales pour des analyses évolutives, à haut débit. Cependant, les progrès ont été limités en raison de deux principaux défis: le manque d'outils de modification génétique efficaces et la difficulté à récapitulant les étapes du développement embryonnaire complexes dans une boîte de culture.

La modification génétique est un outil indispensable pour étudier la fonction des gènes dans le développement normal et la maladie. Cependant, alors que le gène classique des approches de ciblage par recombinaison homologue se sont révélés être un outil puissant pour disséquer la fonction des gènes chez la souris cellules souches embryonnaires (mESCs) ^1, cette approchea été extrêmement inefficace lorsqu'il est appliqué à hPSCs ^{2, 3.} La récente adhésion rapide des programmables, des nucléases spécifiques au site de la nature à l'utilisation en laboratoire, y compris les nucléases à doigts de zinc (de ZFN), transcription nucléases effectrices activatrices-like (Talens), et les répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées en cluster (CRISPR) associée CRISPR-/ (Cas) les systèmes ^4, signifie que l' ingénierie des génomes est devenu une tâche beaucoup plus facile dans un large éventail d'organismes et de lignées cellulaires, y compris dans hPSCs. Ces outils d'édition de gènes profitent du fait que les nucléases chimères telles que l'endonucléase cas9 peuvent permettre toute une série de modifications génétiques en induisant des cassures double brin (CDB) à des endroits précis, ce qui déclenche le mécanisme de réparation d'ADN endogène pour activer soit non homologue fin de jonction (NHEJ) ou la réparation d'homologie dirigée (HDR). Les deux mécanismes peuvent être exploités pour la manipulation génétique en induisant either insertion aléatoire et des mutations de deletion (les indels, par l' intermédiaire NHEJ), pour créer des mutations de changement qui invalident allèles du gène, ou des substitutions de nucleotides précises (par RDH), pour récapituler les mutations du patient pour la modélisation des maladies humaines ou à corriger une mutation responsable de la maladie pour la thérapie génique .

CRISPR / Cas à médiation par l'ingénierie du génome nécessite deux composants: le cas9 endonucléases d'ARN guidée constante nécessaire pour le clivage de l'ADN et un ARN CRISPR variable (crRNA) et (tracrRNA) duplex trans-activation qui indique la reconnaissance de la cible d'ADN. Le duplex crRNA / tracrRNA peut être remplacé par un seul ARN guide chimérique (gARN), qui ont été trouvés pour travailler plus efficacement ^{5, 6, 7.} Bien que le système / cas9 CRISPR a été adapté pour les organismes les plus expérimentaux et des lignées cellulaires, la livraison et l'expression de cas9 et gARN varie de façon significative et doit encore être optimisé pour Achíveille édition du génome efficace dans de nombreux systèmes, y compris hPSCs ^8. Une plate - forme de génome-édition efficace, iCRISPR, a été créé en hPSCs ^5. Dans ce système, une approche TALEN à médiation a été utilisé pour cibler les deux alleles du «transgène locus refuge" AAVS1 en trans, un allèle avec un transactivateur inverse à la tetracycline contrôlée (M2rtTA) et l'autre avec un élément de réponse à la tetracycline (TRE ) entraînant l'expression de cas9 (iCas9) dans les hPSCs. Dans des lignées clonales établies (iCas9 hPSCs), cas9 est fortement exprimé avec le traitement de doxycycline. Pendant ce temps, en raison de sa petite taille (100 nt), ARNg simples ou multiples peuvent être facilement livrés en iCas9 hPSCs avec une grande efficacité et peuvent diriger cas9 pour le clivage spécifique du site, ce qui permet la perturbation du gène NHEJ médiation efficace, ainsi que HDR-médiée modifications de nucléotides précises en présence de courts-ADN simple brin (ADNsb) modèles de donateurs. Le système peut être iCRISPRutilisé pour générer avec succès un panel de lignées HPSC maladie mimant avec biallélique (de homozygotes ou hétérozygotes composites) ou des mutations hétérozygotes perte de fonction dans les gènes de développement importants ^{5, 9.} Bien qu'un certain nombre de groupes ont rapporté l'édition efficace de gènes en utilisant CRISPR / Cas dans hPSCs, le succès reste limité à un petit nombre de laboratoires technologiquement adepte. La plate - forme iCRISPR offre une solution efficace et simple pour l' édition de gènes de routine par des chercheurs de différents niveaux de compétence, et il a déjà été utilisé dans un certain nombre d'études publiées par notre groupe et d' autres ^{9, 10, 11, 12.} Cette approche a également été étendue à silençage inductible basé sur l'expression de ¹³ dCas9-KRAB.

Avec les progrès dans le génome d'édition technologie, des améliorations significatives ont également été obtenus dans HPSC l'entretien et la différenciation dirigée. Les conditions de culture pour hPSCs ont évolué à partir des conditions de milieu fibroblaste embryonnaire de souris irradiées (Imef) dépendant du dispositif d' alimentation à des conditions exemptes d'alimentation, sur des composants de la matrice extracellulaire définis et à partir des formulations de milieux complexes ¹⁴ de constitution chimique définie. Ces améliorations ont permis de réduire la variabilité des hPSCs dues à des différences de lot à lot de préparation et de sérum KO Imef pièces de rechange, et de fournir ainsi un environnement plus reproductible pour la différenciation HPSC. Pendant ce temps, une meilleure connaissance des voies régissant le développement embryonnaire humain, ainsi que des découvertes de haut débit des projections de drogue de signalisation, ont conduit à des protocoles de différenciation améliorés ^{15, 16, 17, 18.} Ces protocoles imitent plus étroitement dans vivo les étapes de développement et de générer des types de cellules qui récapitulent étroitement leurs homologues in vivo. Pour la différenciation HPSC dans la lignée du pancréas, des protocoles initiaux imitaient développement pancréatique précoce relativement bien, mais finalement généré les cellules ß polyhormonal qui étaient des phénotypes fœtales immatures et mal répondu à la stimulation du glucose. Les récents progrès ^{16, 17, 19, 20} ont permis la génération de cellules ß-pancréatiques comme glucose-sensible, ce qui nous permettra d'enquêter sur les événements ultérieurs, tels que la formation et la poursuite de la maturation des cellules ß monohormonal.

Ici, nous détaillons l'application des lignes du génome modifié pour l'étude du développement du pancréas en combinant le système iCRISPR avec in vitro plate - forme de différenciation basée-HPSC vers glucose-sensible pancrles cellules ß-like eatic. Ce couplage de puissants outils d'édition du génome , avec un meilleur protocole de différenciation HPSC offre non seulement la vitesse et de l' ampleur nécessaire pour répondre à la demande croissante de la validation de la causalité de la maladie, mais permet également de manipulations génétiques sophistiquées pour d' autres investigations mécanistiques dans le contrôle transcriptionnel qui sous - tendent le développement normal et la maladie ⁹ .

Protocole

Ce protocole est basé sur notre travail avec des lignes HPSC H1, HUES8 et MEL-1 dans l'état chimiquement défini et sans alimentation (S'il vous plaît voir le matériel et le tableau Équipement). Pour les autres lignes HPSC ou hPSCs maintenues dans différentes conditions de culture, une optimisation plus poussée est recommandée.

1. HPSC Culture dans la Condition Chimiquement Défini et sans chargeur-

1. Adapter la culture HPSC sur les départs Imef à l'état libre-alimentation. Dans les cas où les cellules congelées ne survivent pas bien lorsqu'il est directement récupéré à l'état libre-alimentation, récupérer les cellules dans un état Imef d'abord et ensuite adapter à l'état libre-alimentation.
   NOTE: En général, il faut 2 passages pour hPSCs cultivées sur les départs Imef être adaptée à l'état libre-alimentation.
2. Changer le milieu tous les jours et le passage des hPSCs lorsque les cellules ont atteint ~ 80% de confluence. En général, hPSCs de passage à ~ 1: 6 - 1:15 rapports tous les 4 - 6 jours. Ajouter 10 uM inhibiteur de ROCK Y-27632 when décongélation ou repiquage des cellules.
3. Avant de semer les hPSCs, des boîtes de culture pré-manteau avec 5 ug / ml (1 ml / 10 cm ²⁾ tronquée de forme humaine recombinante de vitronectine (VTN) pendant au moins 1 h à température ambiante (RT). En outre, la préparation complète milieu défini chimiquement en ajoutant supplément dans le milieu de base.
4. Retirez le milieu de culture, laver les cellules une fois avec du PBS sans Ca ²⁺ et Mg ^2+, et traiter les cellules avec 0,5 mM d' EDTA pour ~ 2-5 min à température ambiante.
5. Aspirer l'EDTA avant que les colonies ont détaché. Avec pipetage doux, disperser les colonies HPSC en petits morceaux et remettre les cellules dans un milieu complet.
6. Recueillir les hPSCs dissociées et centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min. Resuspendre les hPSCs sédimentées dans le milieu complet et épépiner les cellules sur des plaques VTN revêtues.

2. Génération de lignes iCas9 HPSC

1. Ordre et amplifier les plasmides suivants: AAVS1-TALEN-L, AAVS1-TALEN-R, AAVS1-Neo-M2rtTA et AAVS1-Puro-iCas9.
   NOTE: Pour éviter des événements de recombinaison inattendus, utilisez Stbl3 cellules compétentes de recombinaison déficiente pour la transformation et l'amplification des plasmides à 30 ° C.
2. En règle générale, préparer les hPSCs dans l' un de 10 cm plat (~ 1 x 10 ⁷ cellules si ~ confluentes à 80%) pour une expérience de ciblage.
   Remarque: Comme électroporation provoque généralement la mort cellulaire significative et TALEN gène à médiation par le ciblage dans le locus AAVS1 nécessite une sélection antibiotique, un nombre relativement élevé de cellules doivent être ensemencés pour identifier des cellules correctement ciblées. L'optimisation des concentrations de médicament est recommandé pour chaque lignée cellulaire et chaque condition de culture.
3. Le jour -1, (la veille électroporation), ajouter un inhibiteur de ROCK 10 uM pendant le changement de support.
4. Au jour 0 (le jour de l' électroporation), VTN préparer des plaques revêtues à l' avance.
5. Dissocier les hPSCs en cellules individuelles using 1x réactif de dissociation (s'il vous plaît voir le matériel et le tableau Équipement). En bref, retirer le milieu de culture, laver les cellules une fois avec du PBS sans Ca ²⁺ et Mg ^2+, et de traiter les cellules avec 1x réactif de dissociation à 37 ° C pendant environ 3 min. Aspirer le réactif de dissociation avant que les cellules ont détaché. Avec pipetage doux, disperser les hPSCs dans une suspension à cellule unique dans 10,5 mL de milieu complet.
6. Prenez 0,5 ml de suspension cellulaire pour compter le nombre de cellules en utilisant un compteur de cellules automatisé. Sédimenter les hPSCs à 200 xg pendant 5 min et remettre en suspension les cellules dans le froid (4 ° C) PBS à 12,5 x 10 ⁶ cellules / ml.
7. Ajouter les plasmides (voir le tableau 1) dans 800 pi HPSC suspension (12,5 x 10 ⁶ cellules / mL) et bien mélanger. Transférer le mélange dans une cuvette d'électroporation de 0,4 cm et de garder sur la glace pendant environ 5 min.
8. L'électroporation des cellules en utilisant un système d'électroporation à 250 V et 500 uF; les obs constante de tempsaprès l'électroporation est dé- laissées généralement 9 - 13 ms.
9. Après l'électroporation, le transfert des cellules dans un tube conique de 15 ml avec 5 ml de milieu complet préchauffé. Critical pour le ciblage réussi: Utilisez hPSCs proliférantes sain et gérer les cellules très doucement lors du transfert, la remise en suspension, et le plaquage des cellules après l' électroporation.
10. Sédimenter les cellules à 200 xg pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules dans 10 ml de milieu complet avec 10 uM inhibiteur de ROCK et de la plaque 1, 2,5 et 5 x 10 ⁶ cellules sur chacun des trois plats VTN-revêtu, de 10 cm; Cela garantit que au moins l'une des plaques auront colonies suffisantes à une seule cellule densité clonale pour la colonie cueillette.
11. Le jour 1 (le jour après l' électroporation), changer le milieu.
12. Les jours 2-5, commencer sélection néomycine lorsque les cellules sont ~ 60% de confluence. Changer le support quotidien avec 500 ug de sulfate / mL G418; la mort cellulaire significative due à Selection est généralement observé 2 jours après la sélection de G418.
13. Le jour 6, changer le milieu sans sélection antibiotique.
14. Les jours 7-9, commencer la sélection de puromycine. Changer le support quotidien avec 1 pg / ml de puromycine dichlorhydrate; la mort cellulaire significative doit être observée le jour suivant.
15. Le jour 10, commencer à changer le moyen quotidien sans sélection antibiotique jusqu'à ce que les colonies unicellulaires HPSC atteignent 1 - 2 mm de diamètre.
    NOTE: En règle générale, 50 colonies dans un plat de 10 cm sont observés avec 2,5 x 10 ⁶ hPSCs plaqué le jour 0.
16. Choisissez 12 - 24 colonies sous un stéréomicroscope. désagréger Mécaniquement les colonies HPSC en petits morceaux (~ 10 pièces par colonie) en utilisant une aiguille de 23 G (une pointe de pipette de 200 pi est aussi fine) et de transférer les cellules directement dans des plaques à 24 puits VTN revêtus.
17. Changer le support quotidien jusqu'à ce que les cellules deviennent confluentes. Passage des cellules dans chaque puits des plaques à 24 puits endupliquer des puits de plaques à 6 puits.
18. Lorsque les cellules deviennent confluentes dans les plaques de 6 puits, utiliser un puits pour un stock congelé et l'autre bien pour l'extraction de l'ADN génomique pour une caractérisation plus poussée.
19. Caractériser et valider les lignes iCas9 établies par le génotypage par PCR, Southern blot, l'analyse par RT-qPCR, caryotype, et le dosage de la pluripotence. Reportez - vous à Zhu et al. ²¹ pour les procédures expérimentales détaillées.

3. Génération de HPSC Mutant Lines Utilisation du système iCRISPR

1. Génération de lignées knock - out HPSC
   1. la conception et la production gARN
      1. Choisir des régions cibles dans le gène d'intérêt afin de maximiser la possibilité d'interrompre la fonction de la protéine de type sauvage. Pour les gènes bien annotés, choisissez une région cible en amont d'un domaine fonctionnel essentiel. Alternativement, ARNg de conception pour cibler une région en aval du codon d'initiation. Choisissez au moins 2 différentsrégions pour un gène d'intérêt.
      2. ARNg Design à l'aide de l'outil de conception de CRISPR en ligne (http://crispr.mit.edu). Pour chaque région cible, conception 3 ARNg à faible potentiel hors-cibles et d' utiliser celui avec la plus grande efficacité de ciblage pour générer clonale lignée mutante ^22.
         Remarque: Afin d'obtenir une haute efficacité du génome de l'édition, il est recommandé de fournir gARN comme oligos d'ARN au lieu de l'ADN en raison de l'efficacité de transfection plus élevée de petits ARN par rapport aux plasmides dans l'expérience passée du plasmide.
      3. L' ordre des 120 nucléotides (nt) des oligos d'ADN contenant la séquence du promoteur T7, la séquence variable de 20 nt crRNA reconnaissance (N) ₂₀ (ne comprennent pas la séquence PAM) et la séquence de guidage chimérique constante. Diluer les oligos à 100 uM solution mère en ddH ₂ O et préparer 250 nM comme solution de travail.
         NOTE: TAATACGACTCACTATAGGG (N) ₂₀ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT
      4. PCR-amplifier les oligos en utilisant les T7F et TracrR amorces (voir le tableau 2) pour produire l'ADN (dsDNA) matrice double brin pour gARN transcription in vitro (IVT). Utiliser 50 pi de mélange de réaction PCR (voir tableau 3) et des conditions de cycle de PCR (voir tableau 4).
      5. Utilisez un kit T7 transcription à haut rendement pour in vitro gARN transcription avec le modèle amplifié par PCR dans 20 ul, in vitro gARN mélange de transcription (voir tableau 5) selon les instructions du fabricant. Purifier les produits gARN en utilisant le kit de nettoyage transcription selon les instructions du fabricant.
      6. Éluer ARNg suivant le protocole de purification à haut débit selon les instructions du fabricant (typiquement ~ 50-100 ug) dans 100 ul de tampon d'élution. Ajuster la concentration à 320 ng / pl (10 uM) lorsque cela est possible et conserver à -80 &# 176; C jusqu'à utilisation.
   2. PCR et Sanger conception séquençage primaire
      1. Conception et validation des amorces de PCR d'amplification de la région cible, avec des tailles de produits allant typiquement de ~ 500 - 1000 pb.
      2. Conception de Sanger amorces de séquençage se liant à l'intérieur des produits de PCR afin de permettre le séquençage direct des produits de PCR sans purification.
   3. gARN transfection dans iCas9 hPSCs
      1. Le jour -1, traiter les cellules iCas9 avec 2 pg / ml de doxycycline 24 h avant gARN transfection.
      2. Le jour 0 de gARN transfection, préparer des plaques VTN revêtues à l' avance.
      3. Dissocier les cellules iCas9 en cellules individuelles en utilisant 1x réactif de dissociation, comme décrit à l'étape 2.5.
      4. Sédimenter les hPSCs à 200 xg pendant 5 min et remettre en suspension les cellules à environ 0,5 x 10 ⁶ cellules / ml dans du milieu complet supplémenté avec 2 pg / ml de doxycycline et un inhibiteur de ROCK 10 pm.
      5. Plaque 0,5 ml des cellules remises en suspension dans des puits individuels de plaques à 24 puits. Préparer des puits supplémentaires pour servir de témoins non transfectées.
      6. Pour chaque gARN, faire les mélanges de transfection suivants: Mélange A, 50 ul de milieu sérique réduit + 1 pi de gARN (10 uM); Mélange B, 50 ul de milieu sérique réduit + 3 ul de réactif de transfection.
      7. Combinez Mix A et B pour faire 100 mélange pl. Incuber pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 50 ul du mélange à des cellules dans les puits en double des plaques à 24 puits et bien mélanger.
      8. Le jour 1, effectuer une seconde transfection si nécessaire pour augmenter encore l'efficacité du ciblage. Sinon, changer le milieu sans doxycycline.
      9. Les jours 2 - 3, changer le milieu quotidien.
      10. Le jour 4, l' ADN génomique extrait d'un puits de chacune des cellules transfectées et non transfectées commande en utilisant un kit d'extraction d'ADN. Ajuster la concentration de 50 ng / μL.
      11. PCR amplifient les régions cibles flanquant les séquences de ciblage gARN et estimer l'efficacité de la modification à l' aide T7 endonucléase I (T7EI) la digestion ou de la longueur des fragments de restriction (RFLP) l' essai, comme décrit précédemment ^5.
   4. dosage T7EI
      1. Amplifier par PCR la région cible en utilisant les amorces conçues et validées à l'étape 3.1.
      2. Préparer les mélanges (voir tableau 6) et effectuer la dénaturation de l' ADN et l' hybridation des produits de PCR en utilisant les conditions décrites dans le tableau 7.
         NOTE: D'après notre expérience, il est généralement pas nécessaire de purifier les produits de PCR pour le dosage T7EI lors de l'utilisation de notre condition PCR. Cependant, la purification pourrait être bénéfique dans d'autres conditions.
      3. Effectuer une digestion T7EI à 37 ° C pendant 30 min en utilisant 10 ul de dénaturé et hybridé produit de PCR et 0,2 ul (2 U) de T7E1 (10 U / ul).
      4. resolve les échantillons de PCR T7E1 digéré par électrophorèse sur gel. Utilisez ImageJ pour déterminer les intensités de bande relatives de coupe et de l'ADN non coupé. Calculer la fréquence indel selon la formule suivante : (1 - (√ (1- (b + c)) / (a + b + c))) x 100, où a est l'intensité du produit digérées par PCR et b et c sont les intensités des produits clivés T7E1.
   5. test RFLP
      NOTE: Dans les cas où un site de restriction est à proximité (<5 pb) à un site de clivage cas9 (3 pb 5 'de la séquence PAM), un test de RFLP peut être réalisée pour quantifier la fréquence de indel.
      1. Utilisez les mêmes produits de PCR comme décrit à l'étape 3.1.4.1.
      2. Digérer le produit PCR avec une enzyme de restriction qui contient un site de restriction à proximité du site de clivage cas9.
      3. Régler les échantillons de PCR digérés par électrophorèse sur gel. Utilisez ImageJ pour déterminer les intensités de bande relatives de coupe et de l'ADN non coupé. Calculer le indelfréquence selon la formule suivante : a / (a + b + c) x 100, où a est l'intensité du produit de PCR non digéré et b et c sont les intensités des produits de digestion.
   6. Mise en place de lignes de mutants clonales
      REMARQUE: le montage du génome à l'aide du système hPSCs iCRISPR avec gARN la transfection est très efficace, et aucune sélection par antibiotique est nécessaire. Pour établir des lignées clonales, il est nécessaire d'ensemencer les cellules à une densité relativement faible pour assurer la formation de colonies de cellules isolées dérivées.
      1. Identifier ARNg avec le rendement le plus élevé d'édition (en utilisant le T7EI ou RFLP) et avec une bonne survie des cellules. Utilisez le double correspondant ainsi à l'établissement de la ligne mutant clonale.
      2. Dissocier les hPSCs dans une suspension à cellule unique en utilisant 1x réactif de dissociation, comme décrit à l'étape 2.5. Réensemencement 500, 1000, et 2000 cellules sur chacun des plats de trois VTN-enduit, 10 cm.
      3. Changez le u quotidien moyenusqu'à la cellule unique colonies atteignent ~ 2 mm de diamètre.
      4. Choisir les 24 - 48 colonies pour chaque gARN, en fonction de l'estimation de l'efficacité du ciblage par le T7EI et / ou RFLP. Mécaniquement désagréger chaque colonie en petits morceaux (~ 10 pièces par colonie) en utilisant une aiguille de 23 G (une pointe de pipette de 200 pi est aussi fine) et Réensemencement les cellules dans VTN-enduits, plaques à 96 puits en double. Utiliser une plaque pour l'extraction de l'ADN génomique et le séquençage Sanger et l'autre plaque d'expansion.
      5. Lorsque les cellules dans les plaques à 96 puits sont devenues confluentes, extraire l'ADN génomique (sans extraction au phénol / chloroforme) en utilisant un protocole simple, tel que décrit ci-dessous.
      6. Retirer le milieu et laver les cellules une fois avec du PBS sans Ca ²⁺ et Mg ^2+. Ajouter 50 ul de tampon de lyse (5 pi de proteinase K (10 mg / ml), 5 pi de tampon de PCR 10x, et 40 pi de ddH ₂ O) à chaque puits d'une plaque à 96 puits. Sceller la plaque à l'aide d'un film adhésif et incubeste nuit à 55 ° C.
      7. Le lendemain, le transfert des lysats de cellules dans une plaque de PCR à 96 puits et incuber pendant 10 min à 99 ° C dans un thermocycleur pour inactiver la proteinase K.
      8. Amplifier par PCR la région cible, en utilisant les mêmes amorces que pour la T7EI ou RFLP, en utilisant 1 pi de lysat cellulaire en tant que matrice.
      9. En utilisant 1 pi du produit de PCR pour le séquençage de Sanger avec une liaison à l'intérieur du produit de la PCR primaire.
      10. Amplifier les clones avec des mutations de indel frameshift pour les stocks congelés. En outre, amplifier un couple de clones de type sauvage de la même expérience de ciblage pour servir des lignes de commande comme isogéniques pour d'autres expériences.
2. Génération de lignées mutantes avec des altérations de nucléotides précises
   NOTE: Par rapport aux mutants knockout générés par la fin non homologue de jonction (NHEJ), précise nucléotide modification peut être obtenue par homologie dirigée réparation (HDR) en présence de l'ADN réparmodèles de r. De telles altérations nucléotidiques précises permettent la production de mutations spécifiques à un patient en hPSCs de type sauvage et pour la correction des mutations dans iPSCs patient dérivées.
   1. Conception de ADNss en tant que modèle HDR
      1. Conception et produire 2 - 3 ARNg à proximité d'une mutation spécifique du patient, tel que décrit à l'étape 3.1.1.
      2. La conception d'un ADN simple brin (ADNsb) contenant la mutation spécifique au patient flanquée ~ 40-80 nt d'homologie sur chaque côté en tant que modèle HDR.
      3. Afin de réduire la coupe supplémentaire après la réparation correcte, d'introduire une mutation silencieuse au gabarit ADNsb dans la région dans la séquence de reconnaissance gARN et à proximité immédiate de la séquence de PAM ou dans la séquence PAM lui-même, si possible.
      4. Si possible, la conception de la mutation silencieuse pour introduire un site de restriction de digestion nouvelle et de sorte qu'il peut être utilisé pour estimer l'efficacité de la réparation en utilisant le RFLP.
   2. GARN / ADNsb co-transfection et la création de lignées clonales
      1. Effectuer la co-transfection de gARN / ADNsb dans les cellules iCas9, comme décrit dans l'étape 3.1.3, avec les mélanges de transfection A et B. Pour chaque gARN et de contrôle non transfectées, transfecter les cellules dans des puits en double de plaques à 24 puits. Mélanger A: 50 ul de milieu sérique réduit de + 1 pi de gARN (10 uM) + 2 pi d'ADN à un brin (10 uM). Mélanger B: 50 ul de milieu sérique réduit + 3 ul de réactif de transfection.
      2. Après transfection, l'ADN génomique extrait d'un puits de chaque cellule de contrôle transfectées et non transfectées et d'estimer l'efficacité de la réparation à l'aide de la T7EI et / ou RFLP.
      3. Identifier le mélange gARN / ADNsb avec la plus grande efficacité de la réparation et de la bonne survie des cellules. Utilisez le double correspondant ainsi à l'établissement de la ligne mutant clonale.
      4. Choisir des colonies 48 - 96, en fonction de l'estimation de l'efficacité du ciblage par le T7EI et / ou le cul RFLPay. D'une manière générale, l'efficacité de la mutation induite par HDR est inférieure à une mutation knock-out et donc plus de colonies doivent être cueillies.
      5. Séquence, développez, et valider des lignées clonales, comme décrit à l'étape 3.1.6.

4. In Vitro HPSC Différenciation dans pancréatiques cellules ß de glucose-sensible

NOTE: Dans la différenciation in vitro de mutants HPSC en types de cellules maladie pertinente fournit une plate - forme pour la modélisation de la maladie dans un plat. Le protocole suivant met l' accent sur la différenciation des hPSCs in vitro dans des cellules ß du pancréas glucose-sensible pour les études de développement et diabétiques pancréatiques ^{9, 16, 17.}

1. différenciation HPSC en endoderme définitif
   1. Maintenir mutants HPSC et des lignes de commande de type sauvage à l'état chimiquement défini et chargeur-libre, comme décritd à l'étape 1.
   2. Pour préparer les hPSCs de différenciation, dissocier les hPSCs utilisant 1x réactif de dissociation et de les disperser en suspension à cellule unique dans un milieu complet.
   3. Sédimenter les cellules à 200 xg pendant 5 min et remettre en suspension les cellules dans un milieu complet avec un inhibiteur de ROCK 10 pm. Comptez le nombre de cellules et ensemencer les cellules à ~ 1,4 x 10 ⁵ cellules / ^cm2 sur des plaques VTN revêtues.
   4. Changer le support 24 h après l'ensemencement.
   5. Le jour 0, commencer la différenciation après 48 h, lorsque les cellules ont atteint ~ 80% de confluence.
      NOTE: Pour obtenir un rendement élevé de différenciation pancréatique, en optimisant la densité de semis et le niveau de la confluence à 48 h est recommandée pour chaque ligne individuelle.
   6. Aspirer le moyen HPSC et rincer les cellules une fois avec du PBS sans Ca ²⁺ et Mg ^2+.
   7. Changer le support à la différenciation jour 0 (d0) moyenne.
   8. Les jours 1 - 2, changer le differentiation moyen quotidien, selon les recettes dans le tableau 8.
   9. Le jour 3, examiner les marqueurs endodermiques définitives Sox17, FOXA2 et CXCR4 par coloration immunofluorescence et la cytométrie de flux analyse.
2. Différenciation endoderme définitif en progéniteurs du pancréas
   1. Aux jours 3-9, continuer la différenciation endoderme définitif vers la lignée pancréatique en changeant le milieu tous les jours, selon les recettes dans le tableau 9.
   2. Le jour 7, examiner le début progénitrices du pancréas (PP1) marqueur PDX1 par coloration immunofluorescence et la cytométrie de flux analyse.
   3. Le jour 10, examiner l'ancêtre du pancréas plus tard (PP2) marqueurs PDX1 et Nkx6.1. Pendant ce temps, préparer à transférer les cellules PP2 à l'interface air-liquide pour une différenciation en cellules endocrines pancréatiques.
3. Endocrine du pancréas diffèrentciation dans l'interface air-liquide
   1. Traiter les cellules PP2 avec inhibiteur de ROCK 10 uM 4 h avant la dissociation.
   2. Éliminer le milieu et rincer les cellules une fois avec du PBS sans Ca ²⁺ et Mg ^2+.
   3. Ajouter 2 ml de 1 x réactif de dissociation de cellules PP2 dans une boîte de 10 cm, et on incube à 37 ° C pendant 2 à 3 min.
   4. Aspirer le réactif de dissociation avant que les cellules ont détaché. Ajouter 10 ml de milieu Blar et disperser les cellules PP2 dans des cellules individuelles par pipetage de haut en bas.
   5. Recueillir la suspension à cellule unique. Comptez le nombre de cellules et granulés à 200 g pendant 5 min.
   6. Reprendre le culot cellulaire à ~ 0,5 x 10 ⁵ cellules / milieu de différenciation uL dans S5 et repérer 5-10 ul de cellules par point sur un filtre d'insertion Transwell. Placer 10 - 15 points dans un insert de 6 puits et environ 100 points en 10 cm insert.
   7. Ajouter du milieu S5 au fond de chaque insert Transwell, ~ 1,5 ml pour les inserts 6 puits et ~ 8 ml fou des inserts de 10 cm.
   8. Changer le support quotidien avec les recettes du tableau 10.
   9. Examiner pancréatique marqueurs endocriniens PDX1, Nkx6.1 NEUROD1, NKX2.2, INSULINE, et GLUCAGON le jour 34 par immunofluorescence et cytométrie de flux d' analyse ^17.
   10. Examiner la fonction des cellules β-like HPSC dérivé avec un glucose stimulée par la sécrétion d' insuline (GSIS) dosage ^{16, 17.}

Résultats

HPSC Chimiquement Défini et libre Feeder-Culture Adaptation et maintenance

hPSCs cultivées sur les mangeoires Imef peuvent être adaptés rapidement aux plaques VTN revêtues dans les conditions de culture sans alimentation. Le même rapport de division que la culture d'alimentation Imef normal peut être utilisé pendant l'adaptation. La figure 1A montre morphologies typiques de hPSCs sur les mangeoires Imef en milieu à base de KSR et sur une surface VTN revêtu dans un milieu sans alimentation. La figure 1B montre un changement morphologique caractéristique et la croissance des colonies HPSC au cours du premier passage d'adaptation (4 jours). Les cellules peuvent être plus ou congelés à des passages pour des expériences futures. Effectuer 2 - 3 passages de la culture d'adaptation avant de commencer les expériences de différenciation. Le caryotype est également recommandé après adaptation, même si on n'a pas observé des anomalies du caryotype pendant la phase d'adaptation.

"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> AAVS1 génération de iCas9 HPSC Lines par TALEN médiée par ciblage

Comme on le voit plus haut, hPSCs ont été électroporées avec une paire de plasmides AAVS1 Talen et cas9 et M2rtTA ⁵ plasmides. Figure 2A et B montre vecteur donneur détaillé visant la conception et l' ensemble de la procédure pour générer iCas9 HPSC lignées clonales. Après la sélection des antibiotiques, des clones de cellules isolées dérivées présentant des dimensions suffisantes et morphologie typique HPSC étaient prêts à être ramassés (10 - 12 jours après l' électroporation, la figure 2C). Habituellement , environ 50% des clones sont correctement ciblés sans intégrations aléatoires, tel que vérifié par Southern blot (figure 2D) ^5. intégration aléatoire peut provoquer une expression qui fuit de cas9 en l'absence de traitement par la doxycycline.

Efficient génétique Modification dans hPSCs Utilisation de la plate-forme iCRISPR

Dans établi iCas9 hPSCs, cas9 est exprimé avec le traitement de doxycycline et guidé à son locus cible par les ARNg transfectées, où il génère des DSB. En l'absence d'un modèle de réparation, réparation de l'ADN par NHEJ génère indels, qui entraînent souvent des perturbations du gène ou knock-out. En présence d'un modèle de réparation (par exemple, un donneur ADNss), HDR peut être utilisé pour des altérations génétiques précises, telles que la génération d' une mutation spécifique du patient dans un type sauvage HPSC fond ou de corriger une variante génétique associée à la maladie dans le patient CSPi dérivés (figure 3A). Il faut environ 1 mois pour générer des lignées mutantes clonales utilisant le système iCRISPR. Après iCas9 induction et gARN transfection, T7EI et / ou RFLP essais ont été utilisés pour évaluer l'efficacité cas9 de coupe, et les cellules transfectées ont ensuite été ensemencées comme des cellules individuelles dans des boîtes de 10 cm à basse densité (~ 500 - 2 000cellules / boîte de 10 cm). 10 - 12 jours plus tard, les clones de cellules isolées dérivées ont été placées dans les puits d'une plaque à 96 puits pour l' expansion et une caractérisation plus poussée ( par exemple, le génotypage et Western Blot) (figure 3B). Depuis le knock - out du gène iCRISPR médiée est très efficace, pas de processus de sélection est impliqué, et habituellement de 20 - 50% de mutants bialléliques peut être facilement atteint (figure 3C) ^5. Pour des altérations génétiques efficaces et précises, ARNg sont co-transfectées avec un donneur ADNss portant la modification de séquence spécifique (pour une petite mais spécifique changement de séquence du génome). Souvent, pour éviter une nouvelle coupe dans allèles modifiés, il est recommandé d'inclure une mutation silencieuse à proximité ou dans la séquence PAM (figure 3D). Avec ce système, ~ 10% de clones porteurs de la modification du génome du HDR médiée souhaité sans modifications supplémentaires dans les deux allèles sont obtenus (figures 3E). Le rapide et pmodification de recise du génome de HPSC en utilisant la plate-forme iCRISPR nous permet de faire rapidement et efficacement des lignes HPSC qui servent de modèles pour l'étude du développement humain et de la maladie.

Différenciation efficace des hPSCs vers les cellules ß-like glucose-sensible

Les progrès récents dans la différenciation HPSC pancréatique a permis le développement de protocoles qui récapitulent étroitement le développement embryonnaire du pancréas. HPSCs indifférenciées premier différenciées en l'endoderme définitif, puis dans PDX1 + progéniteurs pancréatiques début (PP1) et PDX1 + Nkx6.1 + plus tard les cellules progénitrices pancréatiques (PP2), et finalement en réponse au glucose des cellules ^{16, 17, 19 β-like, 20 , 23, 24.} Ces protocols ont été optimisées afin de générer de manière fiable PDX1 + Nkx6.1 + progéniteurs pancréatiques et les cellules ß-like glucose-sensible ^9. La figure 4A montre les suppléments chimiques détaillés utilisés à chaque étape de la différenciation. En général, environ 80% de confluence 2 jours après le plaquage initial de cellules est idéale pour le démarrage de la différenciation des HUES8 hPSCs (figure 4B). Test de plusieurs différentes densités de semis est fortement recommandé de découvrir l'état optimisé pour chaque lignée cellulaire spécifique. Habituellement , au moins 75% FOXA2 + Sox17 + cellules au stade et 40% PDX1 DE + cellules Nkx6.1 + au stade PP2 peuvent être atteints (figure 4C). Au stade S5, la présence d'une forme d'aura comme autour de l'agrégat de cellules est un indicateur de la bonne survie des cellules, ce qui est important pour une différenciation plus poussée à Nkx6.1 + cellules ß-like CPEP + glucose-sensible (Figure 4D ). Ce protocole est utile pour l'étude du pancréas humain d éveloppement et de la maladie dans un plat.

Figure 1. HPSC Défini Chimiquement et sans entretien Feeder et Culture Adaptation de Imef Feeders. (A) Des images représentatives de hPSCs cultivées sur chargeur Imef ou VTN le jour 4, prêt à être divisé. (B) de la morphologie typique de hPSCs lors du premier passage de l' adaptation dans la culture libre-alimentation à partir d' un chargeur Imef. Jour 4 hPSCs cultivées sur les mangeoires Imef ont été divisées et étalées sur des plaques VTN revêtues dans un milieu défini chimiquement avec inhibiteur de ROCK. Le rapport de séparation est le même que le rapport de division usuelle pour la mise en culture dans des conditions d'alimentation Imef. Le milieu a été changé tous les jours sans inhibiteur de ROCK. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. Génération de iCas9 HPSC Lines. (A) Stratégie de ciblage pour la génération de lignées iCas9 HPSC. Puro-cas9 donateurs et néo-M2rtTA donateurs ont été ciblés dans le locus AAVS1 humain par une paire de AAVS1 TALENs. (B) Schéma de l'ensemble du processus de ciblage, y compris l' électroporation, le choix des antibiotiques, colonie cueillette et de l' expansion, et la caractérisation de la lignée cellulaire. (C) représentant clone cellule unique prêt à être ramassé à environ 10-12 jours après l' électroporation. (D) Exemples de Southern blot pour identifier des clones correctement ciblés sans l'intégration supplémentaire de deux plasmides donneurs. Les clones corrects sont marqués en rouge. (A) et (D) ont été adaptés de référence 5, avec la permission.ig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. Modification génétique efficace dans hPSCs Utilisation du système iCRISPR. (A) Un schéma pour la génération de mutants knock - out de gène ou une modification génétique précise à l' aide du système iCRISPR. (B) La procédure de ciblage et de mise en place de la ligne clonale. (C) Gene knockout efficacité par NHEJ dans hPSCs ^9. (D) Conception d'un ADNsb portant une modification nucléotidique spécifique. P, en rouge: mutation du patient spécifique; X, en vert: mutation silencieuse. (E) L' efficacité de la modification nucléotidique précise HDR médiation. Une mutation R456C précise (provoquée par un nucléotide spécifique C> T mutation) dans le locus gata6 a été introduit en utilisant le système iCRISPR.(Reportez-vous à la référence 5 pour des informations plus détaillées). (C) et (E) ont été adaptés de référence 9 et de référence 5, respectivement, avec des autorisations. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Directed HPSC Différenciation dans pancréatiques cellules ß-like de glucose-sensible. (A) Schematics du protocole de différenciation détaillée, avec des produits chimiques complétés à chaque étape de la différenciation. Les voies de signalisation qui sont activées ou inhibées lors de la différenciation sont surlignés en vert ou rouge, respectivement. CHIR: inhibiteur de GSK3; GDF8: facteur de croissance ou de différenciation 8 myostatine, un membre de la famille de protéines TGF-bêta; HH: Hedgehog; DE: endoderme définitif; PP1:PDX1 + début progénitrices du pancréas; PP2: PDX1 + Nkx6.1 + tard progénitrices du pancréas. (B) confluence typique (70 - 80%) de hPSCs 48 h après l' ensemencement lorsque vous êtes prêt pour la différenciation initiation. (C) représentatifs des images immunofluorescence de coloration montrant la différenciation réussie à l'endoderme définitif (DE) stade (FOXA2 et Sox17 co-coloration), le stade progénitrices du pancréas (PP2: PDX1 et Nkx6.1 co-coloration), et en réponse au glucose β- comme étape de la cellule (Nkx6.1 et c-peptide co-coloration). En général, pour atteindre plus de 10% Nkx6.1 + CPEP + cellules au stade de la cellule β-like, au moins 75% FOXA2 + Sox17 + cellules DE et 40% PDX1 + cellules Nkx6.1 + PP2 sont nécessaires aux étapes correspondantes. (D) la morphologie typique d'un agrégat de cellules à l'étape S5 sur une membrane filtrante d'insertion dans la culture d'interface air-liquide. Les cellules survivantes ont migré vers le centre de l'agrégat (en noir) et à gauche d'une structure analogue aura sur le bord. (A (D) ont été adaptés à partir de Référence 9 avec des autorisations. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Plasmide	Montant
AAVS1-TALEN-L	5 pg
AAVS1-TALEN-R	5 pg
AAVS1-Puro-iCas9	40 pg
AAVS1-Neo-M2rtTA	40 pg

Tableau 1

Apprêt	Séquence
T7F	TAATACGACTCACTATAGGG
TracrR	AAAAGCACCGACTCGGTGCC

Tableau 2

Tableau 3

Composant	Montant
ddH 2 O	35,5 pi
tampon de réaction PCR 5x	10 ul
mélange de dNTP (25 mM)	0,5 ul
T7F (10 uM)	1,25 pi
TracrR (10 pM)	1,25 pi
T7-gARN IVT gabarit (250 nM)	1 ul
ADN polymérase	0,5 ul
Total mélange de PCR	50 ul

Conditions de cycle de PCR
Numéro de cycle	Dénaturer	Recuire	Étendre
1	94 ºC, 2 min
2-31	94 ºC, 20 s	60 ºC, 20 s	72 ºC, 1 min
32			72 ºC, 2 min

tableau 4

Composant
T7 ATP	2 ul
T7 CTP	2 ul
T7 GTP	2 ul
T7 UTP	2 ul
tampon T7 10x	2 ul
T7 mélange enzymatique	2 ul
PCR matrice amplifiée	8 pi
Total in vitro gARN mélange de transcription	20 ul
Incuber à 37 ° C pendant 6 h à la nuit

tableau 5

Composant	Montant (pi)
Produit PCR non purifié	8
Tampon 2 10x	2
L' eau distillée (dH 2 O)	dix

tableau 6

Dénaturation de l' ADN et hybridation des conditions de cyclage
Température	Durée	Les conditions du thermocycleur
95 ° C,	10 minutes
85 ° C	1 minute	Rampe à 85 ° C à 2 ° C / s
75 ° C,	1 minute	Rampe à 75 ° C à 0,3 ° C / s
65 ° C,	1 minute	Rampe à 65 ° C à 0,3 ° C / s
55 ° C	1 minute	Rampe à 55 ° C à 0,3 ° C / s
45 ° C,	1 minute	Rampe à 45 ° C à 0,3 ° C / s
35 ° C,	1 minute	Rampe à 35 ° C à 0,3 ° C / s
25 ° C,	1 minute	Rampe à 25 ° C à 0,3 ° C / s
4 ° C	Tenir

tableau 7

Étape	journée	Médias	Supplément
S1	d0	S1	GDF8 100 ng / ml	CHIR-99021 3uM
	d1	S1	GDF8 100 ng / ml	CHIR-99021 0,3 pm
	d2	S1	GDF8 100 ng / ml
S1 media: MCDB 131 + 1 x supplément de L-glutamine + 0,5% de BSA + 1,5 g / L de NaHCO 3 + 10 mM de glucose

tableau 8

Étape	journée	Médias	Supplément
S2	d3 d4	S1	LAA 0,25 mM	FGF7 50 ng / ml	IWP-2 2,5 pM
S3	d5 d6	S3	LAA 0,25 mM	FGF7 50 ng / ml	SANT-1 0,25 pm	RA 1 pm	LDN 100 nm	TPB 200 nm	ITS-X 1: 200
S4	d7-d9	S3	LAA 0,25 mM	FGF7 2 ng / ml	SANT-1 0,25 pm	RA 0,1 pm	LDN 200 nm	TPB 100 nm	ITS-X 1: 200	IWP-2 2,5 pM
S3 media: MCDB 131 + 1 x supplément de L-glutamine + 2% de BSA + 2,5 g / L de NaHCO 3 + 10 mM de glucose

tableau 9

Étape	journée	Médias	Supplément
S5	d10-d12	S5	T3 1 pM	ALK5i II, 10 pM	SANT-1 0,25 uM	RA 0,05 pm	LDN 100 nM	ITS-X 1: 200	ZnSO4 10 pM	Héparine 10 pg / ml
S6	d19 d13-	S5	T3 1 pM	ALK5i II, 10 pM	GSiXX 100 nM		LDN 100 nM	ITS-X 1: 200	ZnSO4 10 pM	Héparine 10 pg / ml
S7	d33 d20-	S5	T3 1 pM	ALK5i II, 10 pM	N-Cys 1mM	Trolox 10 pM	R428 2 uM	ZnSO4 10 pM	Héparine 10 pg / ml
S5 médias: Blar + 1x L-glutamine supplément + 2% de BSA + 1,5 g / L de NaHCO 3 + 20 mM de glucose

ITS-X 1: 200

tableau 10

Discussion

Temps Considérations pour Génération Mutant Lines

Bien que les approches récentes basées sur les systèmes CRISPR / Cas pour l'édition du génome ont conduit à un ciblage réussi, une plate-forme plus efficace et universel serait préférable à plus grande échelle des analyses de la fonction des gènes. La plate - forme iCRISPR offre une méthode rapide et efficace pour introduire des mutations à un gène d'intérêt ^{5, 9.} Tout d'abord, le procédé de synthèse gARN basée sur la PCR permet la production de centaines de ARNg en format revêtit d'une journée, sans les étapes de clonage chronophages. Deuxièmement, avec la doxycycline inductible cas9 expression dans iCas9 hPSCs, l'étape impliquant gARN transfection nécessite seulement une quantité minimale de travail, et donc, de multiples expériences gARN ciblant peut être réalisée en même temps. Troisièmement, en raison de la haute efficacité de ciblage réalisables avec notre système, l'analyse de ~ 24 - 48 colonies par gARN transfectées doivent être suffcace pour établir monoallélique multiples et lignées mutantes bialléliques pour un seul gène, bien que l'efficacité varient en fonction du locus cible. Comme il est possible pour une personne formée pour ramasser mécaniquement 384 colonies (plaques 4 x 96 puits) en une seule séance, qui devrait prendre ~ 4 h sous un microscope de dissection, une personne formée peut être prévu pour générer des lignées mutantes affectant 12 gènes à l'intérieur 12 mois. La génération simplifiée de mutants HPSC dans un court laps de temps permet l'analyse systématique d'un ensemble de facteurs de transcription et / ou signalisation composants de la voie qui interagissent les uns avec les autres, la régulation du processus de développement ^9. En outre, efficace ciblage génique multiplexé ouvre également la porte à étudier les interactions génétiques des traits humains complexes sous-jacents.

Génération des modifications génétiques précises

La dérivation des CSPi spécifiques au patient de facilement accessible type de cellules somatiques s et la différenciation en types de cellules pathologiques pertinents fournissent une excellente occasion pour la validation fonctionnelle des mutations associées à la maladie. Cependant, en raison de la grande variabilité dans le patrimoine génétique entre les individus, des comparaisons directes entre iPSCs provenant de patients et de donneurs sains ne permettent pas de distinguer les phénotypes de la maladie d'effets de fond. Par conséquent, il est nécessaire de générer CSPi de contrôle isogéniques en corrigeant la mutation de la maladie de retour à la séquence de type sauvage ou d'introduire des mutations spécifiques au patient dans un type sauvage HPSC fond, tel que proposé par d' autres ^{25, 26.} En plus de (null) mutations de perte de fonction, on peut maintenant disséquer plus précisément les mécanismes de la maladie par l'introduction d'une modification de séquences spécifiques au patient dans le locus endogène dans hPSCs, y compris des patients hypermorphic, hypomorphic, neomorphic ou dominant négatif des mutations.

ntent "> modification génétique précise emploie HDR pour DSB réparation en présence d'un modèle de réparation. Comme il est beaucoup moins efficace que NHEJ médiée réparation de l'ADN, un plasmide donneur contenant la mutation spécifique au patient, une cassette de sélection des médicaments, et les bras d'homologie a déjà été utilisée comme modèle de réparation ^2. Après la sélection des médicaments et la vérification de la mutation spécifique au patient, une deuxième étape est généralement nécessaire pour retirer la cassette de sélection de médicaments. Alors que les systèmes Cre-loxP et FLP-FRT les plus largement utilisés laissent derrière séquence résiduelle dans le locus endogène, l'utilisation de piggyBac transposon a permis le retrait continu de la cassette de sélection de médicaments ^27. Plus récemment, des courts modèles de ADNsb ont également été montré pour soutenir HDR efficace avec des endonucléases d'ADN par génie ^28. en comparaison avec un plasmide donneur , ADNsb peut être directement synthétisé et évite ainsi l'étape de clonage de temps. ici, il doit êtrefr montré que, par cotransfection gARN et un modèle ADNsb pour induire la réparation d'homologie dirigée, iCRISPR peut être utilisé pour introduire des modifications de nucléotides spécifiques avec une grande efficacité. Ceci est important non seulement pour disséquer le rôle des nucleotides essentiels au sein des domaines fonctionnels de protéines, mais aussi pour modéliser les mutations pathologiques chez l'homme et éventuellement de corriger ces mutations associées à la maladie pour l'intervention thérapeutique. En raison du grand nombre de loci de susceptibilité qui sont associés chacun à des variantes de séquences multiples, modélisation des maladies complexes et multigéniques telles que le diabète a été un défi pour les généticiens. Comme la plate-forme iCRISPR est permissive pour la génération rapide d'une série allélique ou pour le ciblage génique canalisable, il peut faciliter l'enquête de loci associés à la maladie multiple, soit individuellement, soit en combinaison avec des milieux isogéniques.

Cibler l'efficacité et les effets hors-cible

Nous avons trouvé une bonne corrélation entre le T7E1 et les résultats d'analyse de RFLP et le nombre de lignées de mutants identifiés par séquençage. Cela souligne l'importance d'effectuer ces essais en parallèle avec la mise en place de lignes clonales. Alors que l'efficacité de ciblage obtenus peuvent varier en fonction du locus génomique, dans la plupart des expériences de ciblage de gènes individuels, 20-60% des clones ont été trouvés avec les deux allèles mutés (y compris en phase et des mutations du cadre de lecture) ^9. Dans les cas où le ciblage génique multiplexé a été réalisée, triples clones mutants bialléliques avec 5-10% des rendements ont été obtenus ^5. ADNss médiée HDR de plusieurs gènes ont également été réalisée pour obtenir des altérations génétiques précises, avec l'efficacité de l' obtention d' homozygote knock-in clones allant de 1 à 10% ^5. Travailler avec CRISPR / Cas dans hPSCs, des mutations dans les sites potentiels hors-cible qui ne partagent pas la même séquence cible gARN sont encore à détecterlass = "xref"> ^{5, 9, 12.} Le séquençage du génome entier effectué dans une étude récente a également réussi à identifier d' importantes mutations hors-cible dans les lignes HPSC clonales généré en utilisant CRISPR / Cas ^29. Néanmoins, afin de minimiser tout effet potentiel de confondre phénotypes introduites par des mutations au niveau des sites d'effets hors-cible, il est suggéré de générer des lignées mutantes indépendants en utilisant au moins deux ARNg indépendantes ciblant différentes séquences dans le même gène. phénotypes similaires observés dans plusieurs lignes générées en utilisant différentes ARNg pourrait principalement exclure la possibilité que le phénotype provient d'un effet hors cible.

Feeder dépendante par rapport à la culture indépendante et ciblage

Les méthodes traditionnelles de culture HPSC impliquent leur entretien et à l'expansion sur les cellules nourricières dans des milieux contenant du sérum ou le remplacement de sérum qui comprend prod animalduits, tels que l'albumine de sérum bovin. Des cellules nourricières, le sérum, le remplacement de sérum, et l'albumine, contiennent tous les composants indéfinis complexes et montrent une variabilité considérable du lot. L'adaptation à l'état libre-alimentation et défini chimiquement réduit de manière significative les efforts pour l'entretien HPSC et, plus important encore, augmente la cohérence des expériences de différenciation. À l' heure actuelle, il existe très peu d' études qui décrivent les procédures d'édition du génome sur hPSCs cultivées dans des conditions de culture entièrement définies ^30. Nous avons trouvé CRISPR plus élevé ciblant l'efficacité lorsque gARN transfection et le dépôt clonale ont été effectuées dans des conditions sans nourricières par rapport aux conditions de culture nourricières-dépendante. Nous pensons que cela est dû à une augmentation de la survie des cellules après la transfection et l'ensemencement à cellule unique pour la formation de colonies. En outre, les cellules nourricières ont été précédemment montré pour séquestrer des réactifs de transfection, ce qui réduit l'efficacité de la transfection.

CombinantGenome Montage avec différenciation dirigée

Les protocoles de différenciation précédentes ont produit seulement une petite fraction de cellules positives à l'insuline, dont la plupart étaient polyhormonal et ressemblait à des cellules endocrines ²³ fœtales. Des progrès récents ont permis la différenciation des hPSCs dans des cellules plus matures de glucose sensible bêta comme ^{16, 17, 19, 20.} Nous pouvons régulièrement obtenir au moins 75% de cellules endodermiques définitives, 40% Pdx1 + Nkx6.1 + progéniteurs pancréatiques, et environ 20% Nkx6.1 + CPEP + cellules bêta-like glucose-sensible en utilisant HUES8 hPSCs ^9. Lorsqu'il est combiné avec le système de montage du génome iCRISPR, ce protocole de différenciation plus robuste a facilité l'analyse des facteurs de transcription qui sont cruciales pour les progéniteurs et endocriniens stades pancréatiques de différenciation pancréatique. Cela rendrail possible, dans les études futures, d'examiner un grand nombre de gènes de la maladie de candidat pour la validation fonctionnelle et enquête sur les mécanismes qui sous - tendent le diabète ^9.

Applications ou orientations futures

Notre système de iCRISPR peut faciliter la génération de modifications génomiques plus complexes, telles que la création d'allèles rapporteurs par ciblage génique à l' aide à long donateurs modèles d'ADN codant pour des étiquettes de protéines ou reporters fluorescents ¹² HDR-médiée. Nous avons montré que, en raison de la forte CRISPR ciblant l' efficacité atteint dans le système, ce processus peut être effectuée dans hPSCs, sans la nécessité d' une autre sélection de médicaments ^12. En outre, le gène multiplexé ciblage peut être utilisé pour étudier les interactions génétiques des maladies humaines complexes sous - jacente, comme le montre notre étude récente, que nous croyons est le premier exemple d' un tel travail ^31. iCRISPR peut également être utilisée pour comprendre le contrôle réglementaire du gène en créant des suppressions soit en ARN non codantes ou dans le gène des régions régulatrices, comme des promoteurs et des amplificateurs. Pour générer efficacement des mutants de régulation à l'aide iCRISPR, ARNg peuvent être conçus pour perturber le site de liaison d'une protéine de liaison à l'ADN, y compris mais sans s'y limiter, la machinerie de transcription basale ou un facteur de transcription spécifique d'un tissu. ADNsb HDR modèle à médiation peut également être utilisée pour muter des sites de liaison aux protéines spécifiques. Enfin, on envisage que la poursuite de l' optimisation permettrait l'utilisation de la plate - forme dans iCRISPR hPSCs pour des analyses génétiques débit plus élevé de phénotypes de pluripotence ou phénotypes de la maladie lorsqu'ils sont combinés avec un protocole in vitro de différenciation. Ces études de iCRISPR médiée peuvent permettre l'identification plus rapide des gènes et des études de leur pertinence fonctionnelle associées à la maladie candidats.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieu chimiquement défini (E8)	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Essential 8 et supplément Essential 8 inclus
Forme humaine recombinante tronquée de vitronectine	Thermo Fisher Scientific	A14700
Inhibiteur de ROCK Y-27632	Selleck Chemicals	S1049
Réactif de dissociation (enzyme TrypLE Select)	Thermo Fisher Scientific	12563029	1x, sans origine animale, enzyme recombinante
G418 Sulfate	Thermo Fisher Scientific	10131035	Geneticin Antibiotique sélectif
Puromycine dichlorhydrate	Sigma-Aldrich	P8833	Puromycine Antibiotique sélectif
ADN polymérase (Herculase II Fusion)	Agilent Technologies	600679	kit PCR
MEGAshortscript T7 Transcription kit	Thermo Fisher Scientific	AM1354
MEGAclear Kit de nettoyage de transcription	Thermo Fisher Scientific	AM1908
Hyclate de doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891
Opti-MEM medium	Thermo Fisher Scientific	31985062	Sérum réduit Medium
Lipofectamine RNAiMAX Réactif de transfection	Thermo Fisher Scientific
DNeasy Blood & Kit de tissus	QIAGEN	69504	Kit d’extraction d’ADN génomique
Protéinase K	Roche	3115879001
MCDB 131 milieu	Thermo Fisher Scientific	10372-019
Milieu BLAR	Thermo Fisher Scientific		Fabriqué sur mesure avec une formulation publiée (Rezania et al., 2014)
Supplément de L-glutamine (GlutaMAX)	Thermo Fisher Scientific	35050061
NaHCO3	Thermo Fisher Scientific	144-55-8
Glucose	Sigma-Aldrich	G8769
BSA	LAMPIRE Biological Laboratories	7500855	Sans acides gras
GDF8	PeproTech	120-00
CHIR-99021	Tige	04-0004	Inhibiteur de GSK-3
Acide L-ascorbique	Sigma-Aldrich	A4544	Vitamine C
FGF7	R& D Systems	251-KG
SANT1	Tocris Bioscience	1974	Inhibiteur de Hedgehog
RA	Sigma-Aldrich	R2625	Acide rétinoïque
LDN	Stemgent	04-0019	Inhibiteur de BMP
IWP-2	Tocris Bioscience	3533	Antagoniste de Wnt  ;
ITS-X	Thermo Fisher Scientific	51500-056
TPB	EMD Millipore	565740-1MG	Activateur PKC
3,3',5-Triiodo-L-thyronine (T3)	Sigma-Aldrich	T6397
ALK5i II	Enzo Life Sciences	ALX-270-445	Inhibiteur d’ALK5 II
ZnSO4	Sigma-Aldrich	Z0251
Héparine	Sigma-Aldrich	H3149
GSiXX	EMD Millipore	565789	Inhibiteur de la gamma sécrétase XX, inhibiteur de signalisation NOTCH
N-Cys (N-acétyl cystéine)	Sigma-Aldrich	A9165
Trolox	EMD Millipore	648471	Analogue de la vitamine E
R428	Selleck Chemicals	S2841	Récepteur AXL tyrosine kinase inhibiteur
24 mm Transwell avec insert	Corning Life Sciences	3414
Gene Pulser Xcell Système d’électroporation	Bio-Rad	1652660
0,4 cm Cuvettes d’électroporation	Bio-Rad	1652081
AAVS1-TALEN-L	Addgene	59025
AAVS1-TALEN-R	Addgene	59026
AAVS1-Neo-M2RTTA	Addgene	60843
AAVS1-Puro-iCas9	Addgene	58409
T7 Endonuclease I	NEB	M0302L
Buffer 2	NEB	B7002S	NEBuffer 2
Long oligonucléotide Eton	Bioscience ou IDT
Anticorps SOX17	R& D Systems	AF1924	1:500
FOXA2	anticorps Millipore	07-633	1:100
CXCR4-APC anticorps	R& D Systems	FAB170A	1:25
Anticorps PDX1	R& D Systems	AF2419	1:500
NKX6.1 anticorps	DSHB	F55A12	1:500
NKX2.2 anticorps	DSHB	74.5A5	1:100
NEUROD1	anticorps Santa Cruz Biotechnology	sc-1084	1:100
Anticorps anti-insuline	Dako	A0564	1:2 000
Anticorps peptidique C	DSHB	GN-ID4-c	1:2 000
Anticorps anti-glucagon	Sigma-Aldrich	G2654	1:1 000