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Article de méthode

Murine lymphocytaire par étiquetage

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DOI :

10.3791/55270

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29 avril 2017

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1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University Tübingen, 2Department of Dermatology, Eberhard Karls University Tübingen

Dans cet article

Résumé

Suite à la préparation d'un 64 anticorps monoclonal Cu-modifié de liaison à un récepteur de cellule T murine transgénique, les cellules T sont radiomarqué in vivo, une analyse de la viabilité, la fonctionnalité, la stabilité du marquage et de l' apoptose, et par transfert adoptif dans des souris avec une voie aérienne d'hypersensibilité de type retardé réaction pour l'imagerie non invasive par tomographie par émission de positons / tomodensitométrie (PET / CT).

Résumé

Ce protocole illustre la production de 64 Cu et la conjugaison chélateur / radiomarquage d'un anticorps monoclonal (mAb) , suivie d' une culture de cellules de lymphocytes murins et 64 récepteur Cu-anticorps ciblant des cellules. Dans l' évaluation in vitro du radiomarqueur et non-invasive dans le suivi des cellules in vivo dans un modèle animal d'une voie aérienne d' hypersensibilité retardée réaction (DTHR) par PET / CT sont décrites.

Dans le détail, la conjugaison d'un anticorps monoclonal avec l'agent chélatant acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-1,4,7,10-tétraacétique (DOTA) est représenté. Suite à la production de 64 radioactif Cu, le radiomarquage de l'anticorps monoclonal DOTA-conjugué est décrite. Ensuite, l'expansion de l' ovalbumine de poulet (COVA) CD4 + interféron spécifique de (IFN) -γ-production de cellules T auxiliaires (Cova-TH1) et la radiomarquage subséquente des cellules Cova-TH1 sont représentés. Diverses techniques in vitro sont présentées pour évaluer l'effets de 64 Cu-radiomarquage sur les cellules, telles que la détermination de la viabilité des cellules par exclusion au bleu trypan, la coloration de l' apoptose avec l' Annexine V pour la cytométrie en flux, et l'évaluation de la fonctionnalité par un dosage immuno-enzymatique IFN-γ (ELISA) . En outre, la détermination de l'absorption radioactive dans les cellules et la stabilité de l'étiquetage sont décrites en détail. Ce protocole décrit en outre comment effectuer des études de suivi de cellules dans un modèle animal pour une DTHR des voies respiratoires et, par conséquent, l'induction de DHTR aiguë des voies aériennes induite par COVA dans des souris BALB / c est inclus. Enfin, un flux de travail TEP / CT robuste comprenant l'acquisition d'image, la reconstruction, et l'analyse est présentée.

Le 64 récepteur de Cu-anticorps approche de ciblage avec l' internalisation du récepteur ultérieur fournit une spécificité élevée et la stabilité, réduit la toxicité cellulaire, et de faibles taux d'efflux par rapport au PET traceurs communs pour le marquage cellulaire, par exemple 64 Cu-pyruvaldehyde bis (N4-méthylthiosemicarbazone) (64 Cu-PTSM). Enfin, notre approche permet non-invasive in vivo suivi des cellules en PET / CT avec un rapport optimal signal-sur-fond pendant 48 heures. Cette approche expérimentale peut être transférée à différents modèles animaux et types de cellules avec les récepteurs liés à la membrane qui sont internalisés.

Introduction

Le suivi des cellules non-invasive est un outil polyvalent pour surveiller la fonction cellulaire, la migration et homing in vivo. De récentes études de suivi de cellules se sont concentrées sur mésenchymateuses 1, 2 ou cellules souches dérivées de la moelle osseuse 3 dans le cadre de la médecine régénérative, les globules blancs périphériques autologues dans l' inflammation ou des lymphocytes T dans des thérapies cellulaires adoptifs contre le cancer 3, 4. L'élucidation des sites d'action et les principes biologiques sous-jacents des thérapies à base de cellules est d'une importance énorme. CD8 + lymphocytes T cytotoxiques, récepteur de l' antigène chimère génétiquement modifiées (CAR) des cellules T ou des lymphocytes infiltrant les tumeurs (TIL) ont été largement considéré comme l'étalon-or. Cependant, les cellules TH1 spécifiques de l' antigène associé à la tumeur se sont révélés être une option de traitement alternative efficace 4, </ sup> 5, 6, 7.

Comme les principaux acteurs dans l' inflammation, les maladies auto - immunes spécifiques d'organes (par exemple, la polyarthrite rhumatoïde ou d' asthme bronchique), et les cellules de grand intérêt pour l' immunothérapie du cancer, il est important de caractériser les modes de distribution et de homing temporelles des cellules TH1. L' imagerie in vivo non invasive par TEP présente une quantitative, une méthode très sensible 8 pour examiner les schémas de migration des cellules, dans la prise d' origine in vivo, et les sites d'action des lymphocytes T et des réponses au cours de l' inflammation, les allergies, les infections ou le rejet de la tumeur 9, 10, 11.

Cliniquement, 111 In-oxine est utilisé pour la scintigraphie des leucocytes pour la discrimination de l' inflammation et de l' infection 12, tandis que le 2-désoxy-2- (18F) fluoro-D-glucose (18 F-FDG) est couramment utilisé pour les études de suivi des cellules en PET 3, 13. Un inconvénient majeur de ce traceur PET, cependant, est la courte demi-vie du radionucléide 18 F à 109,7 min et la faible stabilité intracellulaire qui empêche l' imagerie aux points de temps plus tard transfert post cellulaire adoptive. Pour plus long terme in vivo des études de suivi de cellules par PET, bien instable dans les cellules, 64 Cu-PTSM est fréquemment utilisé pour étiqueter de façon non spécifique des cellules 14, 15 avec des effets néfastes réduits au minimum sur la viabilité des cellules T et la fonction 16.

Ce protocole décrit un procédé pour réduire davantage les effets désavantageux sur la viabilité cellulaire et la fonction à l'aide d'un récepteur de cellule T (TCR) de mAb radiomarquée spécifique de. Premièrement, la production du radio - isotope 64 Cu, la conjugaison du mAb avec KJ1-26 ee chélateur DOTA, et le 64 Cu-radiomarquage ultérieur sont présentés. Dans une deuxième étape, l'isolement et l' expansion de cellules Cova-TH1 de souris donneuses DO11.10 et le radiomarquage avec sont décrits en détail 64 mAb conjugué DOTA-Cu chargé KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26). L'évaluation des valeurs absorption et l' efflux de la radioactivité avec un calibrateur de dose et par y-comptage, respectivement, ainsi que l'évaluation des effets de 64 Cu-radiomarquage sur la viabilité des cellules par exclusion au bleu trypan et de fonctionnalité avec ELISA de IFN-y sont présentés . Pour les non-invasive dans le suivi des cellules in vivo, le déclenchement d'un modèle de souris de DTHR voies aériennes aiguë induite par Cova et l' acquisition d' image par PET / CT après le transfert cellulaire adoptive sont décrits.

De plus, cette approche de l'étiquetage peut être transférée à différents modèles de la maladie, les cellules T de souris avec différentes cellules ou RLT d'intérêt général avec les récepteurs liés à la membrane ou l'expression markers membrane continue qui sous - tend la navette 17.

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Protocole

Mesures de sécurité: Lors de la manipulation de radioactivité, stocker 64 Cu derrière plomb de 2 pouces d'épaisseur des briques et utiliser un blindage respectif pour tous les navires transportant l' activité. Utiliser des outils appropriés pour gérer indirectement des sources non protégées pour éviter le contact direct des mains et de minimiser l'exposition aux matières radioactives. Portez toujours des badges de surveillance dosimétrique de rayonnement et de l'équipement de protection individuelle et de vérifier soi-même et la zone de travail de contamination pour répondre immédiatement. Jeter un équipement de protection personnelle potentiellement contaminés avant de quitter la zone où des matières radioactives est utilisé. Stocker l'ensemble des déchets radioactifs derrière le blindage de plomb jusqu'à ce que le 64 Cu est décomposé radioactive (environ 10 demi-vies = 127 h) avant l' élimination adéquate.

1. 64 Production de Cu

NOTE: Le radio - isotope 64 Cu est produit par l'intermédiaire du 64 Ni (p, n) 64 Cu réaction nucléaire en utilisant un Pettcyclotron de course selon un protocole modifié de McCarthy et al. 18.

  1. Pour 64 la production de Cu, Ni irradier 64, qui est électrodéposé sur une plaque de platine / iridium (90/10), avec 30 uA pendant 6 h avec un faisceau de protons de 12,4 MeV.
  2. Chauffer la cible de platine / iridium à 100 ° C dans une chambre polyétheréthercétone dédié (PEEK) et incuber dans 2 ml de HCl concentré pendant 20 min pour dissoudre 64 Cu / Ni 64.
  3. Ajouter un autre 1 ml de HCl concentré et incuber pendant 10 min.
  4. Evaporer HCl en utilisant un courant d'argon et refroidir la chambre à la température ambiante.
  5. Rincer la chambre avec 3 mL de 4% 0,2 M HCl et 96% de méthanol (v / v) et le transfert de cette solution à une colonne d'échange d'ions qui a été pré-conditionné avec 4% de 0,2 M HCl dans du methanol pendant au moins 15 min. L'écoulement peut être utilisée pour recycler 64 Ni.
  6. Laver le 64 Cu retenu dans la colonne avec 4% de HCl 0,2 M in methanol.
  7. Eluer avec 64 Cu 70% 1,3 M HCl / isopropanol 30% (v / v) dans un flacon de collecte, on évapore la solution dans un courant d'argon et on laisse le flacon refroidir à température ambiante.
  8. Dissoudre 64 Cu dans 140-210 ul de HCl 0,1 M.

2. Anticorps Conjugaison avec DOTA et ultérieure 64 Cu-radiomarquage

NOTE: Le chélateur DOTA sera lié à des groupes amino fonctionnels de la chimie de l' ester mAb par N-hydroxysuccinimide (NHS) et le conjugué radiomarqué sera par la suite avec 64 Cu 19.

  1. Régler la concentration de la KJ1-26-mAb à 8 mg / ml et diafiltrat 1 ml de solution de mAb contre 0,1 M de Na 2 HPO 4 pH 7,5 traitée avec 1,2 g / l d'une résine échangeuse d'ions chélatante en utilisant un poids moléculaire coupé ( MWCO 30 kDa) unité de filtre centrifuge. Appliquer 3 étapes de lavage ultérieures avec 14 ml du tampon. Après l'étape de lavage final,se concentrer à nouveau la solution à 1 ml. Quantifier la concentration d'anticorps par des mesures de DO à 280 nm.
  2. Préparer une solution DOTA-NHS dans l'eau ultra-pure ou de qualité PCR à une concentration de 10 mg / ml immédiatement avant utilisation. Laisser le flacon à régler la température ambiante avant de l'ouvrir pour éviter la condensation de l'eau, et enlever soigneusement DOTA-NHS à l'aide d'une spatule en plastique. Ajouter 216 pi de cette solution DOTA-NHS à 8 mg de la solution KJ1-26-mAb diafiltrées, bien mélanger et incuber pendant 24 heures à 4 ° C sur un mélangeur à tambour.
  3. Diafiltrat le DOTA-KJ1-26-mAb contre 0,25 M d'acétate d'ammonium, pH 7,0, on traite avec 1,2 g / l d'une résine échangeuse d'ions chélatante, en utilisant un seuil de poids moléculaire (MWCO 30 kDa) de l'unité de filtre centrifuge. Appliquer 7 étapes de lavage. Concentrer le mAb à un volume final de 1 ml et mesurer à nouveau la concentration en protéines par des mesures OD de 280 nm.
  4. Avant le radiomarquage, échanger le tampon du DOTA-KJ1-26-mAb de PBS par taille-HTChromatographie en utilisant des colonnes de lusion de filtration sur gel. Cela élimine également les impuretés de petites molécules potentielles.
  5. Préparer 100 MBq 64 solution de CuCl 2 dans 10 mM de HCl et ajuster le pH à 6-7 avec 10x PBS. Ajouter 200 pg de DOTA-KJ1-26-mAb. Incuber pendant 60 min à 37 ° C.
  6. Pour le contrôle de qualité, effectuer une Chromatographie en couche mince avec 0,1 M de citrate de sodium (pH 5) en tant que phase mobile et l'analyse par autoradiographie. Au moins 90% de l'activité doit être liée à l'anticorps et ainsi être détectée à l'endroit de départ. activité non liée est chélaté par la phase mobile à base de citrate et des stries à l'avant solvant. Pour référence, l'utilisation de 64 CuCl2 est conseillé.

3. poulet TH1 ovalbumine-spécifiques (Cova-TH1) Isolement et expansion de cellules

NOTE: La culture des cellules TH1 est décrit selon des études publiées antérieurement 16, 17.

  1. Isoler les rates et les ganglions lymphatiques extrapéritonéale (LNS) provenant de souris DO11.10.
    1. Sacrifiez la souris selon les règlements fédéraux. Désinfecter l'animal avec 70% d'éthanol et fixer avec du ruban adhésif pour l'ablation de la rate et de ganglions. Faire une incision médiane et séparer la peau du péritoine en la tirant latéralement sur chaque site.
    2. Localisez le col de l'utérus, axial, brachial et LNS inguinale. les enlever avec une pince émoussés et les placer dans 1% de sérum de veau foetal (FCS) / tampon PBS.
    3. Ouvrez le péritoine et de localiser la rate. Séparer la rate par le pancréas et le tissu conjonctif et le placer dans une mémoire tampon% de FCS / PBS. Pour plus de conseils, voir les références 20,21.
  2. rate et ganglions hachis à travers un filtre de 40 um dans un tube à bouchon à vis de 50 ml en utilisant le piston d'une seringue. Rincer le filtre avec 10 ml de 1% de FCS / PBS-tampon.
  3. Centrifuger à 400 g pendant 5 min et retirer le surnageant. Subsequently, effectuer la lyse des globules rouges en ajoutant un tampon de lyse de chlorure d'ammonium-potassium (ACK) (1,5 ml par animal donneur) pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 8,5 ml de 1% de FCS / PBS tampon (par animal donneur).
  4. Centrifuger les cellules à 400 xg pendant 5 minutes et éliminer le surnageant. Laver les cellules dans 10 ml de 1% de FCS / PBS-tampon, centrifuger à 400 g pendant 5 minutes et éliminer le surnageant.
  5. Pour la séparation magnétique de cellules, remettre en suspension les cellules dans 1% de FCS / PBS-tampon et ajouter CD4 + microbilles. Reportez - vous aux instructions du fabricant pour le volume tampon et la quantité de CD4 + microbilles à utiliser.
  6. Incuber pendant 20 min à 4 ° C. Puis ajouter 1% de FCS / PBS tampon jusqu'à 50 ml, centrifuger les cellules à 400 xg pendant 5 min, et retirer le surnageant.
  7. Continuer avec CD4 + isolement des cellules T en utilisant des colonnes de séparation magnétique commerciales et un support magnétique respectif selon le protocole du fabricant. Ajuster les cellules T CD4 + éluées à une concentration de 10 6 cellules / ml dans Modifié de Dulbecco du milieu de Eagle avec 10% inactivé par la chaleur de FCS, 2,5% de pénicilline / streptomycine, 1% de tampon HEPES, 1% MEM acides aminés, 1% de pyruvate de sodium et 0,2% de 2-mercaptoéthanol et de magasin les à 4 ° C.
  8. Recueillir la décharge de la colonne dans un tube à bouchon à vis de 50 ml pour préparer des cellules présentant l'antigène (APC). Centrifuger la décharge de la colonne à 400 g pendant 5 minutes et éliminer le surnageant.
  9. Ajouter 10 pg / ml anti-CD4 (clone: ​​GK1.5), 10 pg / ml anti-CD8 (clone: ​​5367,2) et la souris anti-rat-mAb (MAR18.5) 10 pg / ml et 1,5 ml complément de lapin. Incuber pendant 45 min à 37 ° C.
  10. Centrifuger les cellules à 400 g pendant 5 min, retirer le surnageant et ajouter 3 ml de milieu. Irradier l'APC sur une source de rayons γ ou de rayons X avec 30 Gy au total. Ensuite, ajuster les APC à une concentration de 5 x 10 6 cellules / ml.
  11. Ajouter 100 ul de cellules T CD4 + et 100 pi de véhicules blindés sur un 96 puits plate avec 10 ug / mL cOVA-peptide 323-339, 10 pg / ml d'anti-IL-4-mAb, 0,3 uM d'oligonucléotides CPG1668 et 5 U / ml d'IL-2.
  12. Ajouter 50 U / ml d'IL-2 tous les deux jours. Après 3 - 4 jours, transférer les cellules à partir de plaques à 96 puits à des plaques à 24 puits. Moissonneuse 3-5 puits de la plaque à 96 puits dans un puits sur la plaque à 24 puits. Ajouter 100 IL-2 U / ml contenant du milieu dans un rapport 1: 1.
  13. Après encore 2-3 jours, transférer les cellules de la plaque à 48 puits à 175 cm 2 flacons de culture de cellules (1 x plaques à 48 puits par flacon). Remplir avec du milieu dans un rapport 1: 1. Ajouter 50 U / ml d'IL-2 tous les deux jours.
  14. Séparer les cellules selon la densité des cellules et ajouter 50 U / ml d'IL-2 tous les deux jours. De cette façon, la culture des cellules pendant encore 10 jours.

4. Cova-TH1 cellulaire radiomarquage

NOTE: Le 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb sera appliqué à des cellules en culture Cova-TH1 pour permettre le marquage radioactif intracellulaire.

  1. Pour CE Cova-TH1ll radiomarquage, dessiner 37 MBq de l'radiomarqué 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb dans une seringue sans volume mort en utilisant un calibrateur de dose. Ajouter 1 ml de solution saline pour recevoir une solution à 37 MBq / mL.
  2. Suspension de cellules Cova-TH1 dans un milieu à 2 x 10 6 cellules / ml et ajouter 0,5 ml de la suspension cellulaire à chaque puits dans une plaque à 48 puits.
  3. Ajouter 20 ul de la fraîchement préparées 37 MBq / ml 64 de solution de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb à chaque puits de la plaque à 48 puits. Le rapport final de l'étiquetage est de 0,7 MBq par 10 6 cellules dans un volume de 520 ul. Incuber à 37 ° C et 7,5% de CO 2 pendant 30 minutes.
  4. Après incubation, la remise en suspension avec précaution les cellules dans chaque puits et transférer la suspension cellulaire à partir de la plaque à 48 puits dans un tube à bouchon à vis de 50 mL. Pour minimiser la perte de cellules, rincer chaque puits avec le milieu préchauffée.
  5. Centrifuger la suspension cellulaire Cova-TH1 à 400 xg pendant 5 minutes, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 ml de PBS préchauffé. Supprimer un aliquot de la suspension de cellules pour comptage de cellules. Répétez l'étape de lavage.
  6. Nombre de cellules viables Cova-TH1 dans une dilution appropriée avec coloration au bleu trypan.
  7. Ajuster la concentration cellulaire à 5 x 10 7 cellules / ml pour l' injection intraperitoneale (ip) de 10 7 cellules dans 200 ul de PBS.
  8. Répéter les étapes 4.3 à 4.5 pour radiomarquer les cellules Cova-TH1 avec des quantités croissantes de l' activité, par exemple, 1,4 ou 2,1 MBq MBq par 10 6 cellules.
    1. Pour radiomarquer les cellules avec 1,4 MBq par 10 6 cellules, en utilisant 40 ul de 37 MBq / ml de 64 solution de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb et 60 ul de radiomarquage avec 2,1 MBq par 10 6 cellules. Effectuer les étapes 4.3 à 4.7 avec 0,7 MBq, 1,4 MBq et 2,1 MBq 64 Cu-PTSM mais augmenter le temps d'étiquetage à 3 h pour des études comparatives 17.
    2. Passez à l'étape 5 pour déterminer la quantité optimale de l'activité.

5. Evaluation in vitro de l'effet de la radioactivité sur les cellules Cova-TH1

REMARQUE: La caractérisation de l'influence du marqueur radioactif dans les cellules TH1 est effectuée par l' intermédiaire d' essai d'exclusion au bleu trypan pour la viabilité, ELISA de IFN-y pour l' évaluation de la fonctionnalité et de PE-annexine coloration de V pour l'induction de l' apoptose 16, 17. Détermination de l'absorption intracellulaire et l'efflux de radioactivité est également décrite ci-dessous. A titre de comparaison, 64 Cu-PTSM marqué les cellules Cova-TH1 peuvent également être utilisés.

  1. Effet sur la viabilité par exclusion du bleu trypan
    1. Ajuster au moins 18 x 10 6 cellules Cova-TH1 radiomarqués avec 0,7 MBq / 10 6 cellules, 1,4 MBq / 10 6 cellules et 2,1 MBq / 10 6 cellules respectivement à une concentration de 2 x 10 6 cellules / ml et effectuer les étapes 5.1. 2-5.1.7 pour chaque dose d'activité. Utilisez non radioactive KJ1-26-mAb marqué les cellules Cova-Th1 et les cellules non marquées Cova-TH1 en tant que contrôles.
    2. Pipeter 1 mL de la solution de cellules dans 9 puits d'une plaque à 24 puits.
    3. Recueillir le contenu des 3 puits en trois tubes séparés de bouchon à vis de 15 ml, 3 h après le radiomarquage initial.
    4. Rincer les puits vides maintenant avec un milieu préchauffé pour réduire au minimum la perte de cellules et ajouter le milieu des tubes à bouchon à vis de 15 ml respectives de l'étape 5.1.3.
    5. Centrifuger les tubes de 15 ml à 400 xg pendant 5 min et remettre en suspension le culot cellulaire résultant dans 1 ml de milieu préchauffé.
    6. Compter à la fois viables et les cellules mortes en bleu trypan séparément pour chaque tube de 15 ml et calculer le pourcentage de cellules viables.
    7. Répéter les étapes 5.1.3-5.1.6 24 et 48 h après 64 radiomarquage Cu-DOTA-KJ1-26-mAb.
  2. Effets sur les fonctionnalités déterminées par ELISA de IFN-y
    NOTE: Pour évaluer l'effet du 64 Cu-DOTA-KJ1 26-mAb sur radiomarqueur productio IFN-γn comme marqueur de fonctionnalité, effectuer un test ELISA IFN-γ d'un fournisseur commercial et reportez-vous à la référence 17 pour plus de détails.
    1. Disperser 10 5 cellules viables dans 100 ul de milieu sur une plaque à 96 puits, 3 h après 64 radiomarquage Cu-DOTA-KJ1-26 des cellules TH1 Cova-0,7 MBq, 1,4 MBq ou 2,1 MBq. Utilisation non marquées, non radioactives KJ1-26-mAb marqués ou 64 Cu-PTSM cellules marquées Cova-TH1 en tant que contrôles.
    2. Stimuler la production d' IFN-γ dans 10 5 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marqués cellules Cova-TH1 dans 100 ul de milieu avec 10 ug / mL de peptide COVA, 5 U / ml d' IL-2 et 5x10 5 à 100 APC uL de milieu pendant 24 h à 37 ° C et 7,5% de CO 2. D'autres contrôles peuvent être les autres conditions sans addition du peptide Cova.
    3. Analyser le surnageant par ELISA selon les instructions du fabricant.
    4. Répétez l'étape 5.2.2. à 5.2.3. à 24 et 48 h après la procédure d'étiquetage.
  3. L' induction de l' apoptose déterminé par coloration PE-Annexine V pour la cytométrie de flux
    NOTE: Pour évaluer l' apoptose induction par le 64 marqueur radioactif Cu-DOTA-KJ1-26-mAb, utiliser un kit disponible dans le commerce cytométrie en flux et préparer des échantillons de cellules selon les instructions du fabricant avant coloration avec l' Annexine V pour exposition phosphatidyl serine sur la membrane cellulaire .
    1. A 3, 24 et 48 h après 64 radiomarquage Cu-DOTA-KJ1-26-mAb des cellules Cova-TH1, triple tache avec au moins 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marqués cellules Cova-TH1 avec le kit Annexin V selon les instructions du fabricant et analyser dans l'heure suivante. Utilisation non radioactifs KJ1-26-marqués mAb, 64 Cu-PTSM marqués et non marqués cellules Cova-TH1 en tant que témoins. S'il vous plaît se référer à la référence 17 pour plus de détails.
  4. : Captage et efflux
    NOTE: L'absorption du 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb dans les cellules est mesurée dans un étalonneur de dose et l'efflux de la radioactivité est mesurée dans un essai de γ-comptage 0, 5, 24 et 48 h après le radiomarquage.
    1. Préparer dix tubes γ-comptage pour chacun 64 cellules TH1 Cova-Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marqués, et le surnageant respectif de l'étape de lavage.
    2. Transférer 10 6 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marqué par les cellules Cova-TH1 dans 1 ml de milieu dans chacune des dix tubes γ-comptage directement après le radiomarquage. Pour chacun des points de temps 5, 24 et 48 h après le radiomarquage, conserver au moins 10 7 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marqués cellules Cova-TH1 dans le milieu sur des plaques de culture cellulaire à 24 puits dans un incubateur à 37 ° C et 7,5% de CO 2.
    3. Centrifuger les tubes γ-comptage à 400 xg pendant 5 min et transférer le surnageant dans dix nouveaux tubes γ-comptage.
    4. Laver les cellules une fois dans 1 ml de milieu pour éliminer la fraction non liée de 64 un Cu-DOTA-KJ1-26-mAbD recueillir le surnageant dans dix nouveaux tubes γ-comptage.
    5. Ajouter 1 ml nouveau support aux cellules Cova-TH1 et déterminer la valeur d'absorption initiale dans un calibrateur de dose. Les tubes peuvent également être stockés dans un incubateur à 37 ° C et 7,5% de CO 2.
    6. Répéter les étapes 5.4.2 à 5.4.5 après 5, 24 et 48 h et de mesurer tous les tubes dans une γ-compteur selon le protocole du fabricant. Pour corriger la désintégration radioactive et pour l'analyse quantitative, utiliser un standard avec une dose définie de radioactivité.

6. OVA induite par voie aérienne aiguë RSDT

NOTE: La dynamique de la migration et les modèles de prise d' origine de adoptivement transférées et les cellules radiomarqué Cova-TH1 sur le site de l' inflammation sera visualisée et quantifiée dans un modèle animal pour voies respiratoires RSDT induite Cova 16, 17.

  1. Injecter 8 semaines âgés de souris BALB / c par voie ip avec un mélange de 150 ul aluminum gel / 50 uL Cova-solution (10 ug dans 50 ul de PBS) pour immuniser des souris.
  2. Deux semaines après l'immunisation, anesthésier les souris avec 100 mg / kg de kétamine et de 5 mg / kg de xylazine par injection ip. Placer les souris expérimentales sur le dos et pipeter lentement 100 ug Cova dissous dans 50 ul de PBS dans les narines de l'animal. Les animaux inhalent la chute de solution goutte à goutte.
  3. Répétez après 24 h. Pour inductions DTHR plus forts des voies respiratoires, répéter à nouveau après 48 h.
  4. Pour analyser la migration spécifique des cellules Cova-TH1 transférées, induisent des voies aériennes RSDT avec la dinde ou le faisan-OVA comme témoin. Par conséquent, répétez les étapes 06.01 à 06.03 en utilisant la OVA-protéine respective.

7. imagerie in vivo L' utilisation du PET / CT

Remarque: dans l' imagerie in vivo de 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marqués cellules Cova-TH1 chez des souris malades Cova-DTHR et la même portée de contrôle démontre la prise d' origine spécifique et la mila dynamique gration des cellules Cova-TH1. Par conséquent, l'acquisition de la TEP statique et CT anatomique balaye séquentiellement 3, 24 et 48 h transfert de cellules post-adoptive.

  1. Directement après le radiomarquage, d' ajuster les 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb marqués cellules Cova-TH1 à 5 x 10 7 cellules / ml pour l' injection ip de 10 7 cellules dans 200 ul.
  2. En utilisant une seringue de 1 mL et une aiguille de calibre 30, tracer 200 pi du 64 Cu-DOTA-KJ1-26-marqué mAb suspension cellulaire Cova-TH1 et injecter les cellules IP dans les animaux Cova-DTHR-malades entre le 4 e et 5 e mamelon. Pour déterminer la quantité de radioactivité totale injectée de, mesurer la seringue dans un calibreur de dose avant et après l'injection.
  3. Anesthésier les souris, 10 minutes avant l'heure de l'absorption désirée, avec 1,5% d'isoflurane dans 100% d'oxygène (débit: 0,7 L / min) dans une zone de l'anesthésie à température contrôlée.
  4. En attendant, pour faciliter la co-registrationdes images TEP et CT lors de l' analyse d'image, fixer des capillaires en verre contenant 64 solution ou solution libre 64 CuCl 2 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb sous le lit de la souris.
    1. Par conséquent, préparer une solution de 0,37 MBq / ml et remplir les capillaires en verre d'un volume de 10 ul de cette solution. Les signaux de radioactivité provenant de cellules sont intrinsèquement faibles, ne pas utiliser de grandes quantités d'activité pour vous assurer que les marqueurs ne sont pas interférer avec les signaux dérivés de cellules chez les souris.
  5. Après avoir atteint la tolérance chirurgicale, comme indiqué par la perte du réflexe de retrait de la pédale de la patte postérieure, transférer la souris à un PET-CT-compatible et petit lit animal équipé d'un système de tubage adapté pour maintenir l'anesthésie.
  6. Immobiliser la souris sur le petit lit animal à l'aide de cotons-tiges et sparadrap. Appliquer une pommade oculaire pour éviter le dessèchement des yeux.
  7. Transférer le lit de la souris sur le scanner PET, centre du champ de vision avec un focus sur les poumons et d'acquérir un balayage PET statique de 20 min avec une fenêtre d'énergie de 350-650 keV.
  8. Transférer le lit de la souris sur le scanner CT. Via scout vue, centrer le champ de vision sur les poumons. Acquérir une image de CT plane par l'intermédiaire de 360 ​​projections lors d'une rotation de 360 ​​° dans le mode « pas à pas et shoot » avec un temps d'exposition de 350 ms et binning facteur 4.

8. Analyse de l'image

  1. Reconstruire PET données en mode liste en appliquant la maximisation de l'espérance de sous-ensemble ordonné itérative statistique (OSEM) algorithme 2D et la tomodensitométrie en une image 3D avec une taille de pixel de 75 pm.
  2. Pour l' image co-inscription dans un logiciel d'analyse d'image appropriée (par exemple Inveon recherche en milieu de travail ou Pmod), utilisez l'outil de co-enregistrement automatique. Si cela échoue, utilisez les capillaires en verre sous le lit de la souris comme guide pour co-enregistrer les images TEP et TDM reconstruit dans l'espace dans le sens axial, et coronale sagittal.
  3. Corriger les images PETde la désintégration radioactive en utilisant la loi de désintégration radioactive et la mi-temps du 64 radionucléide Cu à 12,7 h. Pour la normalisation de l'image, choisir une image (A) comme référence et régler l'intensité de l'affichage de l'image dans le logiciel d'analyse d'image respective.
    1. En utilisant les valeurs simplement fixés pour l'image de référence (A), l'activité injectée (A) et de l'activité injectée pour les autres images (X), normaliser les autres images à l'aide de l'équation suivante: (activité injectée (X) / activité injectée ( A)) x valeurs d'intensité (A).
  4. Dessiner volumes 3D d'intérêt (VOI) du signal de PET normalisée des ganglions pulmonaires et périthymique.
  5. Déterminer la dose injectée en pourcentage par cm 3 (% ID / cm 3) en utilisant l'équation suivante: (moyenne activité en VOI / activité globale chez la souris) x 100. Pour d'autres orientations concernant l' analyse d'image, voir les références 22, 23.

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Résultats

La figure 1 résume le marquage des cellules Cova-TH1 avec le 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb et la conception expérimentale pour l'in vitro et in vivo traitées dans ce protocole.

figure-results-1
Figure 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb étiquetage Process & Experimental design. (A) Représentati...

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Discussion

Ce protocole présente une méthode fiable et facile à radiomarquer de manière stable des cellules pour le suivi in vivo par TEP. En utilisant cette méthode, les cellules Cova-TH1, isolé et élargi in vitro à partir de souris donneuses, pourrait être radiomarqués avec 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb et leur prise d' origine a été suivi pour les ganglions pulmonaires et périthymique en tant que sites de présentation dans une Cova Cova induite par DTHR des voies aériennes aiguës.

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Les auteurs remercient le Dr Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant ainsi que Natalie Altmeyer pour le soutien lors de l'analyse des expériences et des données. Ce travail a été soutenu par Werner Siemens-Fondation, la DFG par le SFB685 (projet B6) et FORTUNE (2309-0-0).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
HCl, SuprapurMerck, Darmstadt, Allemagne1.0031864Cu
production Méthanol, SuprapurMerck, Darmstadt, Allemagne1.0600764Cu
production Isopropanol, SuprapurMerck, Darmstadt, Allemagne1.010464Cu production
Pt/Ir (90/10) plaqueÖ ; gussaCustom made64Cu production
Chambre PEEKWKLCustom made64Cu production
64NiChemotrade64Cu
production Polygramme SIL G/UV 254 plaqueMacherey-Nagel80502164Cu
production Échange d’ions colonneBioRadAG1-X864Cu
production Système de cible à semi-conducteurs pour la production PETtraceWKLcostum made64Cu production
64Cu module de travailWKLcostum made64Cu
production Calibrateur de doseCapintecCRC-25R
PETtrace cyclotronGeneral Electric Medical Systems
DOTA-NHSMacrocycliquesB-280Immuno-conjugaison DOTA
Anti-cOVA-TCR (KJ1-26)Isolé de la culture cellulaire d’hybridomeConjugaison DOTA
Na2HPO4Sigma-Aldrich71633DOTA-conjugaison
H+ Chelex 100Sigma-AldrichC7901
filtration Amicon Ultra-15Merck MilliporeUFC910008Conjugaison DOTA
Eau ultrapure RotipuranCarlRoth HN68.3Conjugaison DOTA
Acétate d’ammoniumSigma-Aldrich32301Conjugaison DOTA
Université deTübingenConjugaison DOTA
Micro Bio-spin Colonne P-6Laboratoires Bio-Rad7326221DOTA-conjugaison
Citrate de sodiumSigma-Aldrich71497DOTA-conjugaison
Cyclone Plus PhosphorImager  ;Perkin-ElmerL2250116, conjugaison DOTA,
Merck Millipore102568ingrédient pour le milieu des lymphocytes T.
FCSMerck MilliporeS0115/1004Bingrédient pour milieu cellulaire T  ;
Pyruvate de sodiumMerck MilliporeL0473ingrédient pour milieu de cellules T  ;
Acides aminés MEMMerck MilliporeK0293ingrédient pour milieu de cellules T  ;
HEPES  ;Merck MilliporeL 1613ingrédient pour milieu de cellules T  ;
  ; Pénicilline/StreptomycineMerck MilliporeA2212ingrédient pour milieu cellulaire T  ;
0,05 mM 2-&beta ;-mercaptoéthanolSigma-AldrichM3148ingrédient pour milieu de cellules T  ;
DO11.10souris élevage maisonculture cellulaire TH1
DPBSGibco14190144TH1 culture cellulaire
Passoire 40 µ ; m  ;Corning352340TH1 culture cellulaire
ACK Lysing BufferLonza10-548ETH1 culture cellulaire
CD4 Microbilles, sourisMiltenyi Biotech130-097-145TH1 culture cellulaire Séparateur
QuadroMACSMiltenyi Biotech130-090-976TH1 culture cellulaire
LS colonneMiltenyi Biotech130-042-401TH1 culture cellulaire
anticorps anti-CD4 (Gk1.5)Isolé à partir d’une culture cellulaire d’hybridomeCulture cellulaire TH1
Anticorps anti-CD8 (5367.2)Isolé d’une culture cellulaire d’hybridomeCulture cellulaire TH1
Anticorps anti-rat (MAR18.5)Isolé d’une culture cellulaire d’hybridomeCulture cellulaire TH1
Complément de lapin MAtebu-BioCL3221TH1 culture cellulaire
Anti-IL-4 anticorps (11B11)Isolé à partir d’une culture cellulaire d’hybridomeCulture cellulaire TH1
cOVA 323-339-peptide  ;Micro-collections CEMCommande sur mesureCulture cellulaire TH1
CPG1668-oligonucléotidesEurofins MWG OperonCommande sur mesureCulture cellulaire TH1 IL-2
Novartis65483-116-07Culture cellulaire TH1
Plaques à 96 puitsGreiner  ;655180TH1 culture cellulaire 24
plaquesGreiner  ;662160TH1
Fiole de culture cellulaireGreiner  ;660175Plaques de culture cellulaire TH1
à 48 puitsGreiner  ;677 180étiquetage de cellules
Gammacell 1000Best Theratronicsvia enquête  ;
Gulmay RT225Gulmayvia enquête  ;
Trypan blueMerck MilliporeL6323in vitro évaluation
Souris IFN-&gamma ; ELISABD Biosciences558258in vitro évaluation
PE Annexine V Kit de détection de l’apoptose  ;BD Biosciences559763in vitro évaluation
Tube 5 mLSarstedt55.476in vitro évaluation
Tubes à fond rond  ;BD Biosciences352008in vitro
évaluation Assistant &gamma ;-compteurPerkin-Elmer2480-0010in vitro évaluation
ELISA Lecteur MultiscanEXThermo Fisher Scientific51118177in vitro évaluation
MicroscopeLeicavia enquête  ;in vitro évaluation
BD LSRII  ;BD Biosciencesvia enquête  ;in vitroévaluation
souris BALB/cCharles River028in vivo trafic cellulaire
Gel d’aluminiumServa Électrophorèse12261.01in vivo trafic cellulaire
XylazineBayer HealthCareCommandé via Hôpital universitairein vivo trafic cellulaire
KétamineRatiopharmCommandé via Hôpital universitairein vivo trafic cellulaire
IsofluraneCP-PharmaCommandé via University hospitalin vivo trafic cellulaire
30 G aiguilleBD Biosciences304000in vivo trafic cellulaire
SeringueBD Biosciences11612491in vivo Trafic cellulaire
Capillaires 10 µ ; LVWR612-2439
Inveon PET scannerSiemens Healthineersn’est plus disponiblein vivo trafic cellulaire, sociétés alternatives : Bruker, Mediso  ;
Scanner Inveon SPECT/CTSiemens Healthineersn’est plus disponiblein vivo trafic cellulaire
Inveon Research WorkplaceSiemens Healthineersanalyse d’images, logiciel alternatif : Pmod
Unité de à conjugaison DOTA DMEM

Références

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