Article de méthode

Évaluation de l'incidence des produits chimiques sur l'environnement Miel de développement Abeille de l'individu à la colonie Niveau

DOI :

10.3791/55296

⸱

1 avril 2017

 ,  , 
1Department of Biotechnology and Animal Science, National Ilan University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un procédé pour alimenter des aliments contaminés par les pesticides à la fois une abeille individuelle et une colonie ruche. La procédure évalue l'effet des pesticides sur les abeilles individuelles par l' alimentation in vivo de l' alimentation des larves de base et sur la condition naturelle de la colonie de ruche.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La présence de pesticides dans l’environnement apicole est l’un des problèmes les plus graves qui impactent la vie d’une abeille mellifère. Les pesticides peuvent être rapportés à la ruche après que les abeilles ont butiné sur les fleurs qui ont été pulvérisées avec des pesticides. Les aliments contaminés par les pesticides peuvent être échangés entre les ouvrières, qui nourrissent ensuite les larves, ce qui peut potentiellement affecter le développement des abeilles mellifères. Ainsi, les pesticides résiduels dans l’environnement peuvent devenir un facteur de dommages chroniques pour les populations d’abeilles mellifères et conduire progressivement à l’effondrement des colonies. Dans le protocole présenté, les méthodes d’alimentation des abeilles mellifères sont décrites et appliquées soit à une abeille mellifère individuelle, soit à une colonie. Ici, le régulateur de croissance des insectes (IGR) pyriproxyfène (PPN), qui est largement utilisé pour lutter contre les insectes nuisibles et est nuisible au développement des larves et des pupes d’abeilles mellifères, est utilisé comme pesticide. La procédure de présentation peut être appliquée à d’autres produits chimiques potentiellement nocifs ou à des agents pathogènes des abeilles pour des études plus approfondies.

Introduction

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La présence de pesticides dans l'environnement est l' un des problèmes les plus graves qui influe sur la vie d'une abeille 1, 2, 3. Plusieurs études ont démontré la présence commune des résidus de pesticides dans les colonies d'abeilles et les produits apicoles. A Taiwan, l'application moyenne des pesticides était 11-12 kg / ha chaque année (de 2005 à 2013). La quantité de pesticides utilisés à Taiwan est supérieure à celle des pays de l' UE, et les pays d' Amérique latine 4, 5. En d'autres termes, l'environnement apicole souffre de stress grave des pesticides, en particulier à Taiwan et peut-être dans d'autres pays.

L'abeille Apis mellifera est l' un des principaux insectes pollinisateurs dans les systèmes agricoles 6 et elle produit également des produits de valeur tels que le miel. Cependant, les abeilles sont Exposed à divers pesticides et ces pesticides peut être ramené à la recherche de nourriture après ruchers sur les fleurs qui ont été traitées avec des pesticides lors de la collecte nectar et de pollen 7, 8. Ils peuvent également être exposés aux pesticides par les apiculteurs eux - mêmes visant à contrôler les problèmes de ravageurs à l' intérieur des ruches 9, 10, 11. Parce que les larves d'abeilles sont alimentés par les abeilles nourrices pour leur développement, les larves, les drones et même la reine peut être exposé à ces nectars contaminées par les pesticides et le pollen 12. La toxicité des différents pesticides pour les abeilles doit être adressée 13.

De nombreux efforts ont été faits pour évaluer les problèmes de résidus de pesticides sur l'environnement. Yang et al. testé l'influence de l'insecticide imidaclopride neurotoxiques sur le développement des larves d'abeilles dans leruche et a rapporté qu'une dose sublétale de imidaclopride a donné lieu à un comportement associatif olfactif des abeilles adultes 14. En outre, Urlacher et al. a examiné les effets sublétaux d'un pesticide organophosphoré, chlorpyrifos, sur la performance de l' apprentissage d'un travailleur d'abeille de miel dans des conditions de laboratoire 15. Dans notre étude précédente, nous avons évalué l'impact d'un régulateur de croissance des insectes (IGR), pyriproxyfène (PPN), sur les abeilles larves 16.

Dans cet article, nous présentons les méthodes d'évaluation des impacts chimiques sur le développement des abeilles. méthodes d'alimentation des abeilles au miel ont été décrits et appliqués soit à abeilles domestiques individuels ou à une colonie. Dans un premier temps , nous avons testé différentes concentrations de l' alimentation des larves de base contaminées par des pesticides (BLD) sur les larves dans les colonies pour évaluer l'impact des pesticides sur les abeilles individuelles in vivo. Nous avons ensuite simuler le Condit natureldes ions du pesticide à l'aide de sirop contaminées par des pesticides à l'intérieur des ruches. Dans cette méthode, PPN, qui est largement utilisé contre les insectes nuisibles 17 et est nocif pour le développement des larves d'abeilles et pupes 16, 18, 19, sera un indicateur pour représenter l'effet négatif du pesticide sur le terrain.

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Protocole

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1. Préparation

  1. Faire 1 L de 50% de sirop de sucre. Dissoudre 1 kg de saccharose dans 1 L ddH 2 O.
  2. Préparer la solution pyriproxyfène (PPN) dans BLD. Faire 1,1 L de 10 000 ppm solution PPN de stock et une solution diluée à 100 ml PPN dans 1 litre stérilisé ddH 2 O. Conserver à 4 ° C.
  3. Diluer la solution mère PPN à des concentrations finales de 0,1, 1, 10 et 100 mg / kg (ppm) dans le BLD pour l'expérience suivante.
  4. Faire PPN-sirop (pour le niveau de la colonie). Diluer le stock PPN à des concentrations finales de 10 et 100 ppm à 50% de sirop de sucre pour l'expérience suivante.
  5. Miel élevage des abeilles.
    Note: Ici, l'emplacement expérimental est le rucher Université nationale Ilan (NIU), Ville Yi-Lan, Taiwan; (Coordonnées GPS: N24.747278, E121.746200).
    1. Vérifiez abeille (Apis mellifera L.) colonies par semaine pour la quantité de nourriture et d' alimentation avec 1 litre 50% de sirop de sucre si nécessaire (la zone de stockage de miel est vide). Définir un environnement saincolonie 9 cadres de peignes d'abeilles dans chaque colonie avec une reine pondre des œufs normalement.
  6. Préparer 100 ml de l'alimentation des larves de base (BLD). Dissoudre 6% de D-glucose, 6% de fructose et 1% d' extrait de levure dans de l' eau désionisée distillée stérilisée (ddH 2 O) et de compléter avec 50% de la gelée royale. Conserver à 4 ° C mais pas pendant plus de 3 jours.
    Note: Pré-chaud à 35 ° C avant l'expérience et l'utilisation dans les 3 jours.

2. méthode in vivo alimentation

Remarque: In vivo mode d'alimentation a été modifié depuis Hanley et al. 20

  1. Abeille de sélection de larves et d' étiquetage.
    1. Insérez un à reine pour diviser 9 cadres d'une colonie saine en 4 cadres et 5 cadres tout en limitant la reine à la section 4 du cadre. Laisser au moins une trame vide dans la section 4 de trame pour pondre des œufs.
    2. Après la reine pondre des œufs pour 1 jour, Vérifiez les cadres de l'apparition d'œufs et de garder les œufs à l' intérieur des ruches d' abeilles pendant 72 h (le 4 e jour) jusqu'au 1 jour ancienne éclosion des larves. Prenez l'un des cadres contenant vieux 1 jour larves d'ouvrières (éclos dans les 24 h) hors de la ruche d'essai à la main et enlever les travailleurs d'abeilles du cadre avec une brosse d'abeille.
    3. Couvrir le cadre avec une lame transparente (taille = longueur x largeur x épaisseur = 29,7 mm x 21 mm x 0,1 mm) et clouer la lame transparente sur le bord de trames avec des punaises (figure 1A).
    4. Pour chaque traitement, sélectionner de manière aléatoire 50 un jour, des larves âgées (4 ème jour) et marquer chaque cellule de couvain en utilisant des marqueurs permanents sur la lame transparente (figures 1A et 1B).
      Note: Écrivez les informations de chaque traitement sur le cadre et lame transparente et en utilisant des marqueurs permanents pour éviter la confusion entre les différents traitements. Retirez les diapositives marquées et garder pour in vivo </ Em> l'alimentation et de l'observation.
  2. Dans l' alimentation vivo.
    1. Ajouter différentes concentrations de PPN-BLD (0,1, 1, 10 et 100 ppm) à chaque cellule de couvain marqué par pipetage au jour 1, 2 et 3 avec 10 pi, 10 pi et 20 pi, respectivement, en fonction de la quantité d'admission du âge larves. Ajouter la même quantité de BLD (pas PPN) à un groupe témoin. De ce fait, la dose totale de PPN-BLD dans chaque cellule de couvain marqué accumule à 4, 40, 400 et 4000 pg.
      REMARQUE: reconnaître les cellules de couvain marquées par les lames transparentes marquées et retirer les lames transparentes marquées après le repas. Utilisation fraîche BLD d'alimentation pour empêcher le nettoyage des cellules de couvain par les abeilles ouvrières.
    2. Remettre les cadres traités PPN aux colonies d'origine pour d'autres observations.
      REMARQUE: Chaque traitement a quatre répétitions biologiques dans quatre colonies.
  3. Observation des larves traitées au jour 7.
    1. Pour observer ee larves PPN-traitées, retourner les diapositives transparentes marquées aux cadres pour enregistrer la mortalité et les taux de capsulage dans les cellules de couvain marquées.
  4. Observation des taux de pupes et Eclosion traités au jour 13.
    1. Retirer la cire d'abeille de couvain operculé.
    2. Mettez la pince à épiler douce déversée dans les cellules couvain et serrer les chrysalides très légèrement puis prendre pupes doucement.
    3. Transférer les pupes dans des plaques de culture tissulaire à 24 puits avec une double couche de tissus de laboratoire sous chaque puits. Notez les dommages et la mortalité pendant le transfert chrysalide.
    4. Maintenir l'humidité relative dans un incubateur à 34 ° C des plaques de culture tissulaire à 24 puits et de 70% jusqu'à l' émergence (environ 8 jours).
    5. Observer et enregistrer les chrysalides et les abeilles ont émergé.
  5. Statistiques
    1. Calculer les données enregistrées et présente en moyenne ± écart-type
    2. Analyser les données en utilisant une analyse de variance (Anova) par SAS et utiliser le moins significatif essai différence (LSD) pour analyser les différences entre les deux modes de traitements différents. Définir statistiquement significative comme valeur p <0,05. Des lettres différentes dans la même colonne du tableau montre un effet significatif par l'analyse statistique.

3. Toxicité des PPN à la Colonie Niveau en Ruche

  1. Mettre en place les groupes d'abeilles.
    1. Insérer une grille à reine verticalement pour diviser 9 trames d'une colonie saine en 4 trames (partie A) et de 5 images (partie B) tout en limitant la reine de la section 4 du cadre. Laisser au moins une trame vide dans la section 4-trame pour pondre des œufs.
      Remarque: En d'autres à reine le au-dessus de la partie reine pour empêcher la reine de se déplacer entre les parties.
    2. Après la reine pondre des œufs pour 1 jour, vérifiez les cadres de l'apparition des œufs. Prenez les cadres appropriés contenant des oeufs à partir de la partie A à la main et enlever les travailleurs d'abeillesà partir de la trame avec une brosse d'abeille.
    3. Couvrir le cadre avec lame transparente et clouer la lame transparente sur le bord du cadre avec des punaises.
    4. sélectionner de façon aléatoire 100 cellules de couvain contenant des oeufs et marquer chaque cellule de couvain en utilisant un marqueur permanent sur la lame transparente. Affecter ces 100 cellules de couvain comme groupe 1. écrire les informations de chaque traitement sur le châssis et lame transparente en utilisant un marqueur permanent pour éviter la confusion entre les différents traitements.
    5. Remettez le cadre marqué à la partie A pendant 3 jours, puis transférer la reine à la partie B pour pondre leurs œufs.
    6. Après 1 jour, vérifiez les cadres de la partie B, choisir un cadre approprié et l'étiquette 100 cellules de couvain contenant des oeufs comme décrit à l'étape 3.1.4. Affecter ces 100 cellules de couvain Groupe 2.
    7. Remettez le cadre marqué à la partie B pendant 3 jours, puis transférer la reine à la partie A à pondre des œufs.
    8. Répétez la reine échange entre la partie A et partie B 6 fois plus et assigner numériquement les groupes,respectivement (Figure 2). Il devrait y avoir au total 9 groupes.
  2. T rande colonie d'abeilles avec du sirop de sucre PPN au jour 13 (Figure 2).
    1. Ajouter 1 L 50% de sirop de sucre PPN contenant 10 ou 100 ppm dans une boîte d'alimentation d'abeille en matière plastique (W x L x H = 20 cm x 30 cm x 3,5 cm) et de mettre la boîte au-dessus des cadres dans les colonies expérimentales.
      Nota: Le groupe 1 ne reçoit pas le PPN à 13 jours que les cellules de couvain ont été scellées.
    2. Alimenter le groupe de contrôle avec 1 L 50% de sirop de sucre (pas d'PPN) tel que décrit à l'étape 2.2.
  3. Compter une larve d'un jour et enregistrer le taux d' éclosion des oeufs de 100 cellules de couvain marqués pour chaque groupe au jour 5 (Figure 2). œufs d'abeilles miel prennent habituellement 3 jours pour éclore en larves de 0 jour; Par conséquent, vérifier et étiqueter 100 œufs contenant des cellules de couvain au jour 1 et compter le nombre de larves âgées de jour 1 pour chaque groupe au jour 5 pour obtenir le pourcentage de taux d'éclosion.
  4. Contant les cellules operculées et enregistrer que le taux de recouvrement de 100 larves de cellules de couvain marqués pour chaque groupe au jour 11 (Figure 2). 6 à 7 jours vieux couvain larves seront coiffées avec de la cire d'abeille par les travailleurs d'abeilles pour nymphose des larves.
  5. Observer la maturation des nymphes et enregistrer le taux d'éclosion de 100 cellules de couvain marqués pour chaque groupe au jour 17 (Figure 2).
    1. Retirer la cire d'abeille de couvain operculé et prendre chrysalides avec une pince à épiler pointe douce doucement. Transférer les pupes dans une des plaques de culture tissulaire à 24 puits avec une double couche de tissus de laboratoire sous chaque puits.
    2. Garder les plaques de culture tissulaire à 24 puits dans un incubateur à 34 ° C et 70% d'humidité relative jusqu'à l'émergence.
    3. Observer et enregistrer les chrysalides et a émergé abeilles pour chaque groupe jusqu'à ce que le groupe 9 (49 jours expérimentaux).
      Remarque: Chaque traitement a quatre répétitions biologiques.
  6. Statistiques
    1. Calculer les données enregistrées et présent sous forme de la moyenne± SD.
    2. Analyser les différences significatives entre les paires de traitements (par exemple , 0 ppm / 10 ppm, 10 ppm / 100 ppm et de 0 ppm / 100 ppm) dans chaque groupe à l'aide de deux t bilatéral de -test de l'élève. Définir comme statistiquement significative si P -value <0,05.

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Résultats

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Pour l'essai sur le terrain de l'abeille, une reine était limitée à la section 4 cadre pour la ponte des œufs. Cette étape pourrait augmenter la densité de géniteurs dans un cadre et faciliter les observations suivantes. Chaque traitement a été marqué, et le développement des abeilles a été clairement observée à travers une lame transparente. Dans l' alimentation in vivo de PPN-BLD aux larves d'abeilles dans la ruche a été réalisée pour évaluer avec précision l'influenc...

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Discussion

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La méthode de ponte reine limitée et la méthode queen-échange sont des étapes essentielles pour la mise en place des groupes d'abeilles de miel pour les essais sur le terrain dans ce protocole. La méthode de ponte reine limitée permet la synchronisation du cycle de vie des abeilles. Par conséquent, les chercheurs peuvent choisir 1 jour larves âgées du même âge pour le traitement avec différentes doses de pesticides. Pour la méthode queen-échange, la reine a été échangée entre la partie A (4 cadres) et B (5 trames) p...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu'ils ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été soutenue par Grant 105AS-13.2.3-BQ-B1 du Bureau de santé animale et végétale inspection et de quarantaine, le Conseil de l'agriculture, Yuan exécutif et Grant 103-2313-B-197-002-MY3 du ministère de la science et de la technologie (MOST).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Boîte à abeillesSAN-YI Honey FactoryW1266Éleveur d’abeilles
Exclusion de reine (entre les cadres)SAN-YI Honey FactoryI1575Limitation de la reine  ;
Grille de grand lit (sur le dessus)SAN-YI Honey FactoryI1566Limitation de la reine sur le dessus  ;
Brosse à abeillesSAN-YI Honey Factory, TaiwanW1414nettoyez doucement les abeilles sur le cadre
Mangeoire à abeillesSAN-YI Honey Factory, TaiwanP0219donnez du sirop de sucre à la colonie
Lame transparenteWan-Shih-Chei, Taiwan (http://www.mbsc.com.tw/a01goods.asp?s_id=40)1139Marquez la zone larvaire sur les cadres (Matériel : Polyéthylène téréphtalate, PET) (Taille = Longueur*Largeur*épaisseur = 29,7 mm * 21 mm * 0,1 mm)
Plaque de culture de tissu 24 puitsGuangzhou Jet Bio-Filtration Co., LtdTCP011024Élevage de pupes à partir de l’extraction
AutoclaveTomin medical equipmenco., LTD.TM-321Fabriquer de l’eau déminéralisée distillée stérilisée (ddH2O)
P20 pipetmanGilsonF123600Ajouter du PPN dans le bassin alimentaire des larves d’abeilles
Incubateur  ;Yihder Co., Ltd.LE-550RDÉlevage de pupes à partir de l’extraction
KimwipesCOW LUNG INSTRUMENT CO., LTDÉlevage de pupes à partir de l’extraction
Geléeroyale Université nationale Ilan (NIU)NIUPréparer un régime larvaire de base (BLD)
D-(+)-GlucoseSigmaG8270Préparer un régime larvaire de base (BLD)
D-(-)-FructoseSigmaF0127Préparer un régime larvaire de base ( BLD)
Extrait de levureCONDA, pronadisa1702Faire un régime larvaire de base (BLD)
SaccharoseTaiwan E01071010Fabriquer du sirop de sucre pour l’alimentation des abeilles
Pyriproxyfène (11 %)LIH-NUNG CHEMICAL CO.. LTD.N° d’enregistrement 1937Régulateur de croissance des insectes (IGR) utilisé dans l’expérience
KCS34155

Références

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Mots-clés

Exposition aux pesticidestraitement au pyriproxyf nem thode d alimentation de la colonieanalyse du stade larvairetechnique de manipulation des nymphesmesure du taux d closiontraitement des cellules de couvaintests de produits chimiques environnementauxvaluation des colonies d abeilles mellif res

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