Méthodes pour l'étude épithéliale Transport Fonction Protein et expression dans Natif Intestin et Caco-2 cellules cultivées en 3D

Summary

Nous décrivons des méthodes simples pour étudier la régulation du transporteur de la sérotonine intestinale fonction (SERT) et d' expression en utilisant un modèle in vitro de cellules de culture de cellules Caco-2 cultivées en 3D et un modèle ex vivo de l' intestin de souris. Ces méthodes sont applicables à l'étude d'autres transporteurs épithéliaux.

Abstract

L'épithélium intestinal a des fonctions de transport et de barrières importantes qui jouent un rôle clé dans les fonctions physiologiques normales de l'organisme tout en assurant une barrière à particules étrangères. transports épithéliale avec facultés affaiblies (ions, nutriments, ou des médicaments) a été associé à de nombreuses maladies et peut avoir des conséquences qui vont au-delà des fonctions physiologiques normales des transporteurs, comme en influençant l'intégrité épithéliale et le microbiome intestinal. Comprendre la fonction et la régulation des protéines de transport est essentiel pour le développement d'interventions thérapeutiques améliorées. Le plus grand défi dans l'étude du transport épithélial développe un système modèle approprié qui récapitule les caractéristiques importantes des cellules épithéliales intestinales indigènes. Plusieurs modèles de culture in vitro de cellules, telles que les cellules Caco-2, T-84 et des cellules HT-29-Cl.19A sont généralement utilisés dans la recherche sur le transport epithelial. Ces lignées cellulaires représentent une approche réductionniste à la modélisation de l'epithelium et ont été utilisés dans de nombreuses études mécanistiques, y compris l'examen des interactions épithélium-microbienne. Cependant, les monocouches de cellules ne reflètent pas précisément les interactions cellule-cellule et le micro - environnement in vivo. Les cellules cultivées en 3D ont montré que modèles prometteurs pour les études médicaments de perméabilité. Nous montrons que les cellules Caco-2 en 3D peuvent être utilisées pour étudier les transporteurs épithéliaux. Il est également important que les études de cellules Caco-2 sont complétées par d'autres modèles pour exclure des effets spécifiques de cellules et de prendre en compte la complexité de l'intestin natif. Plusieurs méthodes ont déjà été utilisés pour évaluer la fonctionnalité des transporteurs, tels que le sac évasé et l'absorption dans les cellules épithéliales isolées ou isolées dans des vésicules de membrane plasmique. Prenant en considération les défis dans le domaine par rapport aux modèles et à la mesure de la fonction de transport, nous démontrons ici un protocole de croître cellules Caco-2 en 3D et décrire l'utilisation d'une chambre de Ussing commeapproche efficace pour mesurer le transport de la sérotonine, comme dans les épithéliums intestinales polarisées intactes.

Introduction

L'épithélium intestinal est équipé de diverses protéines de transport (canaux, les ATPases, les co-transporteurs et les échangeurs) qui réalisent de nombreuses fonctions allant de l'absorption des nutriments, des electrolytes, des médicaments et à la sécrétion de fluide et des ions dans la lumière. protéines de transport génèrent des gradients électrochimiques qui permettent le mouvement des ions ou des molécules d'une manière vectorielle. Ceci est réalisé par les distributions asymétriques des systèmes de transport dans les membranes apicales et basolatérales des cellules epitheliales polarisées. En outre, les jonctions serrées, qui longe les cellules ép....

Protocol

1. Etude de Intestinal Transpalette dans un système de culture 3D de Caco-2: Growing 3D Caco-2 Culture cellulaire sur une protéine mélange gélatineux

1. le facteur de croissance réduit décongeler mélange de protéines gélatineux sur de la glace pendant 8 h (ou O / N) à 4 ° C. Une fois décongelé, faire 1 ml ou 500 aliquotes uL pour utilisation ou conserver à -20 ° C pour une utilisation ultérieure.
2. Le jour de la culture, prérefroidir les plaques de culture (pour l'ARN et de protéines d'extraction) ou diapositives chambré (pour immunocoloration) sur la glace. Ajouter 30 pi de mélange de protéines gélatineuse à chaque puits d'une lame de hui....

Results

Immunocoloration en 3D Caco-2 kystes est représenté sur la figure 1. Une image représentative d'un plan XY montrant lumen bien délimitées dans le kyste 3D colorés avec phalloidin actine est représenté sur la figure 1A. Le côté tourné vers la lumière représente le côté apical. Les cellules épithéliales en culture dans un résultat de l'environnement 3D dans un phénotype épithélial robuste. Différents Caco-2 kystes le jour 12, lorsque l' actine et SERT ont .......

Discussion

Complètement différenciées monocouches Caco-2 cellules ont été largement utilisés en tant que monocouches epitheliales polarisées pour étudier le transport intestinal ^{10, 11, 12, 13, 14, 15.} Cependant, pour imiter l'organisation physiologique des cellules épithéliales de l'intestin, il y a eu un intérêt considérable .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x PBS	ATCC	ATCC® ; HTB&timide ; 37&commerce ;	Cellules
10x PBS	Carl Zeiss		Microsope pour l’imagerie confocale
3[H]-5-HT  ;	LabtekII	152453	Cellules de culture pour la microscopie
5-HT  ;	Gibco	70013-032	Pas une substance dangereuse
95 % O2- 5 % CO2	cylindre KPL	71-00-27	Pas une substance dangereuse
Agar (pour plaques Agar)	Fischer	BP151-100	Toxicité aiguë, Ora
Agar (pour électrode)	Sigma	G7126-1KG	Pas une substance dangereuse
Alexa Fluor Phalloidin	Sigma	C3867-1VL	Pas une substance dangereuse
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma	P6148-500G	Nocive en cas d’ingestion ou d’inhalation
CaCl2	LifeTechnologies	A12380	Pas une substance dangereuse
Caco-2 Cells	Sigma	A8806-5G	Pas une substance dangereuse
Lyse cellulaire Tampon	Fischer	BP337-100	Pas une substance dangereuse
Lames chaberées	Sigma	S5886-1KG	Pas une substance dangereuse
Collagène de type 1 Solution	Sigma	S8045-500G
Électrodes	Sigma	S-0876
EMEM	Gibco by Life Technologies	25200-056
Sérum de veau fœtal (FBS)	Corning	356234	Utilisé comme matrice extracellulaire
Fluoxetine	Qiagen	74104
Gentamicin	ATCC	30-2003 Milieu de	culture cellulaire
glycine	, Danvers, MA
Hepes  ;	Roche	11836145001
Indométacine	Gibco de Life Technologies	15070-063
K2HPO4	Gibco de Life Technologies	15710-064
KOH	Gibco de Life Technologies	15630-080
Acide L-ascorbique  ;	Gibco by Life Technologies	10082147
Compteur à scintillation liquide	Gibco par Life Technologies	70013--032
LSM710 Meta	Physiologic Instruments, San Diego, CA  ;	EM-CSYS-8
mannitol	, San Diego, CA  ;	P2304
	Matrigel Physiologic Instruments, San Diego, Californie	VCC MC8
MgCl2	Physiological Instruments, San Diego, Californie.	DM MC6
Pince multivoie tension/courant	Instruments physiologiques, San Diego, CA  ;	P2300
NaCl	Physiologic Instruments, San Diego, Californie	P2023-100
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP1423
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	S5886
Sérum de chèvre normal (NGS, 10 %)	Fisher Scientific, Hampton, NH	S233
Paraformaldéhyde (PFA)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	P288
Pen-Strp	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	C3881
Réactif de dosage des protéines	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	10420
Cocktail d’inhibiteurs de protéinase	MEDOX, Chicago, IL  ;	style G- 12300
RNA easy Mini kit	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	M4125
Module d’entrée d’électrode monocanal  ;	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A92902
Curseurs pour chambres à claquement	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	H9523
Phosphate de sodium (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	F132
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	T7039
TGF-&beta ; 1	Perkin-Elmer, Waltham, MA	NFT1167250UC
Triton X-100	Packard Instruments, Downers Grove, IL	B1600
Trypsine EDTA	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	221473
Tween-20	Bio Rad Laboratories, Hercules, CA	5000006
Chambre Ussing (chambre uniquement)	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	I7378
Ussing Chamber Systems	Sigma-Aldrich, St Louis, MO	A1296