Method Article

Plate-forme microfluidique avec multiplexée Détection électronique pour le suivi spatial des particules

DOI:

10.3791/55311

⸱

March 13th, 2017

 ,  , 
1School of Electrical and Computer Engineering, Georgia Institute of Technology, 2Institute of Electronics and Nanotechnology, Georgia Institute of Technology, 3Petit Institute for Bioengineering and Biosciences, Georgia Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous démontrons une plate-forme microfluidique avec un réseau d'électrodes de surface intégrée qui combine la détection d'impulsions résistif (SRP) avec la division accès multiple par code (CDMA), pour multiplexer la détection et le dimensionnement des particules en plusieurs canaux microfluidiques.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

traitement microfluidique d'échantillons biologiques implique généralement des manipulations différentielles de particules en suspension dans le cadre de divers champs de force afin de fractionner spatialement l'échantillon basée sur une propriété biologique d'intérêt. Pour la distribution spatiale résultante à utiliser comme l'indicateur de dosage, des dispositifs microfluidiques sont souvent soumis à une analyse microscopique nécessite une instrumentation complexe, avec un coût plus élevé et une portabilité réduite. Pour remédier à cette limitation, nous avons développé une technologie intégrée de détection électronique pour la détection multiplex de particules à différents emplacements sur une puce microfluidique. Notre technologie, appelée CODES microfluidiques, combine Pulse Resistive Sensing avec Code Division Multiple Access pour compresser 2D information spatiale en un signal électrique 1D. Dans cet article, nous présentons une démonstration pratique de la technologie CODES microfluidique pour détecter et les cellules cancéreuses en culture de taille répartie sur plusieurs canaux microfluidiques. Commevalidé par la microscopie à haute vitesse, notre technologie peut analyser avec précision les populations de cellules denses tout électronique sans la nécessité d'un instrument externe. En tant que tel, les CODES microfluidiques peuvent potentiellement permettre à des appareils à faible coût intégrés lab-on-a-chip qui sont bien adaptés pour l'analyse d'échantillons biologiques au point de soins.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Détection précise et l' analyse des particules biologiques tels que des cellules, des bactéries ou des virus en suspension dans un liquide est d' un grand intérêt pour une gamme d'applications 1, 2, 3. Eh bien appariés en taille, des dispositifs microfluidiques offrent des avantages uniques à cet effet tels que haute sensibilité, la manipulation de l' échantillon doux et microenvironnement bien contrôlée 4, 5, 6, 7. En outre, les dispositifs microfluidiques peuvent être conçus pour utiliser une combinaison de dynamique des fluides et des champs de force passive pour fractionner une population hétérogène de particules biologiques en fonction de diverses propriétés 8, 9, 10, 11, 12. Dans les dispositifs, la distribution des particules résultant peut être utilisé en tant que lecture, mais l'information spatiale est généralement accessible uniquement par microscopie, ce qui limite l'utilité pratique du dispositif microfluidique en l'attachant à une infrastructure de laboratoire. Par conséquent, un capteur intégré qui peut facilement rapporter la cartographie spatio-temporelle de particules, car ils sont manipulés sur un dispositif microfluidique, peut potentiellement permettre à un faible coût, des dispositifs intégrés de laboratoire sur une puce qui sont particulièrement attrayants pour les essais d'échantillons dans le mobile , les paramètres de ressources limitées.

Des électrodes à couches minces ont été utilisés comme des capteurs intégrés dans des dispositifs microfluidiques pour diverses applications , 13, 14. Pulse Resistive Sensing (RPS) est particulièrement intéressante pour la détection intégrée de petites particules dans les canaux microfluidiques car il offre un mécanisme de détection à haut débit robuste, sensible, et directement à partir de mesures électriques 15. Dans le SRP, la modulation de l'impédance entre une paire d'électrodes immergées dans un électrolyte, est utilisé comme moyen pour détecter une particule. Lorsque la particule passe à travers une ouverture, dimensionnée de l'ordre de la particule, le nombre et l'amplitude des impulsions transitoires dans le courant électrique sont utilisés pour compter et de particules de taille, respectivement. En outre, la géométrie du capteur peut être conçu avec une résolution de photolithographie pour former des formes d' ondes d'impulsions résistives en vue d'améliorer la sensibilité 16, 17, 18, 19 ou d'estimer la position verticale de particules dans des canaux microfluidiques 20.

Nous avons récemment mis en place une technologie de détection d' impulsion résistive multiplexé évolutive et simple appelé microfluidique Coded Orthogonal Détection par détection électrique (CODES microfluidiques) 21. CODES microfluidiques repose sur uneréseau interconnecté de capteurs d'impulsions résistif, chacun consistant en une matrice d'électrodes micro-usinés pour moduler la conduction d'une manière distinguable unique, de manière à permettre le multiplexage. Nous avons spécialement conçu chaque capteur pour produire des signaux électriques orthogonales similaires aux codes numériques utilisés dans la division de code d' accès multiple 22 (CDMA) des réseaux de télécommunication, de sorte que le signal individuel de capteur d'impulsion résistive peut être récupéré uniquement à partir d' une seule forme d' onde de sortie, même si des signaux de différents capteurs interfèrent. De cette façon, notre technologie comprime l'information spatiale 2D de particules en un signal électrique 1D, ce qui permet la surveillance des particules à différents endroits sur une puce microfluidique, tout en gardant à la fois la complexité du périphérique et du niveau du système à un minimum.

Dans cet article, nous présentons un protocole détaillé pour les méthodes expérimentales et informatiques nécessaires pour utiliser la technologie CODES microfluidique, ainsi que rrésultats epresentative de son utilisation dans l'analyse d'échantillons biologiques simulés. En utilisant les résultats d'un prototype d'appareil avec quatre capteurs multiplexés comme un exemple pour expliquer la technique, nous fournissons des protocoles sur (1) le processus de microfabrication pour créer des dispositifs microfluidiques avec la technologie microfluidique CODES, (2) la description du dispositif expérimental, y compris la matériels électroniques, optiques et fluidiques, (3) l'algorithme d'ordinateur pour décoder des signaux brouilleurs provenant de différents capteurs, et (4) les résultats de détection et d'analyse des cellules cancéreuses dans des canaux microfluidiques. Nous croyons que l'utilisation du protocole détaillé décrit ici, d'autres chercheurs peuvent appliquer notre technologie pour leur recherche.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Conception des électrodes de codage

Remarque: La figure 1a montre la structure 3-D des électrodes microélectrodes.

  1. Concevoir un ensemble de quatre 7 bits codes d' or pour coder les canaux microfluidiques 23.
    1. Construire deux registres à décalage de rétroaction linéaires (LFSR), chacun représentant un polynôme primitif.
    2. Utilisez les LFSR pour générer une paire préférée de 7 bits m séquences contenant.
    3. Décaler cycliquement la paire préférée de m séquences contenant et les ajouter dans le mod 2 pour générer quatre codes d'or distincts.
  2. Concevoir l'agencement des électrodes de codage (figure 1b).
    1. Placez trois bornes d'électrodes, ce qui représente les, négatifs, et des électrodes de référence positives à trois coins.
    2. Route électrode positive et négative des traces sur les côtés opposés de chaque canal microfluidique.
    3. Étendre les électrodes positives et négatives dans lades canaux microfluidiques comme les doigts d'électrodes, suivant le code de Gold affectée de façon unique (figure 1c).
    4. Placer l'électrode de référence entre les doigts d'électrodes positives et négatives.
    5. Placer des traces d'électrodes positives et négatives les plus extérieures éloignées des doigts d'électrode de référence afin de minimiser la conduction électrique à l'extérieur de la région codante.

2. microfabrication des électrodes de surface

Remarque: La figure 2b montre le procédé de fabrication d'électrodes de surface.

  1. Nettoyer une plaquette de verre borosilicate de 4 pouces dans une solution de piranha (acide sulfurique à 98%: 30% de peroxyde d'hydrogène = 5: 1) à 120 ° C pendant 20 min pour éliminer tous les contaminants organiques. Ensuite, placer la plaquette sur une plaque chaude à 200 ° C pendant 20 min pour éliminer l'eau résiduelle.
  2. Transférer la plaquette à un spinner. Distribuer 2 ml photorésist négatif sur la plaquette et tourner la plaquette à une vitesse de 3000 tours par minute pendant 40 s à revêtir uniformément la plaquette d'une couche de résine photosensible de 1,5 um.
  3. Placez la plaquette sur une plaque chaude à 150 ° C et cuire la résine photosensible filé pendant 1 min.
  4. Exposer la résine photosensible à 365 nm lumière UV (225 mJ / cm 2) à travers un masque de chrome en utilisant un aligneur de masque.
  5. Placez la plaquette sur une plaque chaude à 100 ° C et cuire la résine photosensible exposée pendant 1 min.
  6. Développer la résine photosensible en plongeant la plaquette dans un révélateur de résine photosensible (RD6) pendant 15 s. pulvérisez doucement (DI) de l'eau déminéralisée et laver la plaquette. Sec par soufflage d'azote comprimé.
  7. Placer la plaquette en résine photosensible à motifs dans un évaporateur métallique par faisceau d' électrons, et déposer une couche de chrome de 20 nm d'épaisseur, suivi d'un film d'or de 80 nm d'épaisseur sur la plaquette à une pression de base de 3 × 10 -6 Torr avec un taux de dépôt de 1 Å / s.
  8. Immerger la tranche dans l'acétone revêtue de métal dans un ensemble de bain à ultrasons à une fréquence de 40 kHz avec 100% d'amplitude pendant 30 min à la chambre humeurature pour graver la résine photosensible sous-jacente et terminer le processus de décollage.
  9. Couper la tranche en petits morceaux à l'aide d'une scie à découpage classique.

3. La fabrication du moule SU-8 pour les canaux microfluidiques

Remarque: La figure 2a montre le procédé de fabrication du moule pour les canaux micro - fluidiques.

  1. Nettoyer et cuire au four une plaquette de silicium de 4 pouces en utilisant la même procédure décrite au point 2.1.
  2. Transférer la plaquette à un spinner. Verser 4 mL résine photosensible sur la tranche. Enduire la plaquette avec résine photosensible.
    1. Faites tourner la plaquette à 500 rpm pendant 15 s.
    2. Faites tourner la plaquette à 1000 rpm pendant 15 s.
    3. Faites tourner la plaquette à 3000 rpm pendant 60 s pour obtenir une couche uniforme revêtu de résine photosensible épaisse de 15 um.
  3. Placez la face du wafer sur un cleanroom essuyez imbibé d'acétone et enlever la résine photosensible résiduelle de l'arrière et des bords de la plaquette.
  4. Transférer la plaquette sur un pl chaudmangé pour la cuisson douce. Tout d'abord, faire cuire la plaquette à 65 ° C pendant 1 min. Puis déplacer rapidement la plaquette à une plaque chauffante à 95 ° et cuire pendant 2 min.
  5. Exposer la résine photosensible à 365 nm de la lumière UV (180 mJ / cm2) à travers un masque de chrome en utilisant un aligneur de masque.
  6. Cuire la plaquette après exposition à 65 ° C pendant 1 min, puis à 95 ° C pendant 2 min.
  7. Immerger la plaquette dans le révélateur et agiter doucement le récipient pendant 3 min. Ensuite, rincer la tranche avec de l'alcool de l'isopropanol (IPA) et le sécher en soufflant de l'azote comprimé. Si un résidu de couleur blanche apparaît sur la tranche, le plonger dans le révélateur à nouveau et de développer pour plus de temps et sec.
  8. Cuire la galette sur une plaque chaude à 200 ° C pendant 30 minutes pour sécher complètement.
  9. Mesurer l'épaisseur de la résine photosensible à motif à l'aide d'un profilomètre à différents endroits à travers la plaquette pour assurer l'uniformité.
  10. Silaniser la plaque de moule en utilisant la technique de dépôt en phase vapeur. Ajouter 200 pi de trichlorosilane dans une boîte de Pétri et les placer dans un dessiccateur à vide ainsi que le moule plaquette SU-8 pour 8 h.

4. Assemblée de l'CODES microfluidique Dispositif

  1. Placez la tranche de silicium de 4 pouces avec le moule dans un diamètre boîte de Pétri de 150 mm, et le fixer en collant à partir de ses bords.
  2. Mélanger les huiles polydiméthylsiloxanes (PDMS) de pré-polymère et un agent de reticulation à un rapport de 10: 1, et 50 g de verser le mélange dans la boîte de Petri. Placer la boîte de Petri dans un dessicateur sous vide pour dégazer le mélange pendant 1 h, puis durcir dans un four à 65 ° C pendant au moins 4 h (figure 2A).
  3. Découpez la couche de PDMS durcie à l'aide d'un scalpel et le retirer de la tranche de moule à l'aide d'une pincette. La taille du dispositif de validation de principe est d'environ 20 mm x 7 mm. Puis percer des trous d'un diamètre de 1,5 mm à travers le PDMS pour l'entrée et la sortie du canal microfluidique en utilisant un poinçon de biopsie.
  4. Nettoyer le côté à motif de la partie PDMS en plaçant it sur un ruban adhésif-salle blanche.
  5. Nettoyer le substrat en verre avec des électrodes de surface en le rinçant avec de l'acétone, l'IPA, l'eau déminéralisée et séchage en utilisant de l'azote comprimé.
  6. Activer les surfaces des PDMS et le substrat de verre dans un plasma d'oxygène pendant 30 secondes avec le côté micro-usinage de chaque partie dirigée vers le haut dans un générateur de plasma radiofréquence fixée à 100 mW.
  7. Aligner le canal microfluidique PDMS avec des électrodes de surface sur le substrat en verre à l'aide d'un microscope optique et ensuite amener les deux surfaces de plasma activées en contact physique.
  8. Cuire le dispositif sur une plaque chaude à 70 ° C pendant 5 min, avec le côté de verre face à la plaque chauffante.
  9. Connecter les coussinets des électrodes avec des fils de contact par soudure.

5. Préparation de l'échantillon biologique Simulé

  1. La culture des cellules cancéreuses ovariennes humaines HeyA8 dans du RPMI 1640 supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine à 5% de CO 2 atmosphère à 37 ° Cjusqu'à ce qu'ils atteignent 80% de confluence.
  2. Aspirer le support du flacon de culture à l'aide d'une pipette en verre. Distribuer, puis une solution saline phosphate aspirée 1x tamponnée (PBS) pour laver les cellules.
  3. Incuber les cellules dans 2 ml de 0,05% (p / v) d'une solution de trypsine pendant 2 min à 37 ° C, la suspension des cellules adhérentes. Ensuite, ajouter 4 ml de milieux de culture pour neutraliser la trypsine.
  4. Centrifuger la suspension cellulaire à 100 x g pendant 5 minutes pour sédimenter les cellules dans un tube à essai. Ensuite, aspirer le surnageant complètement.
  5. Re-suspendre les cellules dans 1-2 ml 1x PBS par pipetage doucement monter et descendre à amas de cellules mécaniquement se dissocient.
  6. Dessinez une petite quantité de suspension cellulaire dans une pipette et compter le nombre de cellules en utilisant hémocytomètre.
  7. Diluer la suspension de cellules avec du PBS pour préparer un échantillon avec une concentration cellulaire finale de 10 5 -10 6 cellules / mL.

6. Exécution du CODES microfluidique périphérique

Note: Figurer 3 montre le montage expérimental.

  1. Placez l'appareil CODES microfluidique sur la scène d'un microscope optique.
  2. Appliquer une 400 kHz onde sinusoïdale à l'électrode de référence sur la puce en utilisant un générateur de fonction électronique.
  3. Connecter des électrodes de détection positive et négative à deux amplificateurs de trans-impédance indépendants pour convertir les signaux de courant de chacun des signaux de tension.
  4. Soustraire le signal de tension d'électrode de détection positive du signal de tension d'électrode de détection négative en utilisant un amplificateur de tension différentielle afin d'obtenir un signal bipolaire.
  5. Utilisez une caméra à grande vitesse pour le fonctionnement d'enregistrement optique de l'appareil à des fins de validation et de caractérisation.
  6. Conduisez la suspension cellulaire à travers le dispositif CODES microfluidiques à un débit constant (50-1000 ul / h) en utilisant une pompe à seringue.
  7. Mesurer le signal d'impédance de modulation en utilisant un amplificateur lock-in.
    1. Connectez le signal alternatif de référence à l'arbitreérence entrée de l'amplificateur de verrouillage. Connecter le signal bipolaire différentiel à l'amplificateur de verrouillage en tant que signal d'entrée.
    2. Obtenir l'amplitude quadratique moyenne du signal différentiel à partir de la sortie de l'amplificateur lock-in.
  8. Échantillonner le signal de sortie de l'amplificateur lock-in à 1 taux de MHz sur un ordinateur via une carte d'acquisition de données pour une analyse ultérieure.

7. Traitement des signaux du capteur

  1. Transfert des données électriques enregistrées dans MATLAB pour le post-traitement et de décodage.
  2. Filtrer le signal enregistré dans le domaine numérique en utilisant un filtre Butterworth (fonction intégrée dans MATLAB) pour éliminer le bruit haute fréquence (> 2,5 kHz).
  3. Générer une bibliothèque de code de modèle à partir des signaux de capteurs.
    1. Identifier les signaux de code ne se chevauchent pas représentatifs correspondant à chaque capteur dans le dispositif et extraire ces blocs de signal à partir du jeu de données en tant que vecteurs de forme d'onde distinctes.
    2. Normaliser chaque code onde template vecteurpar sa puissance. Utilisez le MATLAB fonction intégrée (bandpower) pour mesurer la puissance du signal.
    3. Utilisez la fonction MATLAB (resample) pour développer la bibliothèque de modèles en créant numériquement versions de signaux de code normalisées avec des durées variables pour tenir compte des variations de la vitesse d'écoulement de la cellule sur les électrodes.
  4. Identifier les blocs de signaux qui correspondent à capteur d'activité (seuil de SNR> 12 dB) dans la forme d'onde filtrée. Waveform avec SNR sous le seuil serait traité comme du bruit.
  5. Décode des blocs individuels de l' activité du capteur dans le signal enregistré en utilisant un algorithme itératif basé sur l'annulation d' interférences successives, une technique couramment utilisée dans les réseaux de communication CDMA multi-utilisateur 24, 25.
    1. Calculer la corrélation croisée de chaque bloc de signal avec tous les modèles de la bibliothèque en utilisant le produit scalaire de glissement.
    2. Identifier le modèle qui produit le largis pic d'auto-corrélation pour déterminer le signal de code individuel dominant du capteur. Enregistrer le temps et de l'amplitude du pic d'auto-corrélation.
    3. Construire un signal de code de capteur d'estimation par mise à l'échelle du modèle de code identifié sur la base mesurée autocorrélation amplitude crête et des informations de synchronisation (déterminée à l'étape 7.5.2).
    4. Soustraire le signal estimé de code de détection à partir des données d'origine.
    5. Itérer le procédé de 7.5.1, jusqu'à ce que le signal résiduel ne ressemble à aucun signal dans la bibliothèque de gabarits, mathématiquement défini comme le coefficient de corrélation est inférieur à 0,5.
  6. Affiner initiales estimations de signal du capteur de l'étape 7.5 en utilisant un processus d'optimisation.
    1. Reconstruire le signal en ajoutant des signaux de capteurs individuels estimés à partir de chaque itération.
    2. Balayer l'amplitude, la durée et le moment des signaux individuels de capteurs autour des estimations initiales pour produire le meilleur ajustement avec le signal électrique enregistrésur la base des moindres carrés Approximation 26.
  7. Convertir les amplitudes des signaux de capteurs estimés en taille de la cellule par l'étalonnage des signaux électriques contre des images optiques.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dispositif microfluidique CODES constitué de quatre capteurs répartis sur quatre canaux microfluidiques est représenté sur la figure 1b. Dans ce système, la section transversale de chaque canal microfluidique a été conçu pour être proche de la taille d'une cellule de telle sorte que (1) plusieurs cellules ne peuvent pas passer au-dessus des électrodes en parallèle et (2) les cellules restent proches des électrodes augmentant la sensibilité . Chaque capteur est conçu pour...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plusieurs capteurs d'impulsions résistives ont déjà été incorporés dans les puces microfluidiques 28, 29, 30, 31, 32. Dans ces systèmes, des capteurs d'impulsions résistives ont été soit non multiplexées 28, 29, 30, 31 ou bi...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par le prix n° de la National Science Foundation. ECCS 1610995. Les auteurs tiennent à remercier l’Institut d’électronique et de nanotechnologie et le personnel de l’Institut Parker H. Petit pour la bio-ingénierie et les biosciences pour leur soutien dans l’utilisation des installations partagées. Les auteurs tiennent également à remercier-Heng Chu pour son aide dans la préparation du manuscrit.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acide sulfurique à 98 %  ;   ;   ;BDH ChemicalsBDH3074-3.8LP
30 % Peroxyde d’hydrogène  ;   ;BDH ChemicalsBDH7690-3
TrichlorosilaneAldrich Chimie235725-100G
NR9-1500PY PhotoresistFuruttex
Resist Developer RD6Furuttex
AcetoneBDH ChemicalsBDH1101-4LP
SU-8 2015 PhotoresistMicrochemnégative SU8-2015
SU-8 DéveloppeurMicrochemY010200
Polydiméthylsiloxane (PDMS)Dow Corning3097358-1004Sylgard 184 Kit d’élastomère de silicone
Alcool isopropyliqueBDH Produits chimiquesBDH1133-4LP
RPMI 1640Corning Cellgro10-040-CV
Sérum de veau fœtal (FBS)Seradigm1500-050
Pénicilline-StreptomycineAmrescoK952-100ML
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Corning Cellgro21-040-CM
PHD 22/2000 Pompe à seringueHarvard Apparatus70-2001
HF2LI Lock-in AmplifierZurich Instrument
Amplificateur de courantZurich Instrument
Eclipse Microscope Ti-UNikon Corporation
DS-Fi2 Caméra couleur haute définition  ;Nikon Corporation
v7.3 Caméra haute vitessePhantom
PCIe-6361 Carte d’acquisition de données  ;National Instruments781050-01
BNC-2120 Bloc de connexion blindéNational Instruments777960-01  ;
PX-250 Système de traitement au plasmaNordson MARCH  ;
négative HF2TA

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