Évaluation de la localisation intracellulaire des espèces réactives de l’oxygène dans les spermatozoïdes de Solea Senegalensis

Résumé

Ce protocole décrit une méthodologie détaillée pour détecter H₂O₂ localisation au sein de spermatozoïdes Solea senegalensis en utilisant un fluorochrome sensible DHFC-DA ROS, une tache de mitochondries direct des mitochondries et DAPI pour les noyaux visualisation, respectivement. Le protocole est conçu pour être effectuée dans les 2 h avec spermatozoïdes fraîches ou décongelées.

Résumé

Le stress oxydatif est l’un des facteurs importants en diminuant la qualité du sperme. Élaboration de protocoles efficaces pour la détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) de spermatozoïdes est très important dans toutes les espèces, mais ces méthodes sont rarement utilisés et encore moins en téléostéen. Cryoconservation est une technique utile en aquaculture à des fins différentes, y compris les banques de gènes et garanti la disponibilité de sperme tout au long de l’année. Procédures de gel/dégel pourrait causer la production de ROS et endommagent les cellules de sperme. Étant donné que les éventuels dommages qu’un excès de production de ROS pourrait provoquer dans les spermatozoïdes selon leur localisation, ici une méthodologie détaillée pour détecter H₂O₂ et évaluer sa localisation intracellulaire par microscopie confocale est fourni. À cette fin, une combinaison des 3 fluorochromes (2′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacétate (DHFC-DA), une tache de mitochondries direct et 4′, dichlorhydrate de 6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI)) sont utilisées pour évaluer la co-localisation de H₂O₂ avec des noyaux de spermatozoïdes ou de mitochondries dans les échantillons de sperme de Solea senegalesis .

Introduction

La production d’espèces réactives de l’oxygène a été liée à la qualité du sperme récemment¹. Bien que la production de ROS dans les mitochondries peut être considéré comme un processus physiologique normal, le stress oxydatif par un excès de production de ROS est une cause évidente de dommages dans les spermatozoïdes à différents niveaux. Chez l’humain, le stress oxydatif est associé à l’infertilité masculine, altérant la motilité et la possibilité de subir une capacitation des²; chez les mammifères, changement d’intégrité de l’ADN dans les échantillons de sperme congelé a été également lié à la synthèse de H₂....

Protocole

NOTE : L’incubation Fluorochrome et confocale analyse prendra au moins 2-3 h pour un contrôle et un échantillon traité. Traitement des données n’est pas inclus dans ce calcul de temps. Matériel requis se trouvent dans la Table des matières. Ce protocole peut être appliqué aux spermatozoïdes frais ou cryopréservés. Solea senegalensis est une espèce de poisson qui se reproduit dans l’eau froide, travail toujours à froid (4-7 ° C). Voir la Figure 1 pour une vue d’ensemble du protocole.

1. travaux préparatoires avant l’expérience

1. Préparer un 1 mM mitochondries tachent solution en....

Résultats

Microscopie confocale est une méthode idéale pour l’évaluation de ROS intracellulaire dans le sperme chez les téléostéens. La combinaison des trois fluorochromes (DAPI, une tache de mitochondries et DHFC-DA) présentés dans cette étude (Figure 1) fournit de nombreuses informations utiles peuvent être appliquées dans la recherche fondamentale et pouvant avoir des applications dans l’amélioration des procédures utilisées dans plantes de l’aquaculture industriell.......

Discussion

Il est bien connu que les mitochondries sont des organites essentiels pour le fonctionnement et la motilité des spermatozoïdes. Ces organites sont simultanément directement impliqués dans la production de ROS. Fait intéressant, les niveaux contrôlées des BR sont nécessaires pour sperme bonne fonction¹. Des relations positives entre la fertilité et stress oxydatif ont été montrées dans les mammifères¹¹ , mais un taux excessif affecte sperme qualité¹²........

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2&prime ;,7&prime ;-Diacétate de dichlorodihydrofluorescéine (DCFH-DA)  ;	Sigma-Aldrich	D6883
4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)  ;	Sigma-Aldrich	D9542
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016  ;
Microscopie confocale	Zeiss	LSM800
Plaques de protection	Thermo Fisher Scientific	12-541B
DMSO, qualité analytique	Sigma-Aldrich	W387520
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
Méthanol, qualité analytique	Sigma-Aldrich	34860
MitoTrackerDeep Red  ;	Thermo Fisher Scientific	M22426
(réfrigérée)	Thermo Fisher Scientific	75002441
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653  ;
Neubauerchamber	Sigma-Aldrich	BR717810
lames	Thermo Fisher Scientific	10143562BEF

Microcentrifugeuse