Évaluation de la localisation intracellulaire des espèces réactives de l’oxygène dans les spermatozoïdes de Solea Senegalensis

Résumé

Ce protocole décrit une méthodologie détaillée pour détecter H₂O₂ localisation au sein de spermatozoïdes Solea senegalensis en utilisant un fluorochrome sensible DHFC-DA ROS, une tache de mitochondries direct des mitochondries et DAPI pour les noyaux visualisation, respectivement. Le protocole est conçu pour être effectuée dans les 2 h avec spermatozoïdes fraîches ou décongelées.

Résumé

Le stress oxydatif est l’un des facteurs importants en diminuant la qualité du sperme. Élaboration de protocoles efficaces pour la détection des espèces réactives de l’oxygène (ROS) de spermatozoïdes est très important dans toutes les espèces, mais ces méthodes sont rarement utilisés et encore moins en téléostéen. Cryoconservation est une technique utile en aquaculture à des fins différentes, y compris les banques de gènes et garanti la disponibilité de sperme tout au long de l’année. Procédures de gel/dégel pourrait causer la production de ROS et endommagent les cellules de sperme. Étant donné que les éventuels dommages qu’un excès de production de ROS pourrait provoquer dans les spermatozoïdes selon leur localisation, ici une méthodologie détaillée pour détecter H₂O₂ et évaluer sa localisation intracellulaire par microscopie confocale est fourni. À cette fin, une combinaison des 3 fluorochromes (2′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacétate (DHFC-DA), une tache de mitochondries direct et 4′, dichlorhydrate de 6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI)) sont utilisées pour évaluer la co-localisation de H₂O₂ avec des noyaux de spermatozoïdes ou de mitochondries dans les échantillons de sperme de Solea senegalesis .

Introduction

La production d’espèces réactives de l’oxygène a été liée à la qualité du sperme récemment¹. Bien que la production de ROS dans les mitochondries peut être considéré comme un processus physiologique normal, le stress oxydatif par un excès de production de ROS est une cause évidente de dommages dans les spermatozoïdes à différents niveaux. Chez l’humain, le stress oxydatif est associé à l’infertilité masculine, altérant la motilité et la possibilité de subir une capacitation des²; chez les mammifères, changement d’intégrité de l’ADN dans les échantillons de sperme congelé a été également lié à la synthèse de H₂O₂³.

Cryoconservation est une technique courante pour gène bancaire en aquaculture. Cette technologie est particulièrement importante chez les espèces avec des problèmes de reproduction telles que Solea senegalensis. Cette espèce précieuse sur le marché montre un dysfonctionnement reproductif chez les individus nés en captivité en raison du manque de parade nuptiale. Ce fait rend la cryoconservation du sperme nécessaire d’avoir la disponibilité de sperme pour la fécondation artificielle. Toutefois, la cryoconservation pourrait être une source de stress oxydatif qui pourrait être néfaste pour les spermatozoïdes⁴ car des études ont révélé un effet bénéfique de la supplémentation en antioxydants. Inhibition de ROS par antioxydant mitochondrial ciblée est aurait été bénéfique pour la cryoconservation de sperme dans le poisson-chat jaune⁵.

Par conséquent, les niveaux de ROS dans les échantillons de sperme sont importants de savoir, surtout après cryoconservation^6,7 , parce que ces molécules ont été reconnues comme un inconvénient pour la survie de sperme et fertilité⁸. En outre, étudier la distribution des ROS dans les cellules pourrait être crucial d’en déduire le niveau des dégâts potentiels. À titre d’exemple, on pouvait supposer des niveaux faibles de ROS dans les mitochondries normales et compatible avec la fonction spermatique, mais des niveaux élevés de ROS dans le noyau pourraient être indicateurs de dommages à l’ADN les spermatozoïdes. H₂O₂ est l’un des plus pertinents br qui pourraient être libérées de la mitochondrie et pénètrent le noyau parce que c’est une petite molécule sans frais⁹. Diacétate de dichlorofluorescéine (DHFC-DA) peut révéler spécifiquement intracellulaire peroxyde émettant une fluorescence verte. Dans cet article, un protocole détaillé pour détecter la localisation intracellulaire de H₂O₂ dans Solea senegalensis spermatozoïdes au microscope confocal est présenté.

Protocole

NOTE : L’incubation Fluorochrome et confocale analyse prendra au moins 2-3 h pour un contrôle et un échantillon traité. Traitement des données n’est pas inclus dans ce calcul de temps. Matériel requis se trouvent dans la Table des matières. Ce protocole peut être appliqué aux spermatozoïdes frais ou cryopréservés. Solea senegalensis est une espèce de poisson qui se reproduit dans l’eau froide, travail toujours à froid (4-7 ° C). Voir la Figure 1 pour une vue d’ensemble du protocole.

1. travaux préparatoires avant l’expérience

1. Préparer un 1 mM mitochondries tachent solution en qualité analytique DMSO.
2. Préparer un 4′ de 1 μg/mL, solution 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) dans l’eau désionisée.
3. Préparer une solution de Ringer mOsm/kg 200 (116 mM NaCl, KCl, 1,8 mM CaCl₂, 5 mM HEPES, pH = 7,7 2,9 mM)
4. Réaliser 4 mM 2′, 7′-dichlorodihydrofluorescein diacétate (DHFC-DA) solution dans du méthanol de qualité analytique.
   Remarque : Maintenez les solutions mères en aliquotes à-20 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
5. Définir la microcentrifugeuse à 4-7 ° C.

2. préparation avant Incubation Fluorochrome

Remarque : Une manipulation douce des spermatozoïdes est souhaitable lorsque pipetage et resuspendant.

1. Si vous travaillez avec des cellules cryoconservés, préparer un bain d’eau pour la décongélation à 40 ° C pour Solea senegalensis spermatozoïdes¹⁰. Immerger les échantillons de paille dans le bain d’eau pour 7 s.
2. Utiliser des ciseaux pour couper, vider l’échantillon dans un tube à centrifuger et centrifuger à 1000 g, 4-7 ° C pendant 1 min.
3. Retirer le plasma séminal ou le plasma séminal avec cryoprotecteurs l’échantillon cryopréservé de pipetage pour rejeter tout élément pouvant interférer avec le protocole de coloration.
4. Remettre en suspension les cellules dans le 50-100 μL de 4 ° C 200 mOsm/kg, une solution de Ringer.
5. Déterminer la concentration de spermatozoïdes avec un Neubauer ou une chambre de comptage similaire sous un microscope stéréoscopique.
6. Diluer la suspension cellulaire jusqu’à 1-2 x 10⁶ cellules/mL dans un volume final de 0,5 mL à 4 ° C, une solution de Ringer.

3. fluorochrome Incubation

Remarque : Les Fluorochromes doivent être manipulés en conditions de faible luminosité, surtout quand en solution.

1. Ajouter 3,125 μL de solution mère de DHFC-DA (concentration finale dans l’échantillon : 25 μM) à la dilution d’échantillon de travail. Incuber à 4-7 ° C pendant 40 min à l’obscurité¹⁰.
2. Après 30 min, ajouter 0,5 μL de la solution mère de DAPI (concentration finale dans l’échantillon : 2 μM) et 0,5 μL des mitochondries tacher la solution mère (concentration finale dans l’échantillon : 100 nM) à l’échantillon. Incuber les deux fluorochromes pendant 10 min dans l’obscurité.

4. préparation pour la microscopie confocale

1. Après la période d’incubation, centrifuger la suspension cellulaire à 1000 x g, 4-7 ° C pendant 1 min.
2. Éliminer le liquide surnageant avec soin par pipetage.
3. Ajouter un μL de 10-20 de 200 mOsm/kg de solution de Ringer.
4. Déposer 5 μl d’une suspension de cellules concentrées drop sur une diapositive.
5. Soigneusement, mettre une diapositive de couverture sur la préparation et scellez-la avec vernis. Une fois le vernis sec, la préparation est prête pour la microscopie confocale.

5. confocal Setup avant l’expérience

Remarque : Selon le microscope, DHFC-DA puisse « brûler ». Mettre en place les meilleures conditions auprès d’un échantillon sans valeur marchande tout d’abord.

1. Allumez le microscope, lasers, appareil photo et l’ordinateur qui exécute le microscope.
2. Définissez des lasers à excitation prenant en compte les taux d’excitation et d’émission maximaux de chaque fluorochrome :
   1. Pour DAPI, utilisez un maximum d’excitation de 358 nm et une émission maximale de 465 nm.
   2. Pour la tache mitochondriale, utilisez un maximum d’excitation de 644 nm et une émission maximale de 662 nm.
   3. Pour DHFC-DA, utilisez un maximum d’excitation de 504 nm et une émission maximale de 525 nm.
3. Commencer le travail avec 25 X, objectif de se concentrer sur les spermatozoïdes. Choisir le canal DAPI se concentrer car ce fluorochrome indique l’intensité la plus élevée. Une fois que les cellules sont concentrent, utiliser un objectif 63 X ou 100 X pour une évaluation approfondie parce que la taille des spermatozoïdes Solea senegalensis est autour de 2 μm.
4. Pour chaque canal, optimiser le sténopé, le gain et la tension. De la même manière, régler l’offset numérique afin de réduire le fond. Une fois que tous les paramètres sont optimisés pour le fluorochrome utilisé, enregistrer les paramètres. Pour une expérience de routine pour un seul spermatozoïde Solea senegalensis , nous avons utilisé les éléments suivants (ces paramètres peuvent changer pour chaque expérience) : trou d’épingle de 1 et la gain de tension de 750 V.

6. l’acquisition d’Images

1. Sélectionnez les conditions de la qualité voulue pour l’acquisition de l’image. Définissez les paramètres d’acquisition comme la profondeur de bits, format de l’image, l’épaisseur de la nappe de lumière, puis choisissez illumination face unique. Pour une expérience de routine pour un seul spermatozoïde Solea senegalensis , nous avons utilisé ce qui suit (ces paramètres peuvent changer pour chaque expérience) : cadre taille de 1024 px ; bits par pixel de 16 ans ; Vitesse de balayage de 2-4).
2. Ouvrir et centre de la zone de numérisation afin de commencer et prendre une image du champ.
3. À l’aide de l’outil de recadrage, sélectionnez la zone concernée, puis appuyez sur direct.
4. Avec l’aide de l’outil indicateur de gamme, régler l’offset numérique afin de réduire le fond. Procéder ainsi pour chaque canal et prendre l’image.
5. Vérifier la qualité des canaux individuels pour chaque fluorochrome et leurs combinaisons.

7. créer une Image 3D vidéo

1. Paramètres d’acquisition Z-pile.
   1. Choisissez l’option Z-pile dans le logiciel.
   2. Sélectionnez la cellule unique, groupe de cellules ou d’une région d’intérêt et le focus.
   3. Délimiter la Z-pile avec les options « Première tranche » et « Dernière tranche » et établir l’étape z à intervalle de 0,2 µm avec l’aide de la mise au point fine. Choisir DAPI canal se concentrer parce que ce fluorochrome peut indiquer l’intensité la plus élevée et vous pouvez facilement sélectionner la tête entière de spermatozoïdes. Sélectionnez les paramètres d’acquisition optimal pour chaque canal et exécutez l’expérience.
2. Exécuter l’expérience de Z-pile. Diviser les canaux et observer la localisation de chaque signal dans les cellules.
3. Processus de Z-pile.
   1. Rendu de volume : une fois l’expérience est terminée, sélectionnez les options du logiciel Z-pile traitement et choisir le volume rend option. Sélectionnez le nombre d’étapes et les degrés de rotation (360°). Enregistrez le fichier avec l’extension vidéo.
   2. Stéréo anaglyphe : choisissez stéréo anaglyphe dans les options de la fenêtre processus. Cet outil permet de créer une image 3D vidéo avec canaux de split.

Résultats

Microscopie confocale est une méthode idéale pour l’évaluation de ROS intracellulaire dans le sperme chez les téléostéens. La combinaison des trois fluorochromes (DAPI, une tache de mitochondries et DHFC-DA) présentés dans cette étude (Figure 1) fournit de nombreuses informations utiles peuvent être appliquées dans la recherche fondamentale et pouvant avoir des applications dans l’amélioration des procédures utilisées dans plantes de l’aquaculture industriell...

Discussion

Il est bien connu que les mitochondries sont des organites essentiels pour le fonctionnement et la motilité des spermatozoïdes. Ces organites sont simultanément directement impliqués dans la production de ROS. Fait intéressant, les niveaux contrôlées des BR sont nécessaires pour sperme bonne fonction¹. Des relations positives entre la fertilité et stress oxydatif ont été montrées dans les mammifères¹¹ , mais un taux excessif affecte sperme qualité¹²....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2&prime ;,7&prime ;-Diacétate de dichlorodihydrofluorescéine (DCFH-DA)  ;	Sigma-Aldrich	D6883
4&prime ;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)  ;	Sigma-Aldrich	D9542
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016  ;
Microscopie confocale	Zeiss	LSM800
Plaques de protection	Thermo Fisher Scientific	12-541B
DMSO, qualité analytique	Sigma-Aldrich	W387520
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
Méthanol, qualité analytique	Sigma-Aldrich	34860
MitoTrackerDeep Red  ;	Thermo Fisher Scientific	M22426
(réfrigérée)	Thermo Fisher Scientific	75002441
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653  ;
Neubauerchamber	Sigma-Aldrich	BR717810
lames	Thermo Fisher Scientific	10143562BEF

Microcentrifugeuse