Génération de fusions de protéines fluorescentes dans<em&gt; Candida</em&gt; espèces

Résumé

La modification du gène à médiation par PCR peut être utilisée pour générer des fusions de protéines fluorescentes dans des espèces de Candida, ce qui facilite la visualisation et la quantification des cellules de levure et les protéines. Ici, nous présentons une stratégie pour la construction d' une protéine de fusion fluorescente (ENO1-FP) dans Candida parapsilosis.

Résumé

Les espèces de Candida, colonisateurs répandues des voies intestinales et génito, sont la cause de la majorité des infections fongiques invasives chez les humains. Ainsi, les outils moléculaires et génétiques sont nécessaires pour faciliter l'étude de leurs mécanismes de pathogénicité. modification génique par PCR est une approche simple et rapide pour générer des protéines de marquage épitopique pour faciliter leur détection. En particulier, la protéine fluorescente (PF), les fusions sont des outils puissants qui permettent la visualisation et la quantification des deux cellules de levure et des protéines par microscopie à fluorescence et immunotransfert, respectivement. Les plasmides contenant des séquences codant pour la PF, ainsi que des gènes marqueurs nutritionnels qui facilitent la transformation des espèces de Candida, ont été produites à des fins de construction et d' expression dans la PF Candida. Ici, nous présentons une stratégie pour la construction d' une fusion FP dans une espèce de Candida. Les plasmides contenant l'antitache nourseothricinence gène marqueur de transformation (en NAT1) , ainsi que des séquences soit pour le vert, le jaune, ou la cerise vps (GFP, YFP, mCherry) sont utilisées conjointement avec des amorces qui comprennent des séquences spécifiques d' un gène dans une réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour générer une cassette FP . Cette cassette spécifique du gène a la possibilité d'intégrer dans l'extrémité 3 'du locus du gène correspondant par l'intermédiaire d'une recombinaison homologue. Réussi fusion en cadre de la séquence PF dans le locus du gène d'intérêt est contrôlée génétiquement, suivie d'une analyse de l'expression de la protéine de fusion par microscopie et / ou des méthodes d'immuno-détection. En outre, pour le cas des protéines hautement exprimés, des fusions avec succès peuvent être criblés principalement par les techniques d'imagerie par fluorescence.

Introduction

Les espèces de Candida sont des champignons commensaux qui colonisent le tractus intestinal et génito de tous les humains. Dans des conditions d'immunodéficience, telles que celle se produisent avec une naissance prématurée ou d' effets immunosuppresseurs de traitements pour le cancer, les espèces de Candida peuvent devenir pathogènes opportunistes. Parmi les espèces de Candida, Candida albicans est le colonisateur fongique la plus répandue et provoque la majorité des infections fongiques invasives. D' autres espèces de Candida telles que C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis et....

Protocole

1. Isoler Template Plasmides de E. coli

1. Cultiver E. coli contenant le plasmide de matrice pendant une nuit dans 10 ml de bouillon lysogénie (LB) + 200 mg / L d'ampicilline (AMP) à 37 ° C sous agitation.
2. Récolte des cellules par centrifugation à 6000 g pendant 2 min.
3. Décanter le liquide, isoler et purifier l' ADN de cellules de E. coli par un procédé standard tel que décrit précédemment dans Ausubel et al. ^8.
4. ADN remettre en suspension dans du Tris-EDTA (TE, Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0) à une concentration de travail de 50-100 ng / ml.

Résultats

A titre d'exemple, nous avons utilisé le protocole décrit ci - dessus pour construire GFP et mCherry fusions à ENO1 dans une souche de laboratoire de parapsilosis C.. Chaque transformant putatif a été initialement réensemencer en stries pour la croissance. Dans cet exemple, étant donné que la protéine de fusion résultante est fortement exprimée (énolase) et les médecins de famille sont lumineuses, nous avons été en mesure de dépister les transformants par microscopie à fluor.......

Discussion

Construction d'épitope tagged séquences dans les espèces de Candida en utilisant la stratégie de modification génique par PCR décrit ci - dessus peuvent être résumées comme un processus en trois étapes. Tout d'abord, la cassette est réalisée par PCR qui code à la fois la séquence souhaitée pour l'intégration et des régions homologues au locus d'insertion dans le génome de la levure. D'autre part, les cellules de levure à transformer chimiquement compétentes sont effectuées avec de l'acét.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lampe au mercure 100 W	CHIU Technical Corporation	M-100T
95 % Éthanol	N’importe quel	NA
Adénine	N’importe quel	NA
Ampicilline	Tout	NA
Porteur d’ADN	Ambion	AM9680	Saumon cisaillé Sperme ADN 10 mg/ml
CCD Appareil photo	Photométrie	CoolSNAP HQ
Tube conique	Corning	430828	50 ml
Rotateur de tube de culture	New Brunswick	2013923	TC-8, ou n’importe quel tube de culture Rotator
désoxynucléotides (dNTP) Qualité PCR	N’importe quel	Eppendorf NA
	Eppendorf	022363719, 022363212	0,5 ml, 1,5 ml
Erlenmeyer Fiole	Fisher Scientific	7250089	125 ml
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Tout	NA
(-80 ° ; C)	Thermo Electron Corporation	ULT-1386-9-V	Revco Ultima II
GFP, YFP et Texas Red Sets de filtres	Chroma Technology Corporation	49002, 86004v2, 49008
Tubes de culture en verre	Fisher Scientific	1496126	75 mm
HRP chèvre anti-souris	Santa Cruz Biotechnology	SC-2005
HRP chèvre anti-lapin	Santa Cruz Incubateur de biotechnologie	SC-2301
(30 ° ; c)	Tout	de
bouillon de lysogénie (
		Eppendorf
		5415 D
Microscope	Nikon	E600	Eclipse E600
	Universal Imaging Corporation	6.3r7	MetaMorph Software Series 6.3r7
Souris Anticorps anti-GFP	Roche	11814460001
Nourseothricin	Fisher	50997939
PCR Thermocycler	Applied Biosystems	9700	GeneAmp PCR System
Tubes PCR	BioExpress, GeneMate	T-3035-1	0,2 ml
Polyéthylène glycol 3350	Tout	NA
Chlorure de potassium	Tout	NA
Lapin anti-mCherry Anticorps	BioVision	5993-100
Réfrigérateur (4 ° ; c)	Tout	AC
Acétate de sodium	N’importe quel	NA
		SMZ1500
Centrifugeuse de table	Labnet	Z 400	Hermle Z 400
Taq ADN polymérase	N’importe quel
NA Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris)	N’importe quel	NA
Vortex Mixer	Scientific Industries	SI-0236	Vortex Genie 2
Extrait de levure Peptone Dextrose (YPD) Média	N’importe quel	NA

tube congélateur support LB) de chlorure de magnésium NA Microcentrifugeuse Nikon Scientific Stéréomicroscope Nikon