Modélisation Comportement cancer de l'ovaire multicellulaire Spheroid dans un Microdevice Dynamic 3D péritonéale

Résumé

Pour étudier la progression de la tumeur ovarienne dans un modèle physiologiquement pertinente, sphéroïdes multicellulaires ont été cultivées dans un microdispositif dans l'écoulement de fluide simulé. Ce modèle 3D dynamique émule l'environnement intrapéritonéale avec les composants cellulaires et mécaniques où les métastases du cancer de l'ovaire se produit.

Résumé

Cancer de l'ovaire se caractérise par une vaste métastases péritonéales, avec des sphères tumorales couramment dans les ascites malignes. Ceci est associé à des résultats cliniques pauvres et manque actuellement de traitement efficace. Les deux (3D) environnement tridimensionnel et les forces mécaniques dynamiques sont des facteurs très importants dans cette cascade métastatique. Cependant, les cultures cellulaires traditionnelles ne parviennent pas à récapituler ce microenvironnement tumoral naturel. Ainsi, in vivo -comme modèles qui peuvent imiter l'environnement intrapéritonéale sont d' une importance évidente. Dans cette étude, une nouvelle plate-forme microfluidique du péritoine a été mis en place pour imiter la situation des sphéroïdes de cancer de l'ovaire dans la cavité péritonéale pendant la métastase. sphéroïdes cancer de l'ovaire générées dans une condition de non-adhérentes ont été cultivées dans des canaux microfluidiques revêtues de cellules mésothéliales peritoneales soumis à une contrainte de cisaillement physiologiquement pertinent. En résumé, ce cancer de l'ovaire-mésothélium micro dynamique 3Dplateforme rofluidic peut fournir de nouvelles connaissances sur la biologie fondamentale sur le cancer et de servir de plate-forme pour le criblage de médicaments potentiels et le développement.

Introduction

Cancer de l' ovaire est le cancer gynécologique le plus mortel et se caractérise par la diffusion péritonéale généralisée et la formation de l' ascite maligne ^1. Cette vaste métastases péritonéales représente un défi clinique majeur et est associée à des résultats cliniques pauvres. Contrairement à la plupart des carcinomes solides qui produisent des métastases par le sang, le cancer des ovaires diffuse principalement à l'intérieur de la cavité péritonéale. Les cellules tumorales existent sous forme d' agrégats multicellulaires / sphéroïdes lors du processus de métastases ^2. Le fait que la culture en suspension peut enrichir les cellules ovariennes de tige de cancer / tumeurs initiant suggère en outre que ces sphéroïdes peuvent être associés à la fois avec l' agressivité tumorale et de la chimiorésistance ^{3, 4} améliorée. Il existe des différences dans la réponse aux médicaments entre 2D et 3D cultures, qui ont probablement des mécanismes moléculaires différents ^5.

_content "> L'interaction essentiel avec le mésothélium construit le microenvironnement primaire pour la progression d'une tumeur de l'ovaire. Ces cellules mésothéliales sont situés sur une matrice extracellulaire (ECM), où la fibronectine est un constituant ubiquitaire. Un lien entre l'expression accrue de mésothéliale fibronectine provenant d'une cellule et la progression tumorale a été démontrée. la fibronectine est présente en abondance dans l' ascite maligne ^{6, 7.} les cellules cancéreuses de l' ovaire sont également capables d'induire la sécrétion de fibronectine provenant de cellules mésothéliales afin de favoriser la métastase précoce du cancer de l' ovaire ^8.

De nouvelles preuves montrent que des stimuli mécaniques, y compris la contrainte de cisaillement, peuvent moduler la morphologie des cellules, l' expression des gènes, et, par conséquent, les phénotypes de cellules tumorales ^{9, 10, 11.} Comme ascite maligne développer et accumuler pendant tumor progression des cellules tumorales de l' ovaire sont exposés à un écoulement de fluide et la contrainte de cisaillement résultant. Un certain nombre de groupes, y compris la nôtre, ont montré l'impact de la contrainte de cisaillement sur la progression du cancer de l' ovaire, y compris les modifications du cytosquelette, épithéliale-mésenchymateuse transitions et stemness du cancer ^{12, 13, 14, 15.} Ainsi, un microenvironnement physiologiquement pertinente est important pour l'étude des tumeurs métastases péritonéales. Cependant, les systèmes de culture actuels in vitro hydrodynamiques ont des limites sur mimant et en contrôlant une constante, faible, contrainte de cisaillement physiologiquement pertinents ^{16, 17, 18, 19.} Conventionnel approches in vitro se concentrant sur soit l'environnement cellulaire ou mécanique sont encore limitées dansmimant la complexité du microenvironnement intraperitoneale avec pertinence physiologique approprié.

Ici, dans le but de concevoir un nouveau modèle du péritoine pour surmonter les limites des stratégies conventionnelles et pour faire avancer l'étude du compartiment intrapéritonéale dans les métastases du cancer, une plate-forme 3D microfluidique à base d'un écoulement de fluide contrôlé a été conçu. Dans ce modèle, les sphéroïdes cancer de l' ovaire ont été co-cultivées avec des cellules mésothéliales humaines primaires péritonéaux dans les puces microfluidiques sous écoulement de fluide continu (figure 1A). Les cellules mésothéliales ont été étalées sur fibronectine. cancer de l'ovaire sphéroïdes non adhérentes ont été ensemencées dans des canaux microfluidiques avec un milieu à écoulement continu perfusé par une pompe à seringue. L'environnement 3D et les forces mécaniques dynamiques sont des facteurs très importants de la cascade métastatique. Cette plate-forme peut être utilisée pour étudier le microenvironnement intrapéritonéale en termes de cel complexeinteractions lulaires et co-culture, ainsi que par rapport à des signaux mécaniques dynamiques.

Protocole

1. microfluidique Conception et fabrication de périphériques

1. conception maître microfluidique
   1. Conception et dessiner le motif de canal microfluidique avec un (CAO) de conception assistée par ordinateur.
      REMARQUE: Normalement, le dessin CAO peut être envoyé à une société de photomasques pour produire le photomasque. La conception microfluidique se compose de trois canaux parallèles identiques, chacune ayant les dimensions suivantes: 4 mm x 25 mm x 250 um (largeur x longueur x hauteur) et situé à 2 mm. Les deux extrémités du canal ont été conçus avec 127 ° angles pour faciliter l' entrée et la sortie de liquide (figure 1B). Le canal utilisé dans ce protocole a été rapporté dans une publication précédente ^13.
   2. Laver la plaquette de silicium avec traitement aux ultrasons (500 W / 42 kHz) dans de l'acétone, de l'isopropanol et de l'eau déminéralisée pendant 15 minutes à chaque fois. Sécher la plaquette avec de l'azote gazeux sous pression. Chauffer la plaquette de silicium sur une plaque chaude à 250 ° C pendant 15 min à sécher complètementil.
   3. Spin-couche une couche de SU-8 2075 photorésist (125 um d'épaisseur) sur la plaquette de silicium à une vitesse de rotation de 1800 tours par minute. Cuire la plaquette de résine photosensible revêtue directement sur une plaque chaude à 65 ° C, puis à 95 ° C, pour éliminer l'excès de solvant, pour 5 et 25 min, respectivement (selon le manuel du produit SU-8).
   4. Répétez l'étape 3 et spin-coat une autre couche de SU-8 2075 résine photosensible pour obtenir une épaisseur finale de 250 um. Cuire la plaquette de résine photosensible revêtue directement sur une plaque chauffante à 65 ° C pendant 7 minutes et ensuite à 95 ° C pendant 30 min. refroidir lentement la plaquette jusqu'à la température ambiante. Ne pas refroidir avec de l'air sous pression.
   5. Aligner et mettre le photomasque directement sur le dessus de la plaquette. Exposer à la lumière UV pendant 20 s pour réticuler le motif.
   6. Cuire la plaquette de résine photosensible à 65 ° C et 95 ° C sur une plaque chauffante pendant 5 et 12 min, respectivement, pour éliminer le solvant de polymérisation (selon le manuel du produit SU-8). Ensuite, refroidir la plaquette àtempérature ambiante.
   7. Enlever la résine photosensible non réticulé par immersion de la plaquette dans le document SU-8 développateur pendant 25 min. Rincer la plaquette avec de l'isopropanol et le sécher avec de l'air sous pression.
      NOTE: Si une solution laiteuse a été observée lors du rinçage avec de l'isopropanol, ce qui indique un développement incomplet, immerger la plaquette arrière dans SU-8 développeur pour un temps de développement plus long.
   8. Placez la plaquette sur une plaque chaude à 180 ° C pendant 10 min pour guérir le motif de fissures potentielles. Éteignez la plaque chaude et refroidir lentement la plaquette à la température ambiante en le laissant sur la plaque chauffante.
   9. Ajouter quelques gouttes de trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyle) silane dans un bouchon de flacon. Mettre le bouchon du flacon dans le dessiccateur à vide. Placer la plaquette à côté du bouchon de flacon pour silaniser la plaquette pendant 10 min.
2. PDMS fabrication de puces
   1. Enveloppez la tranche avec une feuille d'aluminium pour créer un support.
   2. Mélanger le polydiméthylsiloxane (PDMS) base et un agent de durcissement à un ratio de 10: 1 de masseavec un mélangeur centrifuge sous la fonction de mélange et dégazer. Verser le mélange PDMS lentement sur la tranche à une hauteur d'environ 5 mm. Dégazer le PDMS sous vide pendant 40 min. Cure les PDMS dans un four à 65 ° C pendant 2 h.
   3. Retirer délicatement la dalle PDMS hors du maître et de couper les PDMS le long des canaux jusqu'à ce qu'il soit la taille d'une lame de verre. Percez les PDMS avec un 1 mm poinçon de biopsie pour créer les entrées et sorties de l'appareil.
   4. Nettoyer la surface PDMS avec de l'air sous pression et du ruban adhésif pour enlever la poussière et les débris PDMS.
   5. Placez la dalle PDMS, avec le côté du canal vers le haut, dans un nettoyeur à plasma. Placez une lame de verre propre dans le nettoyeur à plasma aux côtés de la dalle PDMS.
   6. Traiter les PDMS et lame de verre sous plasma d'air au niveau de RF élevé pendant 1 min. Liez les PDMS à la lame de verre pour créer une liaison covalente irréversible.
   7. Placer la puce PDMS sur une plaque chaude à 150 ° C pendant 1 h afin d'améliorer la résistance de liaison et de revenir dans la hydrophobicity des PDMS avant utilisation.

2. Ensemencement la puce microfluidique avec des cellules mésothéliales péritonéales primaires (HPMC)

1. Fibronectine revêtement de canaux microfluidiques
   1. Stériliser le canal microfluidique avec 30 ul de 75% d'éthanol. Retirer l'éthanol et rincer deux fois avec 30 pi de stériliser une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) en utilisant une pointe de pipette. Aspirer à fond PBS dans les canaux.
      NOTE: Pour réduire au minimum la contamination de la culture cellulaire doit être soigneusement microfluidique réalisé dans des conditions totalement aseptiques, grâce à l'utilisation d'une hotte à flux laminaire.
   2. Préparer une solution à 10 pg / ml de fibronectine dans M199 sans sérum: MCDB105 (1: 1) moyen. Pipeter la solution de haut en bas, avec un soin particulier pour éviter la formation de bulles. Ne pas vortex.
   3. Remplir lentement jusqu'à chaque canal avec 30 pi de solution de fibronectine. Sceller les canaux avec du ruban adhésif et incuber la puce nuit à 4 ° C.
3. HPMC de culture dans 10% de sérum fœtal bovin (FBS) un milieu de culture (M199: MCDB105 supplémenté avec 10% de FBS et 100 U / ml de pénicilline / streptomycine) sous 5% de _CO2 à 37 ° C jusqu'à 80% de confluence.
4. Rincer les HPMC avec 3 ml de PBS et trypsiniser avec 2 ml de trypsine à 0,05% / EDTA (TE), une solution à 0,01% pendant 30 secondes. Neutraliser avec 4 ml de 10% de milieu de culture FBS et centrifuger les cellules à 1000 g pendant 5 min.
5. Remettre en suspension les HPMC dans 2 ml de 10% de milieu de culture de FBS. Compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre et ajuster la concentration de cellules à 3,5 x 10 ⁶ / ml.
6. Chauffer la puce microfluidique fibronectine dans un incubateur à 37 ° C pendant 5 min avant utilisation. Complètement aspirer la solution de fibronectine.
7. pipette lentement 30 pi de HPMC suspension dans chaque canal. Sceller les canaux avec du ruban adhésif et placer les appareils dans le CO ₂ incubateur pendant une nuit.

1. la formation de sphéroïde cancer de l'ovaire
   1. Maintenir la épithélial lignée humaine de cellules de cancer de l' ovaire Skov-3 à 5% du milieu de culture de FBS (M199: MCDB105 avec 5% de FBS et 100 U / ml de pénicilline / streptomycine) sous 5% de _CO2 à 37 ° C avant les essais.
   2. Dissoudre 0,5% d'agarose dans de l'eau stérilisée par ébullition. Distribuer 50 ul de solution d'agarose dans chaque puits de plaques à 96 puits. Laisser les plaques dans la hotte pendant 20 min pour permettre l'agarose se solidifie; agarose solidifié enrobant les puits peuvent empêcher l'adhésion cellulaire et indique que les plaques sont prêtes à l'emploi.
   3. Rincer les cellules Skov-3 avec 3 ml de PBS. Trypsiniser avec 2 ml de solution de TE pendant 3 min. Neutraliser avec 4 ml de 5% du milieu de culture FBS et centrifuger les cellules à 1000 g pendant 5 min.
   4. Compter le nombre de cellules Skov-3 avec un hémocytomètre et remettre en suspension les cellules dans 5% de FBS milieu de culture à une densité de 5000 cellules / mL. Transfert 200 pi de suspension cellulaire dans chaque puits et la culture d' agarose revêtue de moins de 5% de _CO2 à 37 ° C pendant 48 heures.
2. sphéroïde Cancer loading
   1. Transférer sphéroïdes cancéreuses dans un tube de centrifugeuse de 50 ml préalablement humidifié avec 1 ml de milieu exempt de sérum et centrifuger à 750 g pendant 5 min.
      NOTE: Pré-humidifiée embouts de pipette et des tubes de centrifugeuse peut empêcher indésirable sphéroïde fixation sur les tubes de centrifugation.
   2. Préparer 2,5 pg / ml de diacétate (CMFDA) solution 5 de chlorométhylfluorescéine dans M199 sans sérum: milieu MCDB105. sphéroïdes cancéreuses remettre en suspension dans 1 ml de solution CMFDA et incuber à 37 ° C pendant 30 min. Centrifuger à 750 g pendant 5 min.
   3. Rincer les sphéroïdes de cancer avec 2 ml de milieu exempt de sérum et centrifuger à 750 g pendant 5 min. Répéter cette étape deux fois pour éliminer le colorant fluorescent restant dans le milieu.
      NOTE: Le signal fluorescent peut être retenu dans sphéroïdes pendant plus de 96 h.
   4. Resuspendre le cancersphéroïdes dans M199 sans sérum: milieu MCDB105 et compter le nombre sphéroïde avec un hémocytomètre. Ajuster la concentration de 2.000 sphéroïdes / ml avec du milieu sans sérum.
   5. Avant sphéroïde chargement, injecter lentement 100 pi de M199 sans sérum: milieu MCDB105 pour laver les cellules non-adhéré mésothéliales à l'intérieur des canaux.
      NOTE: Une injection rapide, aspiration, ou la formation de bulles entraîne le détachement de la monocouche mésothéliales.
   6. Charge 30 pi de suspension sphéroïde marqué par fluorescence dans chaque canal. Placez la puce microfluidique dans le CO ₂ incubateur.
3. Ensemble de perfusion plate-forme et la co-culture
   1. Fixer une seringue chargée avec M199 frais, sans sérum: moyen MCDB105 à un 1 m de long tube.
   2. Placer la seringue sur la pompe à seringue et fixer le piston et le corps de la seringue. Installer la pompe de seringue dans une position horizontale à la même hauteur que la puce microfluidique à l'intérieur de l'incubateur.
      NOTE: Le nombre et les dimensions des seringues dépendent du nombre de canaux utilisés et de la durée de l'expérience.
   3. perfuser rapidement le tube entier avec un milieu en appuyant sur le bouton d'avance rapide jusqu'à ce que le moyen déborde le tube.
   4. Exécutez l'injection au débit souhaité. Estimer la contrainte pariétale utilisant l'équation suivante:
      
      où τ représente la contrainte de cisaillement de paroi intérieur de la chambre, ǫ = débit, μ = viscosité (0,01 g cm ^-1); h = débit hauteur de la chambre, et w = débit largeur de la chambre.
   5. Branchez le tuyau à l'entrée du canal. Placer l'excès de la tubulure d'entrée dans l'incubateur pour assurer que le milieu est chauffé avant injecté dans les canaux. Pour faciliter la connexion entre le tube et le canal, les connecteurs appropriés peuvent être choisis. NOTE: Attention à ne pas introduire de bulles à la Syringe, tubes et raccords.
   6. Raccorder la sortie du canal à un tube conique de 50 ml pour recueillir le milieu d'écoulement avec un tube de sortie court.
      NOTE: Le système complet de co-culture dynamique est illustrée à la figure 1D.

4. Observation de HPMC et Cancer Spheroids après Perfusion

1. Observer les HPMC et sphéroïdes de cancer avec un champ lumineux ou un microscope à fluorescence et prendre des photos après 1 h de perfusion.

Résultats

En utilisant ce protocole, une plate-forme microfluidique a été créé pour modéliser sphéroïdes de cancer de l'ovaire avec des cellules mésothéliales dans des conditions hydrodynamiques. les cellules mésothéliales peritoneales humaines primaires ont été cultivées dans microdispositif pendant 16 heures et observées sous un microscope à champ clair. Comme on le voit sur la figure 2A, le fond du canal a été couvert avec succès avec une monocouche de HPMC. Il est important de...

Discussion

Cet essai constitue un modèle flexible et physiologiquement pertinents qui peuvent être incorporés à divers dosages biochimiques et cellulaires, y compris, mais sans s'y limiter, des tests d'adhérence, des tests de libération mésothéliales et le dépistage de la drogue. Elle peut être appliquée à l'évaluation de l'effet du microenvironnement intrapéritonéale sur la progression du cancer. Cependant, plusieurs conditions expérimentales pourraient avoir besoin d'être optimisé, en fonction des objectifs d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaquette de silicium	University wafer	#1196	100 mm
SU-8 2075 photoresist  ;	Développeur Microchem
SU-8  ;	Microchem	108-65-6
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyle)	silane Sigma	448931
Sylgard 184	Dow Corning	1673921	Polydimethylsiloxane (PDMS) + kit d’agent de durcissement
Biopsie punch  ;	Miltex	33-31AA	1 mm de diamètre
Nettoyeur plasma	Harrick Plasma	PDC-002
Tube en polyéthylène	SCI	BB31695-PE/5	0,86 mm (diamètre intérieur)
Seringue	Terumo
Pompe à seringue	Pompe de précision plus longue  ;	; LSP01-2A
Medium 199	Invitrogen	31100-035	Ajouter 2,2 g/L de bicarbonate
de sodium MCDB 105 Medium	Sigma	M6395
Sérum fœtal bovin (FBS)	Hyclone	SH30068.02
Pénicilline/streptomycine  ;	Invitrogen	15070-063
Trypsine EDTA solution  ;	Gibco	25300-054	0,05 % Trypsine - 0,01 % EDTA, rouge phénol
fibronectine humaine	BD	354008
agarose.	Invitrogen	15510-027
Diacétate de 5-chlorométhylfluorescéine	Life technologies	C7025	Vert CMFDA
CO2 incubateur	SANYO	MCO-18AIC
Centrifugeuse	Hitachi	CT15RE
Microscope fluorescent	Nikon		Modèle : 80i ou ECLIPSE Ti ; logiciel : SPOT
SKOV-3& nbsp ;			Don du Dr N Auersperg (Université de la Colombie-Britannique)