Procédé pour la stabilisation et la séparation des complexes de protéines natives à partir de lysat de tissu non modifié en utilisant une protéine réactive amine agent de réticulation couplé à une nouvelle électrophorèse sur gel de polyacrylamide en deux dimensions (PAGE) système est présentée.
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Article de méthode
Multimère-PAGE: un procédé de capture et de résolution de complexes de protéines dans des échantillons biologiques
Dans cet article
Résumé
Résumé
Il existe de nombreuses méthodes bien développées pour purifier et étudier des protéines et des peptides uniques. Cependant, la plupart des fonctions cellulaires sont réalisées par des réseaux de complexes de protéines qui interagissent, qui sont souvent difficiles à étudier car leur liaison n'est pas covalente et facilement perturbée par des techniques de purification. Ce travail décrit une méthode de stabilisation et de séparation des complexes de protéines indigènes à partir de tissus non modifiés en utilisant une électrophorèse en gel de polyacrylamide bidimensionnelle. Le lysat de tissu est chargé sur un gel de polyacrylamide natif non dénaturant, puis on applique un courant électrique jusqu'à ce que la protéine migre à une courte distance dans le gel. La bande de gel contenant la protéine migrée est ensuite excisée et incubée avec le réactif réticulant réactif à l'aminé dithiobis (propionate de succinimidyle), qui stabilise de manière covalente les complexes de protéines. La bande de gel contenant des complexes réticulés est ensuite jetée dans un gel de polyacrylamide de dodécyl sulfate de sodium et til complexes sont séparés complètement. La méthode repose sur des techniques et des matériaux familiers à la plupart des biologistes moléculaires, ce qui signifie qu'il est peu coûteux et facile à apprendre. Bien qu'il soit limité dans sa capacité à séparer suffisamment complexes de très grande taille, et n'a pas été universellement avec succès, la méthode a été en mesure de capturer une grande variété de complexes bien étudiés, et probablement applicable à de nombreux systèmes d'intérêt.
Introduction
La fonction cellulaire normale est dépendante des interactions protéine-protéine 1, 2. En conséquence, les maladies humaines sont souvent marqués par des perturbations dans l'assemblage et le comportement de différents complexes protéiques 3. La capacité de caractériser ces interactions est donc essentiel. Les moyens actuels de détection de ces interactions nécessitent la purification des protéines cibles, souvent suivies de pull-down de leurs partenaires d'interaction. Purification classique est réalisée par centrifugation différentielle, la précipitation, et / ou Chroma....
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Protocole
1. Préparation du tissu
- Préparer 10 ml de 4x tampon d'échantillon BN-PAGE (200 mM de bis (2-hydroxyéthyl) amino-tris (hydroxyméthyl) méthane (Bis-Tris), 200 mM de NaCl, 40% p / v de glycerol, 0,004% de Ponceau S, pH 7,2 ).
NOTE: Cette solution mère peut être faite à l'avance et conservé à 4 ° C. - Diluer 250 ul de tampon d'échantillon 4x dans 750 ul dH 2 O contenant un cocktail d'inhibiteurs de proteases commerciales 1x. Vortex et laisser refroidir sur la glace.
- Homogénéiser 20 mg de tissu cible dans le 1 mL 1x glacée tampon d'échantillon BN-PAGE avec 30 coups d'un homogénéisateur Dounce propre. <....
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Résultats
Dans cette expérience de démonstration, multimère-PAGE a été réalisée sur l'ensemble lysat de cerveau de rat. Les protéines séparées résultantes ont été transférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF), et ensuite sondées avec des anticorps dirigés contre des protéines qui sont connues pour former des complexes. La figure 1 montre une validation du protocole par deux moyens. Tout d' abord, nous avons démontré que les protéines réticulées sont .......
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Discussion
Les interactions protéine-protéine sont importantes pour tous les êtres vivants réalisent la tâche. En raison de cela, ils font l'objet d'un examen minutieux et de la recherche. Multimère-PAGE est un nouveau procédé pour la saisie, la séparation et l'analyse d'une large gamme de complexes de protéines. Nous avons déjà démontré son applicabilité à l' étude oligimerization de la protéine associée à la maladie α-synucléine 11. Cependant, il est extensible à de nombreux complexes .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Pris en charge par le NIH / NIDA DA034783. Nous tenons à remercier Bryan A. Killinger d'assistance technique avec le multimère-PAGE.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Acide chimique | |||
| &epsilon ;-Acide aminocaproïque | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxique. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (solution mère à 40 % T) | BioRad | 161-0148 | Toxique. |
| Persulfate d’ammonium | Sigma | A3678 | |
| Anti lapin IgG-HRP de chèvre | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Kit de dosage de l’acide bicchoninique | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Albumine sérique bovine | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Kit de substrat de chimiluminescence | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Diméthylsulfoxyde | Fisher | Scientific D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Lait écrémé sec | LabScientific | M0841 | |
| Glycérol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Cocktail | d’inhibiteur de protéaseThermofisher | 78430 | |
| Acide chlorhydrique | Fisher Scientific | A144SI-212 | Pour titrage. Caustique. |
| Méthanol | Fisher Scientific | A412-4 | Pour l’activation de la membrane PVDF. Toxique. |
| IgG monoclonale anti alpha ;-synucléine de lapin | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tétraméthyléthylènediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-méthylènebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxique. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Membranes de transfert de fluorure de polyvinylidène | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Chlorure de potassium | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Phosphate de potassium monobasique | Sigma | P9791 | |
| Cocktail inhibiteur de protéase | Thermo Scientific | 88265 | |
| Solution SDS (10 % p/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Chlorure de sodium | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Dodécylsulfate de sodium | Sigma | L37771 | |
| Phosphate de sodium monobasique | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Base Tris | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (tampon 0,5 M, pH 6,8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (tampon 1,5 M, pH 8,8) | BioRad | 161-0798 | |
| Nom | <>Entreprise | Numéro de catalogue | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| Logiciel | ImageJ NIH | ||
| Synergy H1 Lecteur de microplaques | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Centrifugeuse Microfuge 22R | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogénéisateur | |||
| Mélangeur vortex | Fisher Scientific | ||
| Homogénéisateur de tissus à ultrasons | Fisher Scientific | FB120220 |
Références
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev
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Réimpressions et autorisations
