Multimère-PAGE: un procédé de capture et de résolution de complexes de protéines dans des échantillons biologiques

Summary

Procédé pour la stabilisation et la séparation des complexes de protéines natives à partir de lysat de tissu non modifié en utilisant une protéine réactive amine agent de réticulation couplé à une nouvelle électrophorèse sur gel de polyacrylamide en deux dimensions (PAGE) système est présentée.

Abstract

Il existe de nombreuses méthodes bien développées pour purifier et étudier des protéines et des peptides uniques. Cependant, la plupart des fonctions cellulaires sont réalisées par des réseaux de complexes de protéines qui interagissent, qui sont souvent difficiles à étudier car leur liaison n'est pas covalente et facilement perturbée par des techniques de purification. Ce travail décrit une méthode de stabilisation et de séparation des complexes de protéines indigènes à partir de tissus non modifiés en utilisant une électrophorèse en gel de polyacrylamide bidimensionnelle. Le lysat de tissu est chargé sur un gel de polyacrylamide natif non dénaturant, puis on applique un courant électrique jusqu'à ce que la protéine migre à une courte distance dans le gel. La bande de gel contenant la protéine migrée est ensuite excisée et incubée avec le réactif réticulant réactif à l'aminé dithiobis (propionate de succinimidyle), qui stabilise de manière covalente les complexes de protéines. La bande de gel contenant des complexes réticulés est ensuite jetée dans un gel de polyacrylamide de dodécyl sulfate de sodium et til complexes sont séparés complètement. La méthode repose sur des techniques et des matériaux familiers à la plupart des biologistes moléculaires, ce qui signifie qu'il est peu coûteux et facile à apprendre. Bien qu'il soit limité dans sa capacité à séparer suffisamment complexes de très grande taille, et n'a pas été universellement avec succès, la méthode a été en mesure de capturer une grande variété de complexes bien étudiés, et probablement applicable à de nombreux systèmes d'intérêt.

Introduction

La fonction cellulaire normale est dépendante des interactions protéine-protéine ^{1, 2.} En conséquence, les maladies humaines sont souvent marqués par des perturbations dans l'assemblage et le comportement de différents complexes protéiques ^3. La capacité de caractériser ces interactions est donc essentiel. Les moyens actuels de détection de ces interactions nécessitent la purification des protéines cibles, souvent suivies de pull-down de leurs partenaires d'interaction. Purification classique est réalisée par centrifugation différentielle, la précipitation, et / ou Chroma....

Protocol

1. Préparation du tissu

1. Préparer 10 ml de 4x tampon d'échantillon BN-PAGE (200 mM de bis (2-hydroxyéthyl) amino-tris (hydroxyméthyl) méthane (Bis-Tris), 200 mM de NaCl, 40% p / v de glycerol, 0,004% de Ponceau S, pH 7,2 ).
   NOTE: Cette solution mère peut être faite à l'avance et conservé à 4 ° C.
2. Diluer 250 ul de tampon d'échantillon 4x dans 750 ul dH ₂ O contenant un cocktail d'inhibiteurs de proteases commerciales 1x. Vortex et laisser refroidir sur la glace.
3. Homogénéiser 20 mg de tissu cible dans le 1 mL 1x glacée tampon d'échantillon BN-PAGE avec 30 coups d'un homogénéisateur Dounce propre. <....

Results

Dans cette expérience de démonstration, multimère-PAGE a été réalisée sur l'ensemble lysat de cerveau de rat. Les protéines séparées résultantes ont été transférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF), et ensuite sondées avec des anticorps dirigés contre des protéines qui sont connues pour former des complexes. La figure 1 montre une validation du protocole par deux moyens. Tout d' abord, nous avons démontré que les protéines réticulées sont clivable.......

Discussion

Les interactions protéine-protéine sont importantes pour tous les êtres vivants réalisent la tâche. En raison de cela, ils font l'objet d'un examen minutieux et de la recherche. Multimère-PAGE est un nouveau procédé pour la saisie, la séparation et l'analyse d'une large gamme de complexes de protéines. Nous avons déjà démontré son applicabilité à l' étude oligimerization de la protéine associée à la maladie α-synucléine ^11. Cependant, il est extensible à de nombreux complexes .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acide chimique
&epsilon ;-Acide aminocaproïque	Sigma	A2504
Acrylamide	Acros Organics	164855000	Toxique.
Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (solution mère à 40 % T)	BioRad	161-0148	Toxique.
Persulfate d’ammonium	Sigma	A3678
Anti lapin IgG-HRP de chèvre	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
Kit de dosage de l’acide bicchoninique	Thermofisher	23225
Bis-tris	Sigma	B9754
Albumine sérique bovine	Sigma	A9647
Butanol	Fisher Scientific	A399-1
Kit de substrat de chimiluminescence	ThermoFisher	24078
Coomassie blue G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonin	Sigma	D141	Toxic.
Diméthylsulfoxyde	Fisher	Scientific D128-1
Dithiobis(succinimidylpropionate)	Thermo Scientific	22585
Lait écrémé sec	LabScientific	M0841
Glycérol	Sigma	G9012
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5
Halt Cocktail	d’inhibiteur de protéaseThermofisher	78430
Acide chlorhydrique	Fisher Scientific	A144SI-212	Pour titrage. Caustique.
Méthanol	Fisher Scientific	A412-4	Pour l’activation de la membrane PVDF. Toxique.
IgG monoclonale anti alpha ;-synucléine de lapin	Santa Cruz Biotechnology	sc-7011-R
N,N,N',N'-tétraméthyléthylènediamine	Sigma	T9281
N,N'-méthylènebisacrylamide	Acros Organics	16479	Toxique.
NP40	Boston Bioproducts	P-872
Polysorbate 20 (tween-20)	Fisher Scientific	BP337-500
Membranes de transfert de fluorure de polyvinylidène	Thermo Scientific	88518
Ponceau S	Sigma	P3504
Chlorure de potassium	Fisher Scientific	P217-3
Phosphate de potassium monobasique	Sigma	P9791
Cocktail inhibiteur de protéase	Thermo Scientific	88265
Solution SDS (10 % p/v)	BioRad	161-0416
Chlorure de sodium	Fisher Scientific	BP358-212
Dodécylsulfate de sodium	Sigma	L37771
Phosphate de sodium monobasique	Fisher Scientific	BP329-1
Tricine	Sigma	T0377
Base Tris	Fisher Scientific	BP152-500
Tris-HCl (tampon 0,5 M, pH 6,8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (tampon 1,5 M, pH 8,8)	BioRad	161-0798
Nom	<>Entreprise	Numéro de catalogue	Comments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	28-9558-10
Logiciel	ImageJ NIH
Synergy H1 Lecteur de microplaques	BioTek
Gel Former + Stand	Biorad
Centrifugeuse Microfuge 22R	Beckman Coulter
2 mL dounce homogénéisateur
Mélangeur vortex	Fisher Scientific
Homogénéisateur de tissus à ultrasons	Fisher Scientific	FB120220