L’utilisation de Trace Eyeblink conditionnement de classique pour évaluer le dysfonctionnement hippocampique dans un modèle de Rat de Fetal Alcohol Spectrum Disorders

Résumé

Conditionnement classique de trace eyeblink (ECC) a servi à évaluer apprentissage associatif hippocampe-dépendante chez des rats adultes qui ont administré une forte concentration (11,9 % v/v) d’alcool pendant le développement précoce du cerveau néonatal. En général, les procédures ECC sont sons outils de diagnostic pour la détection de dysfonctionnement cérébral à travers de nombreux paramètres psychologiques et biomédicales.

Résumé

Les rats nouveau-nés ont reçu une concentration relativement élevée de l’alcool éthylique (11,9 % v/v) pendant les jours 4 à 9, alors que le cerveau foetal subit des bouleversements organisationnels et est similaire à accéléré des changements de cerveau qui se produisent pendant le troisième trimestre chez les humains. Ce modèle de troubles du spectre de l’alcoolisation fœtale (FASDs) produit des lésions cérébrales graves, imitant le montant et le motif des beuveries qui survient chez certaines femmes enceintes alcooliques. Les auteurs décrivent l’utilisation de la trace de conditionnement eyeblink classique (ECC), une variante d’ordre supérieur d’apprentissage associatif, afin d’évaluer le dysfonctionnement hippocampique à long terme qui est généralement observée chez la progéniture adultes exposés à l’alcool. 90 jours après la naissance, les rongeurs ont été préparés chirurgicalement avec enregistrement et électrodes stimulants, qui mesure électromyographique (EMG) clignotent l’activité du muscle de la paupière gauche et livré léger choc postérieur de l’oeil gauche, respectivement. Après une période de récupération de 5 jours, ils ont subi de 6 sessions de trace ECC pour déterminer les différences d’apprentissage associatif entre les exposés à l’alcool et les rats témoins. Trace ECC est l’une des nombreuses procédures ECC possibles qui peuvent être facilement modifiés en utilisant le même matériel et le logiciel, afin que différents systèmes neuronaux peuvent être évalués. Procédures de l’ECC en général, peuvent servir comme outils de diagnostic pour détecter la pathologie neuronale dans des systèmes différents de cerveau et des conditions différentes qui insultent le cerveau.

Introduction

Il est assez difficile d'imaginer qu'à l'ère actuelle, avec de meilleurs soins de santé et un accès accru aux services médicaux, l'abus d'alcool demeure un problème majeur de santé publique mondiale. Malheureusement, il a été démontré qu'une femme enceinte qui consomme une grande quantité d'alcool peut donner naissance à un enfant souffrant de lésions cérébrales graves et de troubles neurodéveloppementaux durant toute la vie, comme on l'observe chez les personnes atteintes du syndrome d'alcoolisation fœtale (SAF)^1,2,3. Chez les femmes ayant un historique avéré de consommation d'alcool pendant la grossesse, le fœtus en développement est également sensible à de faibles quantités d'alcool ou à différents schémas de consommation entraînant des variations des concentrations d'alcool dans le sang. Dans ce dernier cas, bien que les enfants n'présentent pas les troubles morphologiques ou neurocomportementaux sévères observés dans le SAF, ils peuvent néanmoins souffrir de handicaps cognitifs permanents et de troubles émotionnels allant d'une intensité légère à sévère^3,4. Dans leur ensemble, le SAF et les formes moins graves de troubles prénataux liés à l'alcool constituent un ensemble de troubles du spectre de l'alcoolisation fœtale (TSAF). Il n'est pas surprenant que les TSAF soient entièrement évitables, mais de manière étonnante, les estimations montrent que dans les populations où l'abus d'alcool est fréquent, ils restent la cause non génétique principale de déficience neurologique et cognitive, touchant environ 2 à 5 % des jeunes enfants aux États-Unis et dans des pays européens tels que la France et la Suède. En ce qui concerne l'incidence du SAF aux États-Unis, la prévalence est de 2 à 7 cas pour 1 000 naissances vivantes⁵, ce qui implique que l'incidence globale des TSAF est beaucoup plus élevée que celle du SAF.

Des études d'imagerie cérébrale menées chez des enfants atteints de TSAF ont montré qu'ils présentent des anomalies cérébrales, telles qu'un corps calleux plus mince⁶, un vermis cérébelleux antérieur plus petit⁷ et un hippocampe réduit⁸. Ces anomalies cérébrales sous-tendent certaines des perturbations neurocognitives à long terme observées chez les enfants atteints de TSAF. Les liens exacts reliant les variations des modifications cérébrales induites par l'alcool maternel aux variations du profil (c'est-à-dire le type, l'ampleur) de troubles neurocognitifs spécifiques restent à ce jour insuffisamment définis. Toutefois, comme point de départ, l'hippocampe constitue un excellent candidat pour évaluer sa vulnérabilité aux effets prénataux de l'alcool. En effet, les enfants atteints de TSAF présentent des déficits dans des comportements dépendants de l'hippocampe, tels que l'apprentissage de lieu^9,10 et la récupération différée d'objets¹¹.

Les modèles rongeurs des TSAF se sont révélés inestimables pour élucider les mécanismes menant aux perturbations neurocognitives observées chez les enfants atteints de TSAF. Un modèle bien établi d'exposition aiguë que nous avons adopté consiste à administrer de l'alcool à des rats pendant les jours postnataux 4 à 9^12,13, une période durant laquelle le cerveau subit une formation rapide des synapses et des contacts dendritiques, comparable à la semaine fœtale 24 chez l'humain et s'étendant jusqu'au 3^e trimestre^14,15,16,17. Ce modèle particulier induit une perte significative de neurones hippocampiques^18,19 ainsi que de neurones dans de nombreuses autres régions cérébrales telles que le cervelet^{12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23}, accompagnée de troubles sévères des fonctions cognitives couvrant différents domaines^21,24,25. La perturbation cognitive résultant d'une exposition précoce à l'alcool chez le rat peut être évaluée de diverses manières, notamment par le biais de la conditionnement classique palpébral (CCP). Le CCP est un paradigme utilisé depuis plus d'un siècle pour étudier scientifiquement les bases fondamentales de l'apprentissage^26,27 et constitue donc une méthode utile pour mieux comprendre les conséquences neurocognitives néfastes découlant d'une exposition prénatale à l'alcool. Il s'agit d'un paradigme très souple qui permet aux chercheurs d'utiliser une variété de procédures de CCP, chacune pouvant être étudiée chez de nombreuses espèces de mammifères allant de la souris à l'humain sur l'échelle phylogénétique, et à différents stades du développement cérébral^28,29,30,31. En outre, les circuits neuronaux fondamentaux qui sous-tendent l'apprentissage associatif dans ce paradigme sont appuyés par des rapports expérimentaux et neuropsychologiques chez ces mêmes espèces^{26,32,33,34,35,36,37}.

Une forme de CEC, la CEC à trace, est démontrée dans cet article (Figure 1). Pour fournir un contexte, elle est comparée à la forme plus traditionnelle — la CEC à délai. Le paradigme de CEC s'inspire du conditionnement classique chez le chien, initialement mis en œuvre par le physiologiste lauréat du prix Nobel, Ivan Pavlov. Pavlov a découvert que certains stimuli, tels que des sons, n'entraînent pas naturellement une salivation, mais que lorsqu'ils précèdent et se chevauchent avec la présentation de nourriture, la réponse salivaire peut être renforcée par des présentations répétées des deux stimuli, à condition que cette contingence son-nourriture soit maintenue. Ceci constitue un exemple de CEC à délai, selon lequel la force associative est médiée par la contiguïté temporelle immédiate entre les deux stimuli, rendant ainsi les conditions d'apprentissage optimales pour l'animal. Il a également testé d'autres variations de la contingence son-nourriture, comme éteindre le son et laisser une période de « trace » avant de présenter la nourriture. Lorsque ces deux stimuli étaient suffisamment discontigus, il devenait beaucoup plus difficile pour les chiens d'émettre une réponse de salivation avant la présentation de la nourriture. La discontiguïté entre l'extinction du son et la présentation de la nourriture constitue donc un exemple de CEC à trace. Étant donné que les rongeurs ne salivent pas naturellement en présence de nourriture, des stimuli plus pertinents pour l'espèce, tels qu'une légère décharge électrique, sont utilisés à la place ; ils n'émettent pas non plus naturellement de clignements oculaires défensifs en réponse à un son. Dans ce contexte, les protocoles de CEC chez le rongeur impliquent la présentation d'un son à un niveau donné de décibels, associé de manière spécifique à une légère décharge électrique appliquée soit au muscle de la paupière (orbicularis oculi), soit au muscle temporalis, afin d'induire une réponse de clignement. Le son est considéré comme un stimulus conditionné (SC), tandis que la décharge est considérée comme un stimulus non conditionné (SNC). Dans la CEC à délai, le SC est présenté en premier ; ce stimulus reste actif pendant une durée déterminée. Ensuite, le SNC est délivré. Ces deux stimuli se chevauchent pendant une certaine durée, puis cessent simultanément ; la réponse de clignement provoquée par le SNC est considérée comme une réponse non conditionnée (RNC). Dans ce protocole, les rongeurs apprennent à émettre des réponses de clignement quelque temps après la présentation du SC, mais juste avant le SNC, afin d'anticiper ce stimulus aversif. La réponse de clignement apprise est appelée réponse conditionée (RC). Dans la CEC à trace, le SC et le SNC sont séparés par une période de temps sans stimulus, appelée intervalle de trace ; ils ne se chevauchent pas dans le temps, contrairement à la CEC à délai. Pendant cet intervalle, l'animal doit établir l'association entre les stimuli. De façon similaire à la CEC à délai, l'apprentissage se produit lorsque l'animal émet de façon cohérente un clignement après l'extinction du SC, mais immédiatement avant la délivrance du SNC. Après un certain nombre de séances d'acquisition (SC associé au SNC), des courbes d'apprentissage (c'est-à-dire basées sur différentes mesures de RC) se développent. Des études lésionnelles et d'imagerie cérébrale montrent qu'un apprentissage réussi en CEC à délai dépend de l'intégrité des circuits neurologiques cérébelleux et du tronc cérébral^38,39,40, tandis que la CEC à trace est une procédure de niveau supérieur nécessitant un engagement neuronal supplémentaire de l'hippocampe^41,42,43,44 et d'autres structures corticales^45,46. En raison des exigences temporelles nécessaires pour acquérir correctement les RC à trace, cette tâche est également plus difficile à apprendre (même pour des sujets normaux).

Figure 1 : Conditionnement classique de clignement de paupières avec intervalle interstimulus. Une forme d'onde réelle est présentée, représentative d'un rat adulte du groupe témoin non intubé (UC). Le stimulus conditionnel sonore (CS) (85 dB, 2,8 kHz) est d'abord présenté pendant 380 ms. Un intervalle interstimulus de 500 ms suit, durant lequel aucun stimulus n'est présent. Ensuite, un stimulus non conditionnel de choc (US) (1,6 mA) est délivré pendant 100 ms. L'apprentissage réussi dans cette tâche se manifeste par une augmentation, au fil de nombreuses séances d'entraînement, de la fréquence (%) ou de l'amplitude (en volts) des clignements oculaires durant la fenêtre temporelle de réponse conditionnée (période totale de CR). En particulier, les rongeurs possédant un hippocampe intact émettent généralement davantage de réponses conditionnées bien synchronisées (CR adaptatives) juste avant le début du stimulus US de choc (dans une fenêtre de 200 ms). Les réponses de sursaut (SR) durant les 80 premières ms suivant l'apparition du CS sonore, ainsi que les réponses non conditionnées (UR), sont également mesurées. Les SR non associatives sont généralement faibles ou inexistantes chez les rongeurs bien entraînés, tandis que les UR sont censées être élevées en fréquence et en amplitude. Cette tâche exige que le rongeur apprenne à établir une association entre la fin du CS et le début de l'US (durant l'intervalle interstimulus), ce qui la rend intrinsèquement plus difficile à acquérir par rapport au conditionnement classique de type retard (delay ECC). Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Nous démontrons ici les conséquences fonctionnelles néfastes d'une exposition néonatale à l'alcool administrée selon un mode comparable à une consommation excessive ponctuelle, évaluée par une procédure de conditionnement classique avec intervalle (ECC), qui délivre un ton CS de 85 dB (2,8 kHz) pendant 380 ms, suivi d'une secousse électrique US de 1,6 mA pendant 100 ms, ces stimuli étant séparés par un intervalle de 500 ms. Nous avons déjà signalé l'utilité de ce test comportemental dans des études antérieures examinant l'intervention par la choline et la supplémentation en fer pour atténuer les effets de l'exposition néonatale à l'alcool^18,47. En effet, l'ECC avec intervalle peut être utilisé comme outil diagnostique pour évaluer les atteintes hippocampiques induites par l'alcool chez le nouveau-né. Son avantage par rapport à l'ECC sans intervalle réside dans sa sensibilité accrue pour détecter les perturbations de la fonction hippocampique, qui est altérée chez les humains atteints de troubles du spectre de l'alcoolisation fœtale (TSAF).

La démonstration de la CEC s'étend bien au-delà du domaine de l'alcoolisation fœtale. De nombreuses variantes de la CEC (par exemple : délai, trace, composée, inversion) peuvent être utilisées pour élucider les différences ontogénétiques dans l'apprentissage au cours du développement, les bases neurobiologiques de l'apprentissage associatif chez les mammifères normaux, ainsi que les vulnérabilités de différents systèmes cérébraux face à de nombreux facteurs de risque, notamment (mais sans s'y limiter) les tératogènes, les toxines environnementales, les traumatismes crâniens, les maladies neurodégénératives et les troubles psychiatriques.

Protocole

REMARQUE : Toutes les procédures ont été approuvées et réalisées conformément aux politiques établies par le comité IACUC de l'East Carolina University. Des rats Long-Evans ont été obtenus à partir de femelles accouplées avec des mâles reproducteurs. Les petits des trois groupes de traitement (voir 1.1) provenaient de la même portée issue d'une même mère. Cinq portées ont été produites et chaque portée a été réduite à 8 petits au troisième jour postnatale (DP) 3. Les deux petits restants de chaque portée ont été affectés à des expériences distinctes. Des descendants mâles et femelles (un par groupe d'exposition) ont été inclus dans l'étude. Un total de N = 27 descendants adultes ont été examinés dans cette étude ; 3 rats ont été exclus en raison de fils conducteurs 3T cassés (voir 3.1.1), impossibles à réparer au jour 1 de l'entraînement ECC.

1. Préparation des groupes, des matériaux et des solutions

1. Au 3e jour postnatale, retirer les ratons de la mère et les placer sur un tapis chauffant à régulation thermique pour les maintenir au chaud. Utiliser une procédure de sélection aléatoire pour répartir les ratons en trois groupes : (1) intubation à l'alcool (IA) ; (2) contrôle avec intubation factice (IF) ; ou (3) contrôle non intubé (CN). Réaliser les procédures d'identification approuvées, telles que le tatouage des pattes à l'encre [non toxique] à l'aide d'une aiguille de 30G x 1/2 po selon un schéma numéroté. Remettre les ratons auprès de la mère une fois le tatouage terminé.
2. Préparer un ou plusieurs tubes d'intubation intragastrique en utilisant du polyéthylène (PE) calibre 50 et 10. La longueur totale de ce tube dépend de l'utilisateur et peut être ajustée en conséquence.
   1. Utiliser des ciseaux de dissection microchirurgicaux pour couper un morceau de 7,6 cm de tube PE-50 et un morceau de 15,2 cm de tube PE-10.
   2. Fixer soigneusement le tube PE-50 à une aiguille hypodermique stérile de 22 G x 1 po.
   3. Insérer une extrémité du tube PE-10 dans l'extrémité ouverte du tube PE-50. Une coupe en biais peut être nécessaire à l'extrémité du tube PE-10 afin de faciliter son introduction dans le tube PE-50.
   4. Couper un petit morceau de tube PE-50 (environ 2-3 mm) et l'insérer sur l'extrémité ouverte du tube PE-10. Ce morceau servira de butée visuelle.
   5. Conserver le tube d'intubation intragastrique complet dans de l'alcool isopropylique à 70 % frais afin de le maintenir stérile.
3. Réaliser des procédures aseptiques pour préparer une solution-mère de lait dans des flacons de 50 mL. La solution-mère de lait est basée sur une formule alimentaire initialement établie par West et al. (1984)⁴⁸. Conserver les flacons à -18 °C jusqu'au moment de l'utilisation. Décongeler deux flacons de lait à l'aide d'eau tiède avant utilisation.
   1. Prélever 7,16 mL d'alcool éthylique à 95 % (USP) à l'aide d'une seringue stérile et l'ajouter à un flacon de 50 mL de lait. Cela donne une solution d'alcool à 11,9 % en volume/volume, administrée aux ratons lors des deux premiers repas de la journée (voir 2.1.1) ; la dose quotidienne totale d'alcool est de 5,25 g/kg/jour. Cette solution est conçue pour délivrer l'alcool dans un volume (0,0278 mL/g par repas) de solution de lait enrichi.
      REMARQUE : Cette quantité peut être ajustée en fonction de la taille de la portée et de la consommation prévue sur 3 à 4 jours. La quantité d'alcool ajoutée doit également être ajustée afin d'obtenir une solution à 11,9 % en volume/volume.
   2. Bien agiter ce flacon et l'étiqueter en conséquence (c.-à-d., Alcool éthylique 11,9 % v/v dans le lait).
   3. Étiqueter le second flacon de lait (sans alcool ajouté) en conséquence (par ex., Lait seul) et l'utiliser pour les repas supplémentaires comme indiqué au point 2.1.1.
   4. Conserver les deux flacons de lait au réfrigérateur.

2. Exposition néonatale à l'alcool (jours postnataux 4-9)

1. Donner aux ratons AI et SI un total de 4 intubations par jour à partir du JDP 4. Espacer chaque intubation de 2 h. Étant donné que les ratons AI sont intubés avec une solution réelle, chacune de leurs intubations est considérée comme un repas.
   1. Intuber les ratons AI avec la solution d’alcool éthylique à 11,9 % v/v dans le lait lors des deux premiers repas de la journée, puis les intuber avec la solution de lait seul lors des deux derniers repas de la journée afin de compléter leur croissance.
   2. Intuber les ratons SI quatre fois sans aucune solution, toutes les deux heures, en veillant à ce qu’ils soient exposés au tube PE-10 pendant la même durée que les ratons AI. Le groupe UC ne reçoit aucune intubation.
2. Séparer les ratons de la mère et les placer sur un tapis chauffant à circulation d’eau thermostaté pour les maintenir au chaud. Peser chaque raton et noter son poids corporel (en g). Se référer à un tableau d’alimentation préétabli pour déterminer le volume d’intubation pour chaque raton AI et l’inscrire sur une feuille de suivi.
   1. Placer la solution d’alcool éthylique à 11,9 % v/v dans le lait dans un bain-marie chaud et bien l’agiter.
   2. Procédure d’intubation intragastrique :
      1. Rincer soigneusement le tube d’intubation intragastrique, stocké dans de l’alcool isopropylique à 70 %, avec de l’eau tiède.
      2. Prélever la quantité correcte de solution à l’aide d’une seringue stérile de 1 mL.
      3. Imprégner l’extrémité du tube d’intubation (extrémité PE-10) d’huile de maïs fraîche (ceci facilite l’insertion).
      4. Mesurer la longueur du tube PE-10 depuis la bouche du raton jusqu’à son estomac. Ajuster le stoppeur PE-50 pour servir de repère au point d’arrêt.
      5. Insérer délicatement le tube PE-10 dans la bouche du raton, le faire descendre dans l’œsophage, le faire légèrement passer à travers le sphincter gastro-œsophagien et l’introduire dans l’estomac. Examiner le raton, le stabiliser, puis appuyer lentement sur le piston de la seringue pour administrer la solution. Procéder lentement.
         NOTA : Pour éviter d’insérer accidentellement le tube dans la trachée, diriger d’abord le tube de manière à ce qu’il s’incurve et entre en contact avec le palais mou avant d’avancer. Utiliser le palais comme guide, car le tube dévie naturellement de cette région et est dirigé vers l’œsophage. Toute déviation importante de l’extrémité vers le bas pourrait entraîner son introduction dans la trachée. Il est préférable de retirer le tube et de ne pas poursuivre l’intubation si l’on n’est pas certain de sa position d’entrée – réinsérer correctement le tube lors de la tentative suivante.
      6. Retirer soigneusement le tube PE-10 et examiner le raton pour détecter tout reflux de solution, présence de sang ou lésion physique. Remettre le raton avec ses frères et sœurs si tout va bien. La procédure d’intubation complète dure environ moins de 1 min par raton et environ 4 min au total pour les 4 ratons intubés de chaque portée (2 AI, 2 SI).
      7. Procédure d’intubation intragastrique pour les ratons SI : Suivre la même procédure d’insertion du tube PE-10 que pour les ratons AI, mais sans aucune solution et pendant la même durée (1 min).
      8. Remettre tous les ratons auprès de la mère immédiatement après avoir terminé la procédure pour le dernier raton de la portée. Ramener la mère au vivarium jusqu’à la prochaine séance d’alimentation (dans 2 h).
      9. Rincer le tube d’intubation intragastrique avec de l’eau stérile tiède et le replacer dans de l’alcool isopropylique à 70 % pour le stockage. Bien rincer le tube à l’eau avant chaque séance d’alimentation.
      10. Répéter les étapes 2.2 (sauf la pesée des ratons) à 2.2.2.9 pour la deuxième séance d’alimentation. Lors des deux derniers repas, intuber les ratons AI avec la solution de lait seul, en utilisant les mêmes volumes d’intubation déterminés à l’étape 2.2.
3. Peser les rats à intervalles réguliers, par exemple au JDP 15 (ouverture des yeux), JDP 21 (sevrage), JDP 30, JDP 60 et JDP 90 (chirurgie), afin d’obtenir des courbes de croissance représentatives.

3. Fabrication et modification des électrodes

1. Construire un « headstage » électromyographique (EMG) pour chaque rat (Figure 2). Le headstage permet l’enregistrement des réponses de clignement des yeux via le système de clignement (Figure 4).
   1. Construire un headstage composé de deux fils en acier inoxydable gainés de polytétrafluoroéthylène (PTFE) de taille 3T (5 cm chacun), d’un fil en acier inoxydable gainé de PTFE de taille 10T (5 cm), de trois broches mâles de contact et d’un isolateur de douille micro-ruban réduit à 3 trous (voir 3.1.4).
   2. Décapeter le revêtement en PTFE du fil 10T en saisissant le centre avec une pince à pointes cannelées de haute précision et en retirant le revêtement dans les deux sens à l’aide d’une pince lisse de haute précision. S’assurer que toutes les traces de revêtement ont été retirées de ce fil.
      1. Emmancher par sertissage une extrémité du fil 10T à une broche de contact à l’aide d’une pince dentée de précision ; ce fil servira de fil de masse. Tenir un fil 3T avec précaution à l’aide de la pince lisse de haute précision, à 1 à 1,5 mm d’une extrémité. Retirer le revêtement PTFE sur 1 à 1,5 mm tout en conservant intact le reste du revêtement. Sertir une broche de contact à l’extrémité dénudée du fil 3T.
      2. Reproduire les mêmes opérations pour le second fil 3T. Ces deux fils serviront respectivement d’électrodes positives et négatives pour l’enregistrement EMG.
   3. Effectuer des tests de traction sur tous les fils afin de s’assurer qu’ils sont solidement fixés aux broches. Prendre garde de ne pas plier ni endommager les fils.
   4. Couper un segment de ruban isolateur de douille à 3,5 trous (couper au milieu du quatrième trou) à l’aide de la lame de dénudation. Réduire ce segment à seulement 3 trous entiers et poncer les deux côtés si nécessaire. Cela permet de s’assurer que 3 trous complets sont disponibles. Insérer les unités broche-fil dans les trois trous du micro-ruban jusqu’à ce que les extrémités serties soient alignées avec le bord inférieur du segment isolant. L’ensemble 10T doit être placé dans un trou externe du micro-ruban, et non au centre.
2. Modifier les électrodes stimulantes bipolaires (Figure 2).
   1. Fournir une électrode stimulante bipolaire à chaque rat. Cette électrode applique une faible intensité de courant électrique via un isolateur de stimulus (voir système de clignement) comme stimulus non conditionné (US) pendant la conditionnement oculo-céphalique (ECC). Les électrodes sont fournies par un fabricant sous forme torsadée et sont blindées.
   2. Détordre les deux fils métalliques de 2 à 3 tours pour former une forme en V (écartement de 5 mm), puis utiliser la pince lisse de haute précision pour redresser chaque « branche » autant que possible. Gratter 1 mm de blindage à l’extrémité de chaque branche (tout autour) à l’aide d’une lame de rasoir. Examiner chaque branche pour détecter d’éventuelles irrégularités ou pliures, et corriger si nécessaire sans enlever de blindage supplémentaire.
3. Éliminer l’huile de fabrication et les débris étrangers des headstages EMG et des électrodes bipolaires en les lavant dans de l’alcool éthylique à 95 %. Les laisser sécher, puis les stériliser en autoclave.

Figure 2 : Électrodes d'enregistrement électromyographique (EMG) et électrode bipolaire. L'étage d'acquisition EMG terminé (à droite, orange) est constitué de trois broches mâles, de deux fils gainés de PTFE de taille 3T, d'un fil gainé de PTFE de taille 10T et d'une micro-bande modifiée. Les trois fils mesurent environ 5 cm chacun et sont sertis aux broches de contact. L'électrode bipolaire terminée (à droite, blanche) est défaite, redressée, puis moulée en forme de V (séparation de 5 mm). Le blindage est retiré des extrémités des deux branches. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

4. Procédure de chirurgie des paupières (jour postnatal 90)

1. Préparation du matériel (voir Matériel pour des informations détaillées), des animaux, ainsi que des zones chirurgicales et non chirurgicales :
   1. Stériliser les instruments et fournitures chirurgicaux au autoclave – le nombre entre parenthèses ( ) indique approximativement la quantité nécessaire par rat adulte ou la mesure : instruments chirurgicaux (1 jeu pour 4 rats, tel qu'approuvé par l'IACUC de l'ECU), compresses de gaze (3-4), cotons-tiges (5-6), drap de 20 x 20 cm (4 par séance chirurgicale), creuset en porcelaine (1), spatule microchirurgicale en acier inoxydable (1), solution saline à 0,9 % (1 flacon pulvérisateur), boîte de Pétri (1) et vis en acier inoxydable 0-80 (3/par rat).
   2. Autres fournitures stériles nécessaires : lame chirurgicale n°10 (1 pour 4 rats), champ opératoire (1 par rat), pommade ophtalmique vétérinaire, povidone-iodure (1 flacon pulvérisateur), aiguille hypodermique 26G x 3/8" (2), mandrin nickelé avec foret n°55, tournevis plat en laiton nickelé (lame de 1,8-2 mm).
   3. Préparer une zone de stockage stérile pour tous les outils et fournitures chirurgicaux à l’aide d’un désinfectant approuvé de qualité recherche/médicale. Placer les matériaux sur cet espace lorsque la zone est prête.
   4. Préparer un espace chirurgical stérile à l’aide d’un désinfectant approuvé de qualité recherche/médicale. Cet espace comprend un tapis chauffant à eau thermo-régulé, un appareil stéréotaxique équipé d’un masque d’anesthésie pour rat, un stérilisateur à billes de verre, et un vaporisateur de gaz isoflurane (pour l’anesthésie). Le vaporisateur est équipé de tubes reliant le masque d’anesthésie et une chambre d’induction située dans un espace séparé dédié aux procédures de préparation non stériles des animaux ; chaque tube est contrôlé par une vanne indépendante.
   5. Se laver soigneusement les mains et les avant-bras avec un savon antimicrobien. Sans toucher l’intérieur, pré-ouvrir tous les éléments emballés dans des pochettes ou des draps de stérilisation. Mettre des gants stériles selon une procédure aseptique et transférer tous les éléments pertinents vers la zone chirurgicale. Régler la profondeur du foret dans le mandrin (~ 2 mm) et préparer le tournevis. Recouvrir les matériaux stériles d’un drap stérile jusqu’à ce que la chirurgie soit prête à commencer.
   6. Préparer un espace non stérile équipé d’une balance, d’un tondeur électrique à poils, de seringues stériles de 1 mL avec aiguilles 26G x 3/8 po (1 par rat), d’un registre chirurgical, et de buprénorphine (concentration de 0,03 mg/mL) administrée à raison de 0,1 mL/100 grammes.
      ATTENTION : La buprénorphine est un opioïde semi-synthétique classé au tableau III par la DEA et doit être conservée sous clé et consignée de manière appropriée.
   7. Vérifier le niveau de gaz dans le vaporisateur d’isoflurane ; ajouter du gaz si nécessaire. Laisser les boutons de débit et de mélange éteints pour l’instant. Allumer la bouteille d’O₂ et s’assurer qu’il y aura suffisamment de gaz pour toutes les chirurgies.
   8. Peser chaque rat et noter son poids corporel dans le registre chirurgical. Utiliser un tableau d’injection de buprénorphine pour déterminer le volume d’injection approprié.
   9. Ouvrir la vanne du vaporisateur vers la chambre d’induction et laisser la vanne vers le masque chirurgical fermée. Régler le mélange sur 3 et le débit sur 3 (3 % d’isoflurane avec 100 % d’O₂ comme gaz vecteur à un volume de 3 L/min).
   10. Placer un rat dans la chambre d’induction et attendre qu’il atteigne le bon niveau d’anesthésie (respiration lente, absence de réflexe podal, absence de réflexe palpébral). Retirer le rat de la chambre une fois le plan anesthésique atteint.
   11. Raser la tête à l’aide du tondeur, en exposant suffisamment de peau pour le site d’incision et la paupière gauche. Si nécessaire, replacer l’animal dans la chambre d’induction pour retrouver le plan anesthésique avant de poursuivre le rasage.
   12. Assainir la peau exposée en effectuant trois applications alternées d’alcool isopropylique et de povidone-iodure. Si nécessaire, replacer l’animal dans la chambre d’induction pour retrouver le plan anesthésique avant de le transférer sur la table chirurgicale.
2. Chirurgie
   1. Ouvrir la vanne du vaporisateur vers le masque d’anesthésie et fermer celle vers la chambre d’induction. Régler le mélange sur 2,5 et le débit sur 2 (2,5 % d’isoflurane avec 100 % d’O₂ comme gaz vecteur à un volume de 2 L/min). Transférer le rat vers l’appareil stéréotaxique et suivre les procédures standard pour fixer sa tête à la barre incisive et aux barres auriculaires (voir Geiger et al., 2008⁴⁹ pour un exemple).
   2. Administrer au rat une injection préopératoire de buprénorphine (SC) et jeter soigneusement l’aiguille (non recouverte) dans un conteneur pour objets tranchants. Placer un champ opératoire stérile sur le rat, en ne laissant apparaître que la zone chirurgicale et en l’isolant du reste du corps.
   3. Mettre un masque chirurgical, une calotte, une blouse chirurgicale, des lunettes de protection et tout autre équipement de protection individuelle requis par l’IACUC. Se laver et se désinfecter soigneusement les mains et les avant-bras avec un savon antimicrobien. Mettre des gants stériles selon une procédure stérile.
   4. Appliquer une petite quantité de pommade ophtalmique sur les deux yeux à l’aide d’un coton-tige pour éviter qu’ils ne s’assèchent.
   5. Commencer la chirurgie lorsque le rat présente un plan anesthésique adéquat. Surveiller continuellement le rat pendant toute la durée de l’intervention et vérifier périodiquement le niveau d’isoflurane. Ajuster les boutons de débit et de mélange en fonction de la réponse du rat à l’anesthésie.
   6. Réaliser une incision antéro-postérieure le long de la ligne médiane du crâne à l’aide d’une lame de scalpel. Cette incision doit exposer une zone suffisante en avant des yeux (c’est-à-dire exposer l’os frontal) et légèrement en arrière de la suture lambdoïde.
   7. Gratter délicatement le périoste situé au-dessus du crâne sans provoquer de saignement excessif. Essuyer les tissus conjonctifs et le sang en excès avec un coton-tige.
   8. Perforer un trou à l’aide du foret et du mandrin, en commençant juste derrière la suture coronale sur un os pariétal. Retirer tout sang et débris osseux avec un coton-tige. Saisir une vis 0-80 par le filetage à l’aide de pinces à échardes et la fixer dans le trou à l’aide du tournevis de bijoutier ; serrer la vis suffisamment sans endommager le tissu cérébral cortical (généralement 3 à 4 tours complets).
   9. Reproduire les mêmes procédures décrites en 4.2.8 pour fixer deux autres vis 0-80 sur le crâne, une juste derrière la suture coronale de l’os pariétal opposé et une directement en avant de la suture lambdoïde droite. Il a été constaté que trois vis suffisent pour ancrer le ciment dentaire (voir 4.2.18) au crâne, car une quatrième vis (en avant de la suture lambdoïde gauche) gênerait le positionnement de l’électrode bipolaire.
   10. Retirer un étage de tête EMG de la boîte de Pétri. Orienter l’étage de tête de sorte que le fil 10T soit du côté droit du rat. Replier le fil 10T vers le haut, de manière à ce qu’il soit parallèle au bord inférieur de la micro-bande. Lui donner une légère courbure vers la droite afin que le fil puisse passer autour des vis 0-80 antérieure et postérieure. Le poser à côté, mais à portée de main.
   11. [En supposant que l’on soit droitier] Placer des pinces de pansement de 3 po dans la main gauche et des pinces de pansement de 4 po dans la main droite. Saisir la peau supérieure au niveau de l’incision de l’œil gauche avec les pinces de 4 po et diriger les pinces de 3 po vers le coin de cet œil ; saisir la peau à ce niveau. Maintenir la prise avec les pinces de 3 po tout en relâchant celles de 4 po.
   12. Prendre une aiguille de 26G x 3/8 po et l’insérer dans le coin de la paupière ; faire pivoter l’aiguille de sorte que le côté biseauté soit orienté vers le haut. Utiliser des pinces micro-dissectantes à plateau pour insérer le fil 3T central dans le trou de l’aiguille. Le pousser à travers le trou de quelques centimètres sans aller jusqu’au bout ; ce fil constitue la borne négative.
   13. Effectuer les procédures décrites en 4.2.11 et 4.2.12 pour insérer le fil 3T externe dans la partie médiane de la paupière ; ce fil constitue la borne positive.
   14. Saisir les deux aiguilles d’une main tout en tenant l’étage de tête de l’autre main (ou à l’aide de pinces). Tirer les aiguilles loin de la paupière tout en guidant l’étage de tête dans la même direction d’un seul mouvement continu. Si nécessaire, faire pivoter l’étage de tête de sorte que le fil 10T soit dirigé vers l’œil droit de l’animal ; veiller à ce que les fils 3T ne se croisent pas. Utiliser des pinces à pointe fine pour vérifier que la borne positive est bien au milieu de la paupière.
   15. Positionner l’étage de tête de manière à ce qu’il soit centré entre les yeux et placé de façon optimale sur l’os frontal, en avant des vis insérées bilatéralement. Tenir l’étage de tête d’une main et les pinces de pansement de 3 po de l’autre. Enrouler le fil 10T autour d’une ou des deux vis situées du côté 10T.
   16. Placer les pinces de pansement de 3 po dans une main et celles de 4 po dans l’autre. Utiliser les pinces de 3 po pour saisir la peau au niveau du site d’incision vers la tempe gauche. Utiliser les pinces de 4 po pour créer une petite « poche » en séparant la peau (c’est-à-dire le fascia superficiel) du muscle temporal. Utiliser des ciseaux à iris pour retirer davantage de tissu conjonctif, en travaillant vers le coin de l’œil gauche, afin d’agrandir cette poche. Faire attention de ne pas aller trop profondément ni sectionner de vaisseaux sanguins.
   17. Prendre une électrode bipolaire et façonner les fils conducteurs de manière à ce qu’ils puissent suivre la courbure du muscle temporal, tandis que les deux branches sont positionnées (dorsale et ventrale) en arrière de l’œil gauche (voir vidéo), et que l’extrémité inférieure de l’électrode bipolaire soit positionnée verticalement au-dessus du crâne. Prévoir une distance suffisante entre l’étage de tête et cette électrode pour permettre le raccordement des fiches du câble commutateur (Figure 3) sans entrave.
   18. Verser la poudre de ciment dentaire dans le creuset – commencer avec environ un tiers du creuset, puis ajuster la quantité selon les besoins. Ajouter le composant liquide jusqu’à obtention d’une consistance aqueuse, puis mélanger les deux composants à l’aide de la spatule. Lorsque la consistance du ciment devient plus visqueuse, l’appliquer sur le site d’incision – en recouvrant tous les bords de la peau avec une marge d’au moins 1/8 po.
       1. Appliquer suffisamment de ciment pour renforcer l’étage de tête et l’électrode bipolaire sans empêcher le rat de fermer complètement les yeux. Essuyer rapidement tout ciment qui coule sur des zones non désirées du pelage du rat.
   19. S’assurer qu’au moins 4 à 5 filets de l’électrode bipolaire restent non scellés par le ciment afin que la fiche bipolaire puisse être vissée (Figure 3). Retirer l’excès de ciment de l’étage de tête – le dessus de la micro-bande et les trois broches de contact doivent être propres. Le ciment durcit rapidement et pourrait facilement empêcher le raccordement complet de l’une de ces électrodes aux fiches du câble commutateur. Utiliser des pinces à échardes pour retirer l’excès de ciment partiellement durci.
   20. Attendre que le ciment durcisse ; il devient alors transparent. Utiliser des ciseaux micro-dissectants pour couper l’excès de longueur des deux fils 3T, en laissant quelques centimètres de marge de manœuvre.
   21. Tenir les pinces micro-dissectantes à plateau dans la main gauche et les pinces micro-dissectantes à pointe fine dans la main droite. Saisir un fil 3T avec les pinces de gauche légèrement en avant de la paupière. Avec les pinces de droite, pousser la paupière vers le haut pour exposer davantage de fil 3T et la maintenir en place. Relâcher les pinces de gauche et utiliser la main gauche pour saisir l’étage de tête (s’assurer qu’il est bien fixé à ce stade). Utiliser les pinces de droite pour retirer une partie du revêtement en PTFE, permettant ainsi au fil d’entrer en contact avec le muscle orbiculaire des paupières.
       NOTE : Faire attention de ne pas tirer trop fort sur un fil 3T, car il pourrait se détacher de la broche de contact. Si un fil se détache, il ne sera pas possible de remplacer la broche de contact, car le ciment durci ne se détachera pas librement du crâne sans provoquer de fracture osseuse.
   22. Effectuer les étapes décrites en 4.2.21 pour retirer l’excès de PTFE du second fil 3T.
   23. Tenir les deux pinces micro-dissectantes comme indiqué en 4.2.21 (à plateau à gauche, à pointe fine à droite). Positionner les pinces de gauche légèrement en avant d’un fil 3T tout en laissant de la place pour que les pinces de droite soient positionnées directement devant la paupière. Saisir le fil avec les deux pinces.
       1. Créer un « crochet » en maintenant les pinces de droite immobiles et en faisant pivoter les pinces de gauche vers le haut et autour de la paupière ; effectuer ce mouvement en une seule action. Relâcher soigneusement les pinces de droite, puis celles de gauche.
          NOTE : Le fait de crocheter les électrodes sur les paupières permet de réduire au minimum le risque qu’elles frottent contre la cornée. Cela diminue également le risque de rupture du fil à tout moment pendant la phase de tests comportementaux. Bien que le crochetage n’empêche pas complètement le frottement du fil contre la cornée chez tous les animaux, ceux-ci ne présentent généralement aucun signe de lésion oculaire, comme en témoignent leurs amplitudes de clignement élevées (mesurées par l’oscilloscope numérique en 5.1.7) et les observations quotidiennes de leur état de santé postopératoire (larmoiement excessif, fermeture partielle de la paupière, absence de mobilité due à une lésion oculaire). Si un rat présente des signes initiaux de gêne, il est anesthésié à l’isoflurane (voir 4.1.10) et ses électrodes sont réexaminées et/ou repositionnées. Une pommade ophtalmique est appliquée pour éviter que la cornée ne s’assèche. Le rat est observé quotidiennement pour détecter d’éventuelles complications oculaires postopératoires et, si celles-ci persistent, des soins vétérinaires doivent être prodigués. Les rats présentant des complications oculaires sévères qui ne peuvent être corrigées par repositionnement des électrodes ou par traitement vétérinaire sont euthanasiés de manière humanitaire conformément aux procédures opérationnelles standard de l’IACUC de l’ECU.
   24. Effectuer les étapes décrites en 4.2.23 pour le second fil 3T. Couper l’excès de fil à l’aide des ciseaux micro-dissectants.
   25. Utiliser une main pour libérer le rat des barres auriculaires tout en soutenant son corps avec l’autre main. Examiner la tête du rat pour détecter tout sang ou débris, nettoyer si nécessaire, et lui administrer une injection postopératoire de buprénorphine.
   26. Placer le rat dans un bac de récupération équipé d’une source de chaleur (comme un tapis chauffant thermo-régulé) pour faciliter la récupération. Noter l’heure de fin de chirurgie dans le registre chirurgical ainsi que toute observation pertinente concernant le rat pendant l’intervention. Surveiller le rat pour s’assurer d’une respiration normale et, lorsqu’il adopte une position sterno-abdominale ou commence à bouger, il peut être réintégré à sa cage d’origine.
   27. Re-stériliser les instruments (à l’exception des pinces micro-dissectantes – qui pourraient être endommagées) à l’aide du stérilisateur à billes et s’assurer que la zone chirurgicale reste aseptique ; répéter les procédures aseptiques si plusieurs chirurgies des paupières doivent être réalisées.

5. Procédure de conditionnement classique de clignement oculaire à trace

Figure 3 : Boîte de conditionnement opérant modifiée pour le conditionnement du clignement oculaire. Les rats sont des mammifères libres de leurs mouvements, et par conséquent, un commutateur rotatif est utilisé pour maintenir le contact du signal électrique en provenance des prises EMG et bipolaires fixées sur la tête. Le commutateur est relié au bras du support, qui est contrepesé afin de réduire la pression exercée sur le rat. Un tweeter piézoélectrique (haut-parleur) délivre un ton de 2,8 kHz à 85 dB, et ces valeurs sont régulièrement étalonnées. Une mousse acoustique contribue à atténuer le bruit ambiant. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Système de conditionnement palpébral. Ce système sur mesure comprend une unité d'intégration EMG qui filtre et amplifie les signaux entrants provenant des rats, une unité de contrôle des stimuli qui délivre divers stimuli en plus des sons et des chocs, un préamplificateur pour chaque boîte opérante afin d'augmenter le gain du signal EMG, et un isolateur de stimulus pour chaque boîte opérante ; il permet de fournir des niveaux de choc variables (en mA). Un oscilloscope numérique (non inclus dans le système de conditionnement palpébral standard) est utilisé à des fins de diagnostic pendant l'habituations et l'acquisition. Veuillez cliquer ici pour visualiser une version agrandie de cette figure.

1. Commencer l’habituation et l’entraînement d’acquisition 5 jours après la chirurgie. Donner à chaque rat un jour de manipulation et d’habituation à l’appareil d’entraînement – constitué d’une boîte de conditionnement opérant modifiée placée dans une chambre plus grande insonorisée (Figure 3) – puis procéder à 6 jours d’entraînement d’acquisition. Réaliser les séances d’habituation et d’acquisition à l’aide d’un système personnalisé de clignement des paupières (Figure 4).
   1. Créer un fichier journal d’entraînement et l’imprimer pour tenir un registre quotidien. Ce journal doit comporter les groupes de rats préaffectés pseudo-aléatoirement (ou selon une autre méthode de randomisation) à leurs boîtes d’entraînement.
   2. Allumer le système de clignement des paupières, l’ordinateur, puis lancer le logiciel de clignement des paupières. Cette version du logiciel comprend différents modules (ou applications) fonctionnant indépendamment. Exécuter le module Animal pour créer un fichier *.RAT contenant les informations sur le sujet (numéro de session, identifiant de l’animal, sexe, poids et numéro de boîte). Un seul fichier RAT gère jusqu’à quatre rats, ce qui constitue un groupe de sujets. Saisir les valeurs en conséquence et enregistrer le fichier. Créer un fichier RAT distinct pour chaque groupe de rats à entraîner.
   3. Transférer les rats de leur vivarium à la salle de test et fermer la porte. Manipuler chaque rat pendant 5 min.
   4. Transférer un rat dans sa boîte désignée et connecter les prises EMG et bipolaires du câble du commutateur à l’étage d’interface EMG et à l’électrode bipolaire correspondants sur sa tête.
      NOTE : Lors de la première exposition au câble du commutateur, un rat peut se débattre et montrer des signes de stress. Manipuler le rat avec précaution et prévoir des pauses entre des tentatives infructueuses de connexion afin d’atténuer son stress.
   5. Utiliser un commutateur pouvant pivoter à 360° tout en maintenant la transmission/réception du signal électrique pendant que le rat se déplace librement dans la boîte. Il comporte 5 canaux (3 pour les électrodes EMG, 2 pour les électrodes bipolaires) qui se connectent à l’unité intégrateur EMG, laquelle filtre et amplifie le signal brut.
   6. S’assurer que le rat se déplace librement et qu’il n’est pas gêné par le poids de l’assemblage du câble du commutateur ou du bras de support. Ajuster le contrepoids à l’arrière du support si nécessaire. Vérifier que toutes les connexions sont sécurisées, puis fermer la porte de la boîte. Effectuer la même procédure de connexion/contrôle pour tous les rats.
   7. Utiliser un oscilloscope pour observer leur activité EMG à la recherche de signaux anormaux (p. ex., activité électrique à haute fréquence et/ou haute amplitude) et un système de vidéosurveillance pour vérifier leur état (p. ex., activité motrice, sensibilité à l’environnement, signes de douleur), si disponible. Noter tout problème observé dans le journal d’entraînement.
   8. Laisser les rats s’habituer à leurs compartiments pendant 10 min, puis les ramener à leurs cages d’origine.
   9. Nettoyer et désinfecter les boîtes de conditionnement opérant, balayer le sol et nettoyer la(les) table(s). Effectuer ces procédures après chaque séance.
2. L’entraînement d’acquisition s’étend sur 6 jours consécutifs (séances).
   1. Jour 1 : Transférer un rat dans sa boîte désignée et connecter les prises EMG et bipolaires du câble du commutateur à l’étage d’interface EMG et à l’électrode bipolaire correspondants sur sa tête. Suivre les mêmes procédures indiquées aux points 5.1.6 et 5.1.7.
   2. Activer les isolateurs de stimulus et régler le courant à délivrer à 0,4 mA (4 % de 10 mA, comme indiqué dans la vidéo). Les isolateurs délivrent le courant électrique de manière alternée (c’est-à-dire d’un essai à l’autre) entre les broches dorsale et ventrale de l’électrode bipolaire. Cela permet de réduire la fatigue des fibres musculaires (à chaque site musculaire) lors de stimulations répétées.
   3. Observer toutes les réponses de clignement des paupières émises ainsi que les tolérances manifestées à chaque essai pour tous les rats. Après chaque deuxième essai, augmenter l’intensité du stimulus non conditionné (US) de 0,4 mA pour chaque rat, jusqu’à atteindre 1,6 mA (aux essais 7 et 8). Vérifier soigneusement que tous les rats réagissent normalement dans leurs boîtes, que tous les réglages d’amplification et de gain sont constants, et que les signaux électriques sont corrects (c’est-à-dire un bruit EMG faible ou négligeable). Utiliser une intensité de stimulus de choc de 1,6 mA pour tous les jours d’entraînement d’acquisition.
      NOTE : Si un rat manifeste de la douleur à un niveau de choc donné (p. ex., sauts élevés, escalade des parois, course effrénée), l’essai est interrompu et l’intensité est ramenée à la valeur précédente (0,4 mA en dessous) pendant deux essais. Ensuite, le rat recevra à nouveau la valeur de choc supérieure qu’il n’avait pas tolérée ; s’il la tolère, les valeurs augmenteront progressivement jusqu’à 1,6 mA. S’il ne tolère aucune valeur, la valeur inférieure suivante (par incréments de 0,4 mA) qu’il tolère sera utilisée tout au long de l’entraînement.
   4. Utiliser un oscilloscope pour observer leur activité EMG à la recherche de signaux anormaux (par ex., activité électrique à haute fréquence et/ou haute amplitude) et un système de vidéosurveillance pour vérifier leur état (par ex., activité motrice, sensibilité à l’environnement, signes de douleur).
      NOTE : Explication du conditionnement en trace ECC : Un exemple typique d’époque d’essai avec les formes d’onde EMG enregistrées est illustré dans la Figure 1 et la procédure de conditionnement en trace ECC est expliquée en détail dans la vidéo. Le fichier d’entraînement de conditionnement en trace est paramétré pour délivrer 100 essais (90 essais appariés CS-US et 10 essais CS seul tous les 10^e essais) avec un intervalle inter-essai moyen de 30 secondes. La séance d’entraînement dure environ 52 minutes (en supposant aucune interruption). Tous les rats sont naïfs lors de la session 1 et développeront des courbes d’apprentissage différentielles (déterminées par l’expression des RC) au fil des jours d’entraînement.
   5. Démarrer l’entraînement : Exécuter le module logiciel Blink. Lorsque demandé, sélectionner le bon fichier RAT et le fichier d’entraînement pour le conditionnement de clignement des paupières en « trace ».
   6. Noter l’heure de début et le nom de l’expérimentateur dans le journal d’entraînement. Surveiller à ce stade toute activité : signaux EMG corrects, bonnes réponses de clignement au stimulus de choc (US) (c’est-à-dire URs intenses/fréquents), état de santé des animaux et fonctionnement adéquat du matériel. Inscrire toute remarque pertinente dans le journal d’entraînement.
   7. La collecte des données est automatiquement enregistrée par le logiciel sous forme de fichiers RAW (un par rat et par jour). Les fichiers RAW contiennent l’amplitude EMG (en volts), les comptages de fréquence, la latence, ainsi que les données surfaciques pour les réponses de sursaut (SR), les UR et les RC (totales et adaptatives). L’artéfact de choc masque les 100 premiers ms de la période UR ; par conséquent, seuls les 140 derniers ms de la période UR contiennent des données UR.
   8. À la fin de l’entraînement, le logiciel se ferme automatiquement. Retirer tous les rats de leurs boîtes d’entraînement et les ramener à leur vivarium.
   9. Répéter les étapes 5.2.5 à 5.2.6 pour tous les jours d’entraînement suivants. Avant de lancer le module Blink un jour donné, mettre à jour le numéro de session dans le fichier RAT. Cela permet de créer de nouveaux fichiers RAW pour tous les rats ce jour-là. Chaque rat devrait avoir 6 fichiers RAW, en supposant qu’aucun n’ait été retiré de l’entraînement.
3. Traiter les fichiers RAW et créer un fichier filtré destiné à l’analyse statistique.
   1. Exécuter le module Analyse. Examiner chaque session pour chaque rat essai par essai afin d’identifier les essais problématiques. Cette étape permet de détecter les essais potentiellement compromis pour diverses raisons (par ex., activité de base excessive avant le CS, mouvements excessifs, détachement d’électrode, problèmes de câblage). Le logiciel dispose d’algorithmes qui aident l’expérimentateur à détecter et à supprimer les « mauvais essais » du jeu de données filtré.
   2. Importer les données filtrées dans un tableur et effectuer les analyses statistiques pertinentes.

Résultats

Le logiciel eyeblink est capable de fournir un ensemble vaste et complet de données pour de nombreux types de mesures. Par souci de concision, nous présentons dans cette étude, représentant résulte pour l’apprentissage et du rendement mesures incluant adaptative pourcentage CR, amplitude de CR adaptative, pourcentage d’UR et amplitude UR. La période CR adaptative a été choisie car il représente l’acquisition des réponses eyeblink opportune sur formation répétée, à la suite de la plasticité synaptique accrue dans l’hippocampe au cours de la trace ECC^50,51,52. Les mesures d’UR ont été choisis pour déterminer si les déficits néonatale induite par l’alcool apprentissage en trace ECC étaient dû à des perturbations dans l’apprentissage associatif ou des interruptions dans la réponse au choc nous - ce qui peut indiquer des différences de motivationnels ou moteurs, plutôt que d’apprentissage des différences entre les groupes de traitement. Pour chaque mesure ont été analysées à l’aide de 2 (sexe) x 3 (Neonatal Group) x 6 (Session) mixé ANOVA, avec Session comme le facteur de mesures répétées. Effets principaux significatifs pour le traitement néonatal ont été analysées à l’aide de tests post hoc de Tukey et interactions significatives ont été analysées à l’aide de tests simples effets. Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l’aide d’un niveau minimal d’alpha de 0,05 et résultats dans les graphes sont moyenne ± SEM

Commençant par la mesure de pourcentage CR adaptative, analyse de la variance indique un effet principal significatif du neonatal group, F(2,21) = 11,69, p < 0,001, mais sans effet principal du sexe (p = 0,71) ou d’une interaction significative entre ces facteurs (p = 0,20). Comme prévu, adaptative CR pourcentage a augmenté au cours des six sessions de formation, F(5, 105) = 81.15, p < 0,001 et les différences entre les groupes néonatales étaient dépendants à un certain niveau de session, F(10, 105) = 4.58, p < 0,001. Il n’y a aucune autre interaction importante mettant en cause le facteur de la session. De même pour adaptative amplitude CR, il y avait encore un effet principal significatif du neonatal group, F(2,21) = 22.32, p < 0,001, mais sans effet principal du sexe (p = 0,21) ou d’une interaction significative entre ces facteurs (p = 0,48). Amplitude de CR a aussi augmenté considérablement au cours des six sessions de formation, F(5, 105) = 59.27, p < 0,001 et les différences entre les groupes néonatales étaient dépendants à un certain niveau de session, F(10, 105) = 4.31, p < 0,001. Dans l’ensemble, ces deux mesures de CR ont montré des différences significatives entre les groupe des moyens et de ces moyens séparés significativement à différentes sessions de formation. Pour vérifier quels groupes diffèrent significativement, tests post hoc de Tukey ont montré que les rats [AI] alcool-intubé effectué sensiblement pire sur ces deux mesures CR que l’unintubated-(UC) rats témoins et sham-intubé (SI) (p < 0.01 pour pourcentage de CR ; p < 0,001 pour amplitude CR), qui ne diffère pas de l’autre (p> 0,05). Effets simples tests effectués sur le groupe néonatale importante x interactions de Session pour les deux mesures de CR, a confirmé que les rats AI portait une atteinte plus significativement dans l’acquisition de CRs commençant à 2 Session et exerçant son activité par le biais de Session 6 comparativement à des rats UC et de SI (tous p< 0,05), qui ne diffère pas de l’autre tout au long de six séances. La seule exception était adaptative amplitude CR pour rats SI n’a pas commencé à diffèrent sensiblement des rats AI jusqu'à 3 Session. Ces résultats sont présentés dans la Figure 5 a, 5 b.

Il n’y a aucune différence significative entre les mesures d’UR en raison de sexe, le groupe néonatale ou les interactions de ces facteurs avec le facteur de la session. Ces résultats négatifs ont indiqué que chaque groupe a été en mesure d’émettre des réponses eyeblink au choc nous également, et que les déficits d’apprentissage chez les rats AI n’étaient pas influencés par les différences de motivationnels ou moteurs à clignoter (Figure 6 a, 6 b).

Figure 5 : Acquisition de trace conditionné ayant répondu au questionnaire (moyenne ± SEM). Exposition à l’alcool au début (groupe IA) a considérablement affecté acquisition de pourcentage de réponse conditionnée adaptative (CR) (A) et l’amplitude (B). Trace ECC est intrinsèquement difficile à acquérir, c’est pourquoi les mesures sont relativement plus faibles pour tous les groupes - avec retard ECC, pourcentages peuvent atteindre 80 à 85 % dans les modèles de rongeurs de l’ETCAF^21,53. Néanmoins, la trace de la procédure de l’ECC est plus taxer sur l’hippocampe, qui est sensible aux effets de l’alcool pendant le développement précoce du cerveau. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001 entre les rats UC et l’IA ; la taille des échantillons est fournie entre parenthèses. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Acquisition des réponses inconditionnel (moyenne ± SEM). EyeBlink performance (pourcentage d’UR et l’amplitude de l’UR) n’était pas significativement différente entre les groupes. L’absence de différences indiquent que l’intensité du choc utilisée au cours de la formation de l’acquisition ne modifie pas différemment de motivation chez les rats AI ou leur capacité à produire défensive blink réponses au choc, comparé aux deux groupes de contrôle (UC et SI). La taille des échantillons est fournie entre parenthèses. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ratons nouveau-nés ayant reçu l’alcool éthylique pendant 4-9 jours exposé trace eyeblink conditionnement des déficiences à l’âge adulte. Ces résultats confortent l’idée que l’alcool est un agent tératogène avec immuable des effets néfastes sur la fonction de l’hippocampe. Dans l’ensemble, conditionnés répondant dans la procédure de trace était plus faible chez les rats exposés à l’alcool comparée à des rats dans les deux groupes témoins. Les troubles de l’apprentissage associatif chez les rats exposés à l’alcool n’ont pas été influencés par les différences de motivationnels ou moteurs (i.e., aucune différence en clignotant à l’intensité du choc U.S.).

Tandis que trace ECC est un outil diagnostique utile pour élucider neuropathologie hippocampe induite par le défi, les résultats de cette méthode doivent être placés dans le contexte approprié. Tout d’abord, les principaux éléments de procédures dans cette démonstration implique l’administration ciblée d’alcool pendant une fenêtre connue de vulnérabilité pour le cerveau en développement, la fabrication de matériel d’électrode qui permet l’enregistrement de l’activité électromyographique et délivre le choc, l’implantation chirurgicale du matériel susmentionné et l’expérimentation animale ultérieure à l’aide d’un paradigme d’apprentissage qui évalue une fonction cognitive d’intérêt. À chaque étape du processus, il faut ne pas causer de dommages inutiles/involontaire aux sujets rongeurs et de surveiller leurs signes de santé régulièrement. Leurs résultats comportements fournissent la « fenêtre » à la cognition, une construction psychologique qui n’est précisément décrit quand leur état de santé n’est pas compromise par les erreurs expérimentales qui englobe le dosage de l’alcool, les défauts de matériel ou implantation chirurgicale. Ainsi, chaque élément procédural dans le processus de recherche doit être implémentée de façon judicieuse afin de s’assurer que les résultats de l’ECC sont extrapolables à résultats chez l’homme. Deuxièmement, le paradigme de l’ECC donne un aperçu sur la nature de l’apprentissage associatif, mais il faut pas d’étendre les résultats à l’aide de cette approche et leur attribuer largement à d’autres domaines cognitifs - telles que la mémoire de travail, court/long terme souvenirs et conscience - à moins que l’un a incorporé certaines facettes de ces domaines au sein d’une étude de l’ECC par protocole expérimental. Par exemple, cette démonstration a examiné la phase d’acquisition de l’apprentissage ECC trace, mais n’examine pas la rétention de la mémoire chez les rats après qu’ils ont terminé la formation. La mémoire est donc un processus psychologique indépendant qui doit être évalué en plus de l’apprentissage. Par sa conception, on peut incorporer un intervalle de conservation de mémoire afin d’évaluer une capacité de mémoire à court terme ou à long terme. Troisièmement, la reconnaissance qu’il n’y a de systèmes de mémoire parallèle⁵⁴ qui peuvent fonctionner simultanément avec motivationnels, expérientiels et hormonales des facteurs qui contribuent au comportement, est essentiel pour comprendre que l’associativité (pendant ECC) est mais l’un des nombreux procédés qui révèlent ce qui est « bon » ou « mauvaise » sur l’apprentissage. Enfin, trace ECC n’est pas une tâche purement hippocampe-dépendantes, comme d’autres régions du cerveau pourraient véhiculer des composantes de la République tchèque. Ainsi, une compréhension des interactions entre les différents circuits neurones ou le type des paramètres de stimulation qui sont utilisés dans une étude, doit être tenu compte lors de répercussions sur base des résultats discrets. Le cervelet, par exemple, contribue également à tracer ECC, où elle influe sur les caractéristiques topographiques du CR et CR timing, particulièrement lorsque l’ISI est de court durée. Trace ECC n’est pas affectée chez les humains avec des dommages cérébraux qui sont testés avec un intervalle long trace (1 000 ms), mais est affectée chez les personnes qui reçoivent une plus courte trace intervalle (400 ms)³⁴. En outre, les lésions bilatérales du cortex préfrontal médial dorsale (MFPC) qui ciblent les régions antérieure agranulaires cingulaire et médiane chez la souris, prévenir l’acquisition de trace CRs⁵⁵, tandis que la destruction de la caudale MFPC chez le lapin produit similaires résultats⁴⁶. Ces résultats soulignent également l’importance d’examiner les différences entre les espèces préfrontal contributions au cerveau cervelet tige apprentissage associatif, comme trace ECC. Alors que dans cette étude et d’autres, l’exposition néonatale de l’alcool lors de l’acquisition de 4-9 nui PD de 500 ms trace CRs pour adulte rats^47,56, ce n’est pas le cas même pour les rats exposés à l’alcool néonatales que rencontrer un intervalle 300 ms de la trace, même lorsque contestée à une dose relativement élevée de l’alcool (5 g/kg)⁵⁷, ce qui suggère que la déficience de trace chez les rats exposés à l’alcool dépend de la durée de l’intervalle de la trace.

Dans cette étude, l’hippocampe a été soulignée comme étant d’une importance vitale pour la médiation de trace ECC et quand contestée par exposition à l’alcool néonatale, pièces dommages neuronaux liés, comme en témoigne les déficiences dans l’acquisition de trace CRs. Il doit toutefois, a averti que les circuits de tige de cerveau cervelet, particulièrement le nucleus interpositus, sont essentielle pour les nombreuses facettes de l’ECC, y compris l’acquisition, d’expression et des caractéristiques topographiques de la République tchèque, selon le type de tâche ECC dont trace ECC^{36,40,55,58,59}. En effet, ce circuit neuronal interagit avec l’hippocampe pour la conduite de l’expression des CRs lors de formes d’ordre supérieur d’ECC, tels que trace ECC⁶⁰. Si exposition à l’alcool pendant le développement précoce du cerveau affecte spécifiquement la fonction hippocampe dans trace ECC n’est pas entièrement clair. Plusieurs différentes régions du cerveau sont vulnérables au début insulte de l’alcool, y compris le MFPC, le cervelet et l’hippocampe^{18,19,23,47,61,62}, et il est très probable que l’alcool perturbe le fonctionnement de ces structures à des degrés divers et à varier, mais fonctionnellement importantes différences à travers de nombreuses procédures d’ECC. Malgré les obstacles concernant l’interprétation des résultats d’études ECC trace et acquisition réussie de trace CRs s’est avérée au moins compter sur un hippocampe intact, comme pris en charge par lésion animaux études^{42,44,63,64,65}. Cette procédure reste donc une approche très utile pour démontrer les liens entre l’exposition à l’alcool du développement à trace conditionné répond plus car les circuits neuronaux qui la sous-tendent, est beaucoup mieux comprise que celle des autres tâches hippocampe-dépendantes, telles que l’apprentissage de la place dans le labyrinthe de l’eau de Morris, reconnaissance des objets nouveaux et contextuelle et trace de conditionnement de la peur.

ECC comme une méthode comportementale pour « doser » cognition, a large applicabilité dans le domaine du développement neuroteratology. En effet, les découvertes récentes de notre laboratoire soutiennent l’idée que l’hippocampe en développement est très sensible aux effets de l’alcool, qui peuvent être atténuées par différentes stratégies interventionnelle^18,47. Le principal avantage ici, c’est qu’avec une meilleure compréhension des déficits d’apprentissage ECC trace induite par l’alcool, ils peuvent être prédictives d’autres problèmes dans les fonctions hippocampiques en dehors de l’apprentissage associatif - en particulier ceux connus pour être médiée par le même neuronaux hippocampe.

Application de trace ECC et ses autres variantes (p. ex., retard, inversion, discrimination, composée) pour élucider les mécanismes neurobiologiques et les systèmes neuronaux impliqués dans l’apprentissage associatif, peut être étendue au-delà du domaine de la recherche de l’alcool sur le fœtus. Par exemple, ce paradigme a reçu beaucoup d’attention dans les cas humains et des modèles animaux de troubles psychiatriques comme la schizophrénie^66,67, les maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer^68,,⁶⁹et les drogues d’abus^70,71,72. Ses avantages comme une méthode de recherche pour évaluer le dysfonctionnement et les fonctions neurocognitives ressortent donc nombreuses disciplines psychologiques et biomédicales, y compris des neurosciences.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
alcool éthylique à 190 degrés (USP)	Pharmco-AAPER	225-36000 [Entrepôt médical de l’ECU]	Peut être substitué ; doit être USP ; éviter d’utiliser de l’alcool éthylique à 200 degrés
Contenant/panier pour chiots	N’importe quelle
huile de maïs	N’importe quelle
pompe de thérapie par eau chauffée de qualité alimentaire avec	Tampons Gaymar	TP-500	Pour garder les chiots au chaud ; peut être substitué
Aiguilles hypodermiques 22G x 1 po, Stérile	Toutes les
aiguilles hypodermiques 30G x 1/2 po, Stérile	Tout
alcool isopropylique 70 %	EMD Millipore	PX1840-4 [Fisher Scientific]	Peut être substitué ; qualité réactif www.fishersci.com
Long-Evans Rats (reproducteurs femelles et mâles)	Charles River Laboratories	N/A [ECU Dept. of Comparative Medicine]	L’âge et le poids doivent être précisés ; le prix varie en fonction de ces facteurs www.criver.com
ciseaux de dissection, 3,5 po, lames de 23 mm	Instruments de recherche biomédicale	11-2200	Pour la coupe de tubes en PE brisurgical.com
Tubes en polyéthylène 10 (0,011 po. D.I. ; 0,024 pouce. D.O.)	BD Diagnostic Systems	22-204008 [Fisher Scientific]	Peut être substitué www.fishersci.com
Tube en polyéthylène 50 (0,023 po. D.I. ; 0,038 pouce. D.O.)	BD Diagnostic Systems	22270835 [Fisher Scientific]	Peut être substitué www.fishersci.com
Chauffe-eau régulé ou chauffe-biberon pour bébé	N’importe lequel		aide à réchauffer les solutions de lait froid
Seringues à tuberculine, stériles, 1,0 ml	Tous
Seringues à tuberculine, stériles, 10 ml	N’importe quel		Peut être utilisé pour prélever de l’alcool éthylique ou utiliser une micropipette de taille appropriée
Balance	N’importe quelle		Doit avoir une bonne résolution (en unités de grammes)
Name	Company	Catalog Number	Comments
EMG Headstage Fabrication et électrode bipolaire Électrode bipolaire
, 2 canaux en plastique torsadé SS	One, Inc.	MS303/2-B/SPC  ; ÉLIRE SS  ; 2C TW .008"	Doit spécifier une longueur personnalisée de 20 mm sous le piédestal www.plastics1.com
Centi-Loc Strip Socket Isolateur (alias, Micro Strip)	ITT Cannon / ITT Interconnect Solutions	CTA4-IS-60* ou CTA4-1S-60*	*Dépend du fournisseur ; voir www.onlinecomponents.com ou www.avnetexpress.avnet.com
Pince dentaire, dentelée	CMF Medicon	390.20.05	Peut être remplacé ; à utiliser pour sertir des fils sur des broches de contact mâles www.medicon.de
Ciseaux de dissection, 3,5 po, 23 mm Instruments de	recherche biomédicale	11-2200	À utiliser uniquement pour couper des fils 3T ; couper des fils 10T endommagera la lame - utilisez plutôt la lame de la pince à dénuder brisurgical.com
Fil d’acier inoxydable revêtu de PTFE, 10T (diamètre nu .010 in)	Sigmund Cohn-Medwire	316SS10T	www.sigmundcohn.com
Fil d’acier inoxydable revêtu de PTFE, 3T (diamètre nu 0,003 in)	Sigmund Cohn-Medwire	316SS3T	www.sigmundcohn.com
Lame de rasoir	N’importe laquelle		Pour dénuder 1 mm des broches de l’électrode bipolaire
Broche de contact de la prise Relia-Tac, Interconnexion Cooper mâle		220-P02-100	Voir Allied Electronics Cat # 70144761 www.alliedelec.com
Pince à épiler, haute précision, dentelée, 4 3/4 po	Microscopie électronique Sciences	78314-00D	Pour saisir fermement le fil 10T tout en dénudant le PTFE avec une pince à épiler lisse www.emsdiasum.com
Pince à épiler, Haute précision, Lisse, 4 3/4 po	Microscopie électronique Sciences	78313-00B	www.emsdiasum.com
Pince à épiler, pointes ultra fines, 4 3/4 po	Microscopie électronique	Sciences 78510-0	Pour dénuder 1 mm de PTFE d’une extrémité du fil 3T ; partie protégée par la pince à épiler lisse www.emsdiasum.com
Pince à dénuder, 16-26 AWG	N’importe quel Utilisez		l’extrémité de la lame pour couper des micro-bandes
Name	Company	Numéro de catalogue	Comments
Eyelid Surgery
Instruments chirurgicaux (acier inoxydable de haute qualité)
2 pinces à pansements, 4 pouces	Instruments de recherche biomédicale	30-1205	Peut être remplacée ; pinces supplémentaires pour saisir les électrodes/vis à l’extérieur du plateau chirurgical brisurgical.com
Pince à pansements, 3 pouces	Instruments de recherche biomédicale	30-1200	Peut être substitué brisurgical.com
Plateau d’instruments	Instruments de recherche biomédicale	24-1355	Peut être substitué brisurgical.com
Manche de couteau n° 3, 5 dans	Instruments de recherche biomédicale	26-1000	Peut être substitué brisurgical.com
Pince à dissectionnement micro, 3,5 po, Instruments	de recherche biomédicale	10-1630	Peut être substitué brisurgical.com
Pince à dissectionnement micro, 3,5 po, Plate-forme lisse (0,3 x 5 mm)	Instruments de recherche biomédicale	10-1720	brisurgical.com
ciseaux de dissection, 3,5 po, extrêmement délicats, lames de 15 mm Instruments de	recherche biomédicale	11-2000	Peut être substitué brisurgical.com
Pince à échardes ordinaires, 3,5 po  ;	Instruments de recherche biomédicale	30-1600	Peut être substitué brisurgical.com
#10 Lame chirurgicale en acier inoxydable pour poignée #3, stérile	N’importe laquelle		Peut être substitué
0-80 x 0,125 po Vis en acier inoxydable	Plastics One, Inc.	0-80 x 0,125	Peut être substitué www.plastics1.com
Tampons de préparation à l’alcool, stériles	Fisher Scientific	22-363-750 [Fisher Scientific	Peut être substitué www.fishersci.com
Bétadine, Povidone-Iodine,	Purdue Frederick Co.	6761815101 [Fisher Scientific]Peut	être substitué www.fishersci.com
Betadine Povidone-Iodine Prep Pads	Moore Medical	19-898-946 [Fisher Scientific]	Peut être substitué www.fishersci.com
Coton-tige Coton-Tige	N’importe quel		Généralement 7,6 cm ou 15,2 cm de longueur
Foret pour étau à goupille, #55 (0,052 po)	Tout		métal devrait résister à la rouille et à la corrosion
Tampons de gaze, 2 po x 2 po	Fisher Scientific	22-362-178 [Fisher Scientific]	Peut être substitué www.fishersci.com
Gants en latex/nitrile/vinyle à usage général	N’importe quel
Stérilisateur à billes de verre	Tous les		instruments de stérilisation entre les chirurgies
Pompe de thérapie par l’eau chauffée avec coussinets x 2	Gaymar	TP-500	Peut être remplacé ; des pompes séparées sont recommandées - 1 pour la chirurgie, 1 pour la récupération
Aiguilles hypodermiques 26G x 3/8 in, stérile	Tout
isoflurane	Vedco	NDC 50989-150-12	Manfacturer peut être substitué ; Une approbation vétérinaire peut être requise
Système de vaporisateur d’isoflurane, de table, sans respiration	Parkland Scientific	V3000PK	peut être remplacé www.parklandscientific.com
Jewelers Tournevis avec lame de 1,8 à 2 mm	Tout		métal doit résister à la rouille et à la corrosion
Ortho-Jet BCA Package (ciment dentaire)	Lang Dental	B1334	Contient de la poudre (1 lb) et du liquide www.langdental.com
Réservoir d’oxygène avec régulateur de pression, grand			fournisseur local
Creuset en porcelaine, de haute forme, émaillé, 10 ml	CoorsTek, Inc.	07-965C [Fisher Scientific]Peut	être remplacé par le creuset large Fisher FB-965-I www.fishersci.com
Pommade ophtalmique vétérinaire Puralube, Sterile	Henry Schein Company	NC0144682 [Fisher Scientific]	Peut être substitué www.fishersci.com
Quatricide PV-15	Désinfectant	Pharmacal PV-15	; peut être substitué www.pharmacal.com
Masques d’anesthésie au gaz de rat pour la chirurgie stéréotaxique  ;	Stoelting Company	51610	www.stoeltingco.com
Appareil stéréotaxique pour rats avec barres d’oreille (45 degrés)	Toutes		les barres de 45 degrés sont recommandées pour éviter d’endommager les tympans
Instrument chirurgical Roboz Milk	Roboz Surgical	NC9358575 [Fisher Scientific]	Peut être substitué ; pour lubrifier les instruments pendant l’autoclavage www.fishersci.com
Tondeuse à poils de rongeurs	Tout
chlorure de sodium	Fisher Scientific	S641-500 [Fisher Scientific]	Pour fabriquer 0,9 % de solution saline ; qualité de réactif ; USP www.fishersci.com
Microspatule en acier inoxydable (Lame : 0,75 L x 0,18 po. W)	Fisher Scientific	21-401-15 [Fisher Scientific]	Peut être substitué www.fishersci.com
Étau à goupille Starrett, 0,000 po - 0,055 po	Tout		nickelé ou équivalent recommandé pour résister à la rouille et à la corrosion
Gants chirurgicaux stériles	Tous
les emballages de stérilisation, 20 po x 20 po, autoclavables	Propper Manufacturing	11-890-8C [Fisher Scientific]	Utile pour l’emballage de fournitures autoclavables et sur un terrain stérile pendant la chirurgie www.fishersci.com
Champ chirurgical, stérile/autoclavable	Tout		Peut avoir besoin de couper à la taille pour les rats
Blouse chirurgicale*	Tout		requis par IACUC
Masque chirurgical	Toute
seringue à tuberculine, stérile, 1,0 ml	Toute
balance	Doit		avoir une bonne résolution (en unités grammes)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Système et composants Eyeblink (en supposant un système à 4 rongeurs)
Commutateur à 5 canaux x 4	Plastics One, Inc.	SL2 + 3C	www.plastics1.com
Câble d’électrode bipolaire, double 305 x 4	Plastics One, Inc.	305-305 80CM TT2 (C)	Fournit une extrémité enfichable à l’électrode bipolaire sur le rat et au collecteur ; doit être modifié www.plastics1.com
Câble, 5 canaux, blindé, 26 AWG x 4	Tout		Pour fabriquer le câble de collecteur ; cela doit être fabriqué à partir de zéro
Chambre pour boîte de test opérant (à l’intérieur : 24 H x 23 L x 14 P po) x 4	Med-Associates		Peut être remplacé ; les dimensions intérieures doivent s’adapter confortablement au boîtier de test opérant, avec de la place pour la mousse acoustique ; s’adapter avec ventilateur - 55-60 dB www.med-associates.com
Eyeblink Système et logiciel	JSA Designs	N/A	Propriétaire et personnalisé pour laboratoire de recherche
Gaine thermorétractable (3/16 po, 1/4 po, 3/8 po, 1/2 po de diamètre)	N’importe quel		Pour protéger les extrémités et les épissures soudées du câble de collecteur modifié,
Mousse acoustique à triple pic de mélamine avec hypalon noir (24 x 48 po)	McMaster-Carr	9162T5	Peut être remplacé ; coupé pour s’adapter à 4 chambres de logement www.mcmaster.com
Boîte de test opérante (extérieur 12,5 L x 10 l x 13,5 po H), complet x 4	Med-Associates	ENV-007 Ensemble personnalisé	avec plancher en grille en acier inoxydable et dessus personnalisé (trou de 3 po au centre pour le câble de commutateur) www.med-associates.com
Oscilloscope (en option)	N’importe quoi		Spécifications minimales recommandées : bande passante analogique de 200 MHz, échantillonnage en temps réel de 1 Géch./s, 4 canaux ; voir www.picotech.com /td>
Tweeters piézoélectriques (haut-parleurs) x 4 (7 x 3 in)	MCM Electronics	53-805	Doit correspondre aux spécifications de la gamme de fréquences pour le système de clignement des yeux (2500 Hz - 25 KHz) www.mcmelectronics.com
Station de soudage, Soudure, Flux, Étain	N’importe quel		Pour souder des câbles 26 AWG sur des prises femelles (qui s’adaptent aux broches de contact mâles relia-tac) et des prises bipolaires
Isolateurs de stimulus x 4	WPI International	A365	Ces unités fonctionnent avec des piles alcalines 16-9V ; une version rechargeable appropriée (A365R) est disponible www.wpiinc.com
Câble d’électrode tripolaire pour commutateur SL3C x 4	Plastiques Un, Inc.	335-335 80cm TT3 C	Fournit une extrémité enfichable à la tête EMG sur rat et au commutateur ; doit être modifié www.plastics1.com
USB Lumières LED x 4	Toutes les		lumières basées sur USB ne provoquent pas de « bruit » électrique avec les signaux EMG des rats www.plastics1.com
Webcams x 4, logiciel de surveillance	Tout
ordinateur PC exécutant le système d’exploitation MS Windows	Tout

Micro  ; Micro dentelés dentelés à pointes fines Micro antimicrobien *Si