Imagerie Neurones dans les sections du cerveau épais Utilisation du Golgi-Cox Méthode

Summary

Nous présentons un protocole d'utilisation de la méthode de coloration de Golgi-Cox dans des coupes de cerveau d'épaisseur, afin de visualiser les neurones avec de longs arbres dendritiques contenus dans des échantillons de tissus individuels. Deux variantes de ce protocole sont également présentées qui impliquent violet contre-coloration crésyl, et le gel des cerveaux non transformés pour le stockage à long terme.

Abstract

La méthode Golgi-Cox de coloration des neurones a été employé pendant plus de deux cents ans pour faire progresser notre compréhension de la morphologie des neurones dans les échantillons de cerveau histologiques. Bien qu'il soit préférable d'un point de vue pratique pour préparer des coupes du cerveau à la plus grande épaisseur possible, afin d'augmenter la probabilité d'identifier les neurones colorés qui sont entièrement contenus dans les sections individuelles, cette approche est limitée du point de vue technique par la distance de travail de haut -magnification objectifs de microscope. Nous rapportons ici un protocole pour colorer les neurones en utilisant la méthode Golgi-Cox dans des coupes de cerveau de souris qui sont coupées à une épaisseur de 500 um, et de visualiser les neurones tout au long de la profondeur de ces sections à l'aide d'un microscope droit muni d'une haute résolution 30X de silicone 1,05 NA objectif à immersion dans l'huile qui a une distance de travail de 800 um. Nous présentons également deux variantes utiles de ce protocole qui peut être utilisé pour la surface de contre-colorermonté des coupes de cerveau avec le colorant de Nissl violet de crésyle, ou de geler les cerveaux entiers pour le stockage à long terme avant la coupe et le traitement final. Le protocole principal et ses deux variantes produisent des coupes de cerveau épais tachés, tout au long de laquelle les arbres dendritiques complet des neurones et des épines dendritiques peuvent être de manière fiable visualiser et de quantifier.

Introduction

La visualisation des neurones individuels dans des échantillons de tissus permet de l'analyse in situ des caractéristiques morphologiques des neurones, ce qui a considérablement fait progresser notre compréhension du cerveau et comment elle peut être influencée par la maladie endogène ou des facteurs environnementaux exogènes. La méthode de coloration Golgi-Cox est un rapport coût-efficacité, des moyens relativement simples de coloration d'un échantillon aléatoire de neurones dans le cerveau. D' abord développé par Golgi ¹ et modifié par Cox ² dans les années 1800, les chercheurs ont affiné cette te....

Protocol

Des souris femelles CD1-souches adultes ont été utilisés dans cette étude. coloration similaire peut être réalisée en utilisant les deux sexes à différents âges. animaux expérimentaux ont été pris en charge selon les principes et les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux, et le protocole expérimental a été approuvé par l'Université de Guelph Comité de protection des animaux.

1. Golgi-Cox Staining

1. Golgi-Cox Imprégnation de cerveaux
   1. Ajouter la solution Golgi-Cox de 1% (p / v) de dichromate de potassium, 0,8% (p / v) chromate de potassium et 1% (p / v) de chlorure mercurique....

Results

Ce protocole de coloration Golgi-Cox et ses deux variantes décrites facultatifs peuvent être utilisés pour visualiser les neurones individuels à moins de 400 - 500 um d'épaisseur des coupes de cerveau. Image représentative des montages de deux dimensions Z-projections capturées en utilisant un objectif 10X et 5 um étapes de l'axe Z sont représentés sur la figure 1: A1 - C1 pour une grande surface de coupes cérébrales coronales qui comprend la zone de cortex cingulaire an.......

Discussion

Nous décrivons ici un protocole de coloration Golgi-Cox ainsi que deux variantes utiles pour visualiser les neurones dans les sections du cerveau épais. Comme le montrent les résultats représentatifs, l'utilisation d'un objectif à haute résolution qui a une longue 800 um distance de travail permet la visualisation fiable de l'ensemble des neurones tout au long de la profondeur des coupes de cerveau coupées à 500 um. Cette étude des coupes de cerveau relativement épaisses augmente la probabilité que les neuro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
dichromate de potassium	Fisher Scientific	P188-100	Chromate de
potassium	Fisher Scientific	P220-100	Chlorure
mercurique	Fisher Scientific	S25423
Papier filtre dangereux Whatman grade 1	Fisher Scientific	1001-185
isoflurane	Partenaires pharmaceutiques du Canada
Flacon à scintillation de 20 mL	Fisher Scientific	03-337-4
saccharose	Bioshop Canada	SUC700.1
phosphate de sodium monobasique	Sigma Aldrich	S5011-500G
phosphate de sodium dibasique	Sigma Aldrich	S9390-500G
Tube conique de 50 mL	Fisher Scientific	12-565-271
isopentane	Fisher Scientific	AC126470010	Aussi connu sous le nom de 2-méthylbutane ; gélose dangereuse
	Sigma Aldrich	A1296-100G
petite parabole	Fisher Scientific	02-202-100
vibratome	Leica	VT1000 S Plaques
culture tissulaire à 6 puits	Fisher Scientific	08-772-1b
inserts de culture tissulaire à fond grillagé	Fisher Scientific	07-200-214
paraformadelhyde (PFA), 16 %	Electron Microscope Sciences	15710-S	Hydroxyde
d’ammonium	Fisher Scientific	A669S-500	Fixateur Kodak dangereux
A	Sigma Aldrich	P7542
superfrost plus lames	Fisher Scientific	12-550-15
Décapant CitroSolv	Fisher Scientific	22-143-975
alcool éthylique anhydre	Alcools commerciaux	N/A
crésyl violet	Sigma Aldrich	C1791
permount	Fisher Scientific	SP15-100
microscope
droit modèle Olympus BX53Caméra couleur, 12 bits	MBF Biosciences	DV-47d	QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
Platine, contrôleur et émetteurs de microscope motorisé 3D	MBF Biosciences	N/A	Livré et intégré au microscope par MBF Biosciences
Objectif de microscope 4X	Olympus	4x 0.16 N.A. UplanSApo
10X Objectif de microscope	Olympus	10x 0.3 N.A. UPlan FL N  ;
Objectif microscope 30X	Olympus	30x 1.05 N.A. UPlanSApo  ;
Objectif de microscope 60X	Olympus	60x 1.42 N.A. PlanAPO N
huile d’immersion silicone	Olympus	Z-81114
Logiciel Neurolucida	MBF Biosciences	Version 10
Logiciel ImageJ	U.S. National Institutes of Health	Version actuelle	Avec le plug-in OME Bio-Formats installé
Logiciel	PhotoshopVersion d’Adobe	CS6