Article de méthode

Maturation des cardiomyocytes dérivés de cellules souches humaines dans la stimulation électrique Biowires utilisant

DOI :

10.3791/55373

⸱

6 mai 2017

 , 
1Toronto General Research Institute, University Health Network, 2Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 3Heart & Stroke/Richard Lewar Centre of Excellence, University of Toronto, 4Laboratory of Medicine and Pathobiology, University of Toronto

Dans cet article

Résumé

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La plate - forme BIOWIRE cardiaque est un procédé in vitro utilisé pour arriver à maturité embryonnaire humain et induit des cardiomyocytes dérivés de cellules-souches pluripotentes (HPSC-CM) en combinant la culture de cellules en trois dimensions avec une stimulation électrique. Ce manuscrit présente la configuration détaillée de la plate-forme BIOWIRE cardiaque.

Résumé

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Les cardiomyocytes à base de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC-CM) ont été une source cellulaire prometteuse et ont donc encouragé la recherche de leurs applications potentielles dans la recherche cardiaque, y compris la découverte de médicaments, la modélisation de la maladie, l'ingénierie tissulaire et la médecine régénératrice. Cependant, les cellules produites par des protocoles existants présentent une gamme d'immaturité par rapport aux cardiomyocytes ventriculaires adultes adultes. De nombreux efforts ont été faits pour maturité des HPSC-CM, avec une maturation modérée atteinte jusqu'ici. Par conséquent, un système d'ingénierie, appelé biowire, a été conçu en fournissant des indices physiques et électriques pour conduire les CMH-CM à un état plus mature in vitro . Le système utilise une plate-forme microfabricée pour semer les hPSC-CM dans le gel de collagène de type I le long d'une suture de modèle rigide pour assembler en tissu cardiaque aligné (biowire), qui est soumis à une stimulation de champ électrique avec une fréquence progressivement croissante. Par rapport aux contrôles non stimulés,stimulées biowired cardiomyocytes présentent un degré accru de maturation structurelle et électrophysiologiques. Ces changements dépendent du taux de stimulation. Ce manuscrit décrit en détail la conception et la création de biowires.

Introduction

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la thérapie à base de cellules est l'une des stratégies les plus prometteuses et une enquête pour parvenir à la réparation / régénération cardiaque. Il a été aidé par l' ingénierie tissulaire cardiaque et la co-livraison de 1, 2 biomatériaux. La plupart des sources cellulaires disponibles ont été étudiés dans des modèles animaux pour leurs effets potentiellement bénéfiques sur endommagés, malades ou âgés de 3 coeurs. En particulier, des efforts importants ont été faits pour utiliser les cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) cardiomyocytes (HPSC dérivée de-CM), une source de cellules autologues potentiellement illimitée pour l'ingénierie tissulaire cardiaque. HPSC-CMS peut être produite en utilisant plusieurs protocoles établis 4, 5, 6. Cependant, les cellules obtenues présentent des phénotypes de type foetaux, avec une gamme de caractéristiques immatures par rapport à des cardiomyocytes ventriculaires adultes 7, 8. Cela peut être un obstacle à l'application de HPSC- en tant que modèles de CMs tissu cardiaque adulte dans la recherche de la découverte de médicaments et dans le développement de modèles de maladies cardiaques adultes 9.

Afin de surmonter cette limitation de l'immaturité phénotypiques, de nouvelles approches ont été étudiées activement pour favoriser la maturation des cardiomyocytes. Les premières études ont révélé des propriétés efficaces pro-maturation dans les cardiomyocytes de rats nouveau - nés par mécanique cyclique 10 ou la stimulation électrique 11. Le compactage du gel et de la stimulation mécanique cyclique ont été montrés également à améliorer certains aspects de la maturation HPSC-CM 12, 13, avec la mise en valeur minimale des propriétés de manipulation et de calcium électrophysiologiques. Par conséquent, un système de plate-forme appelée « fil biologique » (de BIOWIRE) a été conçu en fournissant les deux signaux de structure et champ électrique stimulationn pour améliorer la maturation des HPSC-CM 14. Ce système utilise une plate-forme microfabriqué pour créer un tissu cardiaque alignés qui se prête à une stimulation de champ électrique. Cela peut être utilisé pour améliorer la maturité structurelle et électrophysiologique de HPSC-Cms. Nous décrivons ici les détails de fabrication de ces biowires.

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Protocole

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1. Maître Conception et fabrication

REMARQUE: Utilisez la lithographie douce pour la fabrication de l'appareil. Faire un SU-8 à deux couches maître pour le moulage de polydiméthylsiloxane (PDMS).

  1. Concevoir l'appareil à l' aide d' un logiciel de conception et de rédaction (figure 1A, gauche). Dessiner chaque couche du maître séparément. Imprimer la conception du dispositif sur deux photomasques à 20.000 dpi, correspondant aux deux couches du maître 15. Régler le motif de dispositif en tant que transparent et la région environnante aussi sombre; les masques servira de matrice pour transférer optiquement le motif de dispositif sur SU-8 par lithographie (comme décrit par d' autres 15).
  2. Répartir environ 4 mL de SU-8 50 sur le centre d'une plaquette de silicium de 4 pouces. Enduire la uniformément SU-8 50 sur la tranche en utilisant une tournette par centrifugation à 2.000 tours par minute (RPM) pendant 30 s. Faire cuire au four la pastille sur une plaque chauffante à 95 ° C pendant 10 min. Exposer la plaquette aux rayons ultraviolets (UV) lilutte à 200 mJ / cm 2.
  3. Verser environ 4 mL de SU-8 2050 sur le centre de la tranche et la rotation à 2500 tours par minute pendant 30 s. Faire cuire au four sur la plaque chauffante 95 ° C pendant 15 min. Laisser refroidir à température ambiante (RT).
  4. Répétez l'étape 1.3 deux fois de plus.
  5. Couvrir la plaquette revêtue de la première couche de transparence photomasque. Exposer la tranche à de la lumière UV à 270 mJ / cm 2 pour faire la première couche. Faire cuire au four sur la plaque chauffante 95 ° C pendant 15 min.
  6. Faire de la seconde couche de SU-8 2050 en répétant l'étape 1.3 à deux reprises.
  7. Aligner le masque de deuxième couche pour les caractéristiques sur la première couche en utilisant un aligneur de masque. Ensuite, exposer à la lumière UV à 240 mJ / cm2. Faire cuire au four à 95 ° C pendant 15 min.
    NOTE: Le temps d'exposition est déterminé par la dose d'UV totale requise et l'intensité de sortie de lumière UV mesuré le jour avant l'utilisation.
  8. Développer la plaquette en la plongeant dans de l'acétate de propylène glycol monométhyl éther (PGMEA) et agitation à 200 tours par minute pendant 30 min sur un agitateur orbital.
  9. Endroitle maître dans une boîte de Petri et soigneusement verser le mélange PDMS (base d'agent de reticulation à un rapport de 10: 1 en poids) sur le centre de la plaquette. Couvrir toutes les caractéristiques et éviter les bulles d'air.
  10. La chaleur dans un four à 70 ° C pendant 2 h. Utiliser une lame tranchante pour découper le pourtour du modèle de BIOWIRE PDMS (Figure 1A, à droite). Peler les PDMS du maître. Couper le dispositif avec la lame. Placez le modèle de BIOWIRE PDMS dans un sachet de stérilisation et autoclave à vapeur à 121 ° C pendant 20 min.
  11. Dans une enceinte de sécurité biologique (BSC), placez le PDMS BIOWIRE modèle dans une boîte de Petri. Utiliser des pinces pour tenir et fixer un morceau de fil de suture en soie chirurgicale stérile (6-0) dans le centre du canal de la cupule PDMS par celui - ci des sièges dans les rainures au niveau des deux extrémités du canal (figure 1B-I).

2. Création de la Chambre de stimulation électrique

  1. Faire une paire de pièces de polycarbonate rectangulaire (longueur x largeur x épaisseur: 2 cm x0,85 cm x 0,35 cm) et les utiliser en tant que trame de la chambre de stimulation électrique (figure 2).
  2. Percer deux trous de 3 mm de largeur 2 cm de distance le long de la ligne centrale de chaque pièce de cadre en polycarbonate.
  3. Coupez deux morceaux de tiges de carbone longue de 1,5 cm. Percer un trou de 1 mm de largeur à travers la tige de carbone d'environ 3 mm de l'extrémité. Enfiler un fil de platine à travers le trou de la tige de carbone et serrer le fil en l'enroulant autour de la tige de carbone. Attacher une pince à l'autre extrémité du fil de platine pour une connexion ultérieure avec le stimulateur électrique.
  4. Insérer les tiges de carbone dans les parties de cadre de polycarbonate. Placer le cadre assemblé avec des tiges de carbone dans un puits d'une plaque à six puits.
  5. Verser 2 ml de PDMS dans le puits. Immerger le bas des cadres de polycarbonate dans PDMS tout en maintenant le niveau de la surface PDMS proche mais pas d'atteindre le fond des tiges de carbone. La chaleur dans un four à 70 ° C pendant 2 h.
  6. Prenez la chambre de stimulation électrique des six-Bien plaque et le mettre dans une poche de stérilisation pour la stérilisation à la vapeur à 121 ° C pendant 20 min.

3. Dissociation des HPSC-Enzymatic CMs

  1. Provoquer HPSC de se différencier en cardiomyocytes à l' aide d' un protocole établi 4.
    NOTE: En bref, générer des cardiomyocytes via des protocoles corps embryoïdes (EB) établi dans la tige support pro travers la supplémentation séquentielle avec la protéine morphogénétique osseuse 4, le facteur de croissance des fibroblastes basique, l' activine A, le facteur de croissance endothélial vasculaire, et Dickkopf homolog 1 4. Utilisez du jour 20-34 EBs de différenciation pour faire biowires.
  2. Recueillir les EBs de la plaque de fixation basse avec une pointe de pipette de P1,000 et transférer dans un tube conique. Pellet par centrifugation pendant 5 minutes à 125 xg et RT. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot avec pré-chauffé à 37 ° C collagénase de type I contenant 1% de désoxyribonucléase I (DNase I). Incuber à 37 ° C pendant 2 hpour la digestion.
  3. Ajouter 5 mL de pré-chauffé à 37 ° C milieu de lavage et centrifugation pendant 5 minutes à 125 xg et RT. Jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot avec une solution de 2 ml d'acide trypsine / éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et incuber à 37 ° C pendant 5 min.
  4. Ajouter 1 ml de milieu d'arrêt contenant 3% (v / v) DNase I.
  5. Fixer une aiguille 20 G (0,9 mm) à une seringue de 5 mL et passer la suspension à travers elle EB 3-5 fois.
  6. Ajouter 7 ml de milieu de lavage et centrifugation à 280 g pendant 5 min. Jeter le surnageant. Remettre en suspension le culot dans un milieu (IMDM) de Dulbecco modifié par Iscove et stocker sur la glace. Déterminer le nombre de cellules avec un hémocytomètre. Prendre 0,5 x 10 6 cellules et culot par centrifugation à 280 xg pendant 5 min. Retirer le surnageant.
  7. Pré-refroidir tous les composants du gel sur la glace avant de les mélanger dans un tube stérile. Mélanger les composants du gel de collagène suivants (concentration finale): 2,1 mg / ml de collagène de type de queue de rat I, 24,9 mM de glucose, 23,8 mM de NaHCO 3, 14,3 mM NaOH, 10 mM de HEPES et 10% de la matrice extracellulaire dans du milieu M199 1x. Ajouter la matrice extracellulaire de collagène et dernier. Mélanger par pipetage de haut en bas.
  8. Remettre en suspension 0,5 x 10 6 cellules avec 3,5 pL de gel de collagène et bien mélanger.
  9. Utiliser un embout de pipette P10 pour ajouter 4 pi de la suspension cellulaire dans 0,5 cm de long canal (figure 1B-II). Ajustez la position de la suture avec une pince stérile si nécessaire.
  10. Couvrir le fond de la boîte de Pétri avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile, en prenant soin de ne pas toucher le gel. Incuber à 37 ° C pendant 30 min.
  11. Remplacer le PBS avec 12 mL de milieu de culture (par exemple, la tige pro ou un milieu recommandé par le fabricant de la cellule), suffisamment pour recouvrir les cellules (figure 1B-III). La culture dans un incubateur à 37 ° C pendant 1 semaine. Changer le support tous les jours.

4. La stimulation électrique pour BIOWIRE Culture

  1. Dansle BSC, ajouter 2 ml de PBS à chaque puits d'une plaque à six puits qui hébergera une chambre de stimulateur électrique. Utiliser des pinces stériles pour placer délicatement le dispositif de stimulation électrique à l'autoclave dans le puits. Jeter le PBS du puits.
  2. Couvrir les tiges de carbone avec 5 ml de milieu de culture préchauffé. Utiliser des pinces stériles pour monter les biowires dans la chambre de stimulation électrique et les orienter perpendiculairement aux tiges de carbone (figure 2).
  3. Placer le couvercle sur le dessus de la plaque à six puits, mais laisser des fils de platine suffisantes atteignant l'extérieur de la plaque pour se connecter avec le stimulateur électrique. Placer la plaque à six puits dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ° C et connecter le fil de platine au stimulateur électrique.
  4. Stimuler les biowires en utilisant un stimulateur électrique avec le réglage suivant: impulsion biphasique répéter, 1 ms durée d'impulsion, 3 V / cm, et une impulsion par seconde (PPS). Soulever le PPS toutes les 24 h pour les valeurs suivantes: 1,83, 2,66, 3,49, 40,82, 5,15 et 6. Changer le support tous les jours.
  5. Observer la contractilité des cardiomyocytes en réponse à une stimulation électrique sous un microscope à un grossissement de 10X.
    NOTE: Après une semaine de stimulation, les biowires devient mature (voir la section des résultats).

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Résultats

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La raison pour l'utilisation d'un fil de suture dans les biowires est de servir de matrice pour la formation de constructions en 3D qui correspondent à un axe et imitent la forme de fibres cardiaques. Nous montrons que , après sept jours de culture dans le BIOWIRE, les cellules remodelés le gel autour de la suture (figure 3A). Les cellules assemblées le long de l'axe de la suture pour former un tissu cardiaque alignés (figure 3). Après 7 jours de précult...

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Discussion

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Ce manuscrit décrit l'installation et la mise en œuvre de la plate-forme d'ingénierie, biowire, pour améliorer la maturation des CMH-CM. Le dispositif peut être fabriqué dans des installations de microfabrication standard, et les biowires peuvent être produits avec des techniques communes de culture cellulaire et un stimulateur électrique.

À notre connaissance, il n'y a pas de méthode rapportée semblable à celle de Biowires. Cette stratégie révèle que les propriétés de maturation...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu'ils ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par une subvention de l'État du cœur et la Fondation des maladies du Canada (G-14-0006265), les subventions de fonctionnement des Instituts de recherche en santé (137352 et 143066), et une subvention de la Fondation JP Bickell (1.013.821 ) à SSN.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide L-ascorbiqueSigmaA-4544hPSC-CM tissu de milieu de culture
AutoCADAutodesk, IncLogiciel pour concevoir dispositif
Tiges de carbone, Ø ; 3 mmComposant de la chambre de stimulateur électrique
Collagène, type 1, queue de ratBD Biosciences354249Gel de collagène : 2,1 mg/mL de collagène de queue de rat de type I dans 24,9 mM de glucose, 23,8 mM de NaHCO3, 14,3 mM de NaOH, 10 mM d’HEPES, dans 1 milieu M199 avec 10 % de Matrigel réduit en facteur de croissance.
Collagénase de type I  ;SigmaC01300,2 % de collagénase de type I (p/v) et 20 % de FBS (v/v) dans le PBS avec Ca2+ et Mg2+. Stériliser avec 0,22 &mu ; m filtrer et faire des aliquotes de 12 mL. Conserver à -20 ° ;C.
Désoxyribonucléase I (DNase I)EMD Millipore260913-25MUProduire 1 mg/mL de solution mère de DNase I dans l’eau. Filtrer stérile et stocker les aliquotes de 0,5 mL à &minus ; 20 ° ; C
Forets et forets (& Oslash ; 1 mm et 2 mm)DremelTrous de perçage dans des cadres en polycarbonate
Stimulateur électriqueHerbes88x
Sérum fœtal bovin (FBS)WISENT Inc.080-450
D-(+)-Glucose  ;SigmaG5767Composant gel de collagène
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030081
H2OMilliQ18.2 M&Omega ; &point moyen ; cm à 25 ° ; C, ultra-pur, pour réaliser toutes les solutions
HEPESSigmaH4034Composant de gel de collagène
Plaque chauffanteTorrey PinesHS40
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)Thermo Fisher Scientific12440053
Aligneur de masqueEVG  ;EVG 620
Matrigel, facteur de croissance réduit  ;Corning354230Composant de gel de collagène
Medium 199 (M199)Thermo Fisher Scientific11825015Composant de gel de collagène
Monothioglycérol (MTG)SigmaM-6145hPSC-CM Tissu de milieu de culture
Agitateur orbitalVWR89032-088
Pénicilline/Streptomycine (P/S)Thermo Fisher Scientific15070063
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec Ca2+ et Mg2+nbsp ;14040133Thermo Fisher Scientific
(6 puits)353046Corning
(6 puits), faible fixationCorning3471
Platinum, 0,2 mmcomposant de la chambre de stimulateur électrique
Polydiméthylsiloxane (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Propylène glycol monométhyl éther acétate (PGMEA)Biche & Ingalls Inc.Pour développer le sachet de plaquette
convertisseursà ouverture pelable92308Pour la stérilisation à la vapeur
de la plaquette de silicium, 4 poucesUniversityWafer Inc.
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)SigmaS5761Composant gel de collagène
Hydroxyde de sodiumSigmaS8045Composant gel de collagène
Sprin CoaterSpecialty Coating SystemsG3P-8
StemPro-34 Milieu de cultureThermo Fisher Scientific10639011Milieu de culture hPSC-CM. Pour faire 50 ml, ajoutez 1,3 ml de supplément, 500 &mu ; L de 100× ; L-Glutamine, 250 &mu ; L de 30 mg/mL de transferrine, 500 &mu ; l de 5 mg/mL d’acide ascorbique, 150 &mu ; L de 26 &mu ; l /2 mL de monothioglycérol (MTG), et 500 &mu ; L (1 %) pénicilline/streptomycine.
Milieu de lavage :FBS (1:1)
SU-8 50  ;MicroChem Corp.résine photosensible, composant maître
SU-8 2050  ;MicroChem Corp.photorésine, composant maître
TransferrineRoche10-652-202Composant de milieu de culture hPSC-CM
Trypsine/EDTA, 0,25 %Fisher Scientific25200056Composant de milieu de culture hPSC-CM
MilieuIMDM contenant 1 % de pénicilline/streptomycine
Plaque Plaque , fils , , les Thermo de lavage

Références

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