La méiose est le processus de développement par lequel les gamètes sont constituées par une seule tournée de réplication de l’ADN et de deux cycles successifs de la ségrégation des chromosomes. La méiose chez les mammifères peut être examinée en utilisant une technique pour préparer les tartinades méiotique. Ici, nous démontrons une méthode de préparation des étalements de noyaux de spermatocytes de souris.
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Article de méthode
Préparation des chromosomes à la méiose se propage de Spermatocytes de souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
La méiose chez les mammifères est un processus de développement dynamique qui se produit dans les cellules germinales et peut être étudié et caractérisé. Utilisant une méthode pour propager les noyaux à la surface des lames (plutôt que de tomber d’une hauteur), nous démontrons une technique optimisée sur les spermatocytes de souris qui a été décrite en 1997. Cette méthode est largement utilisée en laboratoire pour étudier la méiose chez les mammifères, car il donne une pléthore de noyaux de haute qualité en sous-stades de la prophase I. séminifères tubules sont d’abord placés dans une solution hypotonique à gonfler les spermatocytes. Puis les spermatocytes sont lâchés dans une solution de saccharose pour créer une suspension de cellules, et les noyaux dispersés sur lames de verre trempé fixateur. Après immunomarquage, une diversité de protéines se rapportant aux processus méiotiques peut être examinée. Par exemple, les protéines du complexe synaptonémal, une structure tripartite qui connecte les axes/carottes de chromosomes homologues entre eux peuvent être facilement visualisées. Les protéines de recombinaison méiotique, qui sont impliqués dans la réparation des cassures double brin de l’ADN de recombinaison homologue, peuvent également être immunocolorées pour évaluer la progression de la prophase I. Ici nous décrire et démontrer en détail une technique largement utilisée pour étudier les mammifères méiose dans les spermatocytes de souris mâles juvéniles ou adultes.
Introduction
Souris sont utilisés intensivement comme un organisme modèle pour étudier la méiose chez les mammifères. Le processus du développement normales et défauts qui se produisent au cours de la méiose peuvent être évaluées. La chronologie et la progression des traits saillants qui se produisent au cours de la prophase I et sous-stades, ainsi une multitude de protéines spécifiques impliqués dans les processus essentiels à la régulation de la méiose peut être caractérisé en tant de type sauvage et de souris mutantes. Plusieurs procédés spécialisés qui se produisent au cours de la méiose, que je peux être étudié en détail (examinée par Haendel et Schimenti1
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Protocole
Toutes les méthodes impliquant la souris utilisent éthiques élevées et des normes relatives au bien-être et ont été approuvés par le Comité de l’urbanisme à la faculté de médecine de l’Université de Drexel et d’institutionnels animalier.
1. préparation des solutions et des instruments nécessaires
- Préparer le tampon d’Extraction hypotonique (HEB) dans 50 mL d’eau de qualité laboratoire ultrapure, pH 8,2-8,4 (tableau 1). Faire la solution fraîche chaque fois, rester sur la glace et utiliser moins de 2 h de préparation des pâtes à tartiner ; Cela est nécessaire pour optimiser la réduction et la protéase empêchant les activités de TNT....
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Résultats
La capacité de cette méthode pour fournir un grand nombre de surface répartis noyaux contenant homologues intacts dépend de trois facteurs principaux : 1) temps d’incubation appropriés des tubules séminifères dans du tampon hypotonique (c.-à-d. HEB) pour obtenir correctement gonflé spermatocyte les noyaux qui éclatent, mais se désagrège pas de prolongée d’incubation dans Hébreux, 2) micropipetting les gouttes de saccharose de cellules pour obtenir une suspension séparée des noyaux qui ne .......
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Discussion
Pour obtenir un nombre élevé de noyaux spermatocyte bien étalées, de bonne qualité, les étapes plus critiques du présent protocole incluent le temps d’incubation appropriés des tubules séminifères dans HEB, hacher des tubules séminifères, appropriée et de la technique employée pour étend la suspension cellulaire de saccharose sur les diapositives enduit fixatif. Nous Incuber les tubes séminifères des testicules des mâles type sauvage allant de jour après la naissance 15 à l’âge adulte dans HEB pendant 45 min, tandis que .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient l’assistance technique de Abigail Harris. Ils reconnaissent aussi Paula Cohen et Kim Holloway pour aider à optimiser le protocole de préparation des étalements de noyaux de spermatocytes de souris. Les auteurs apprécient également une lecture critique du manuscrit par Karen Schindler.
Ce travail a été soutenu par les NIH R01 GM106262 à K.M.B.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16 % Paraformaldéhyde (solution aqueuse de formaldéhyde) | Microscopie électronique Sciences | RT 15710 | Diluer la solution à 16 % dans des supports à 4 % avec 1X PBS et congeler les aliquotes à -20 ° ; C |
| Lames à 3 anneaux imprimées en téflon | Microscopie électronique Sciences | 63418-11 | |
| Lames en verre dépoli de qualité supérieure à extrémité dépolie non chargée | Plusieurs marques | Nettoyez les lames dans de l’alcool éthylique ou isopropylique et laissez-les égoutter avant de les utiliser ; étiquetez les lames sur l’extrémité givrée avec un marqueur permanent ou un crayon en fonction de l’utilisation ultérieure des lames | |
| Ciseaux chirurgicaux (pointes pointues et émoussées) | Outils | de science fine14001-12 | marque différente d’un type similaire fonctionnera |
| Ciseaux chirurgicaux à pointe fine (pointes pointues) | Outils de science fine | 14058-11 | marque différente d’un type similaire fonctionnera |
| Pince à pointe fine droite | Outils de science fine | 11050-10 | marque différente d’un type similaire fonctionnera |
| Pince à pointe moyenne incurvée | Fisher | 16100110 | Une marque différente d’un type similaire fera l’affaire |
| Manche de scalpel | Outils scientifiques fins | 10003-12 | Une marque différente d’un type similaire fonctionnera |
| Souris anti-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Utilisation à 1:300 |
| Protéine anti-centromère (dérivée du sérum de patient humain CREST) | Anticorps incorporés | 15-234-0001 | Utilisation à 1:50 |
| Chambre | Nous utilisons des plats de culture carrés Nunc 500 cm2/puits avec du papier humidifié serviettes | ||
| Microscope à grand champ avec épifluorescence | Microsystèmes | Tout modèle standard | |
| Bocaux Coplin | Plusieurs marques | Capacité de 50 ml ; 40 mm (1,6 po) de diamètre, peut contenir 10 lames (dos à dos) | |
| Boîtes de Pétri | Plusieurs marques | 100 x 15 mm de diamètre, polystyrène stérile non traité |
Références
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spre....
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Réimpressions et autorisations
