Préparation des chromosomes à la méiose se propage de Spermatocytes de souris

Résumé

La méiose est le processus de développement par lequel les gamètes sont constituées par une seule tournée de réplication de l’ADN et de deux cycles successifs de la ségrégation des chromosomes. La méiose chez les mammifères peut être examinée en utilisant une technique pour préparer les tartinades méiotique. Ici, nous démontrons une méthode de préparation des étalements de noyaux de spermatocytes de souris.

Résumé

La méiose chez les mammifères est un processus de développement dynamique qui se produit dans les cellules germinales et peut être étudié et caractérisé. Utilisant une méthode pour propager les noyaux à la surface des lames (plutôt que de tomber d’une hauteur), nous démontrons une technique optimisée sur les spermatocytes de souris qui a été décrite en 1997. Cette méthode est largement utilisée en laboratoire pour étudier la méiose chez les mammifères, car il donne une pléthore de noyaux de haute qualité en sous-stades de la prophase I. séminifères tubules sont d’abord placés dans une solution hypotonique à gonfler les spermatocytes. Puis les spermatocytes sont lâchés dans une solution de saccharose pour créer une suspension de cellules, et les noyaux dispersés sur lames de verre trempé fixateur. Après immunomarquage, une diversité de protéines se rapportant aux processus méiotiques peut être examinée. Par exemple, les protéines du complexe synaptonémal, une structure tripartite qui connecte les axes/carottes de chromosomes homologues entre eux peuvent être facilement visualisées. Les protéines de recombinaison méiotique, qui sont impliqués dans la réparation des cassures double brin de l’ADN de recombinaison homologue, peuvent également être immunocolorées pour évaluer la progression de la prophase I. Ici nous décrire et démontrer en détail une technique largement utilisée pour étudier les mammifères méiose dans les spermatocytes de souris mâles juvéniles ou adultes.

Introduction

Souris sont utilisés intensivement comme un organisme modèle pour étudier la méiose chez les mammifères. Le processus du développement normales et défauts qui se produisent au cours de la méiose peuvent être évaluées. La chronologie et la progression des traits saillants qui se produisent au cours de la prophase I et sous-stades, ainsi une multitude de protéines spécifiques impliqués dans les processus essentiels à la régulation de la méiose peut être caractérisé en tant de type sauvage et de souris mutantes. Plusieurs procédés spécialisés qui se produisent au cours de la méiose, que je peux être étudié en détail (examinée par Haendel et Schimenti¹). Il s’agit d’ADN cassure double brin (DSB) formation et réparation, recombinaison, formation de complexes synaptonémaux et ségrégation des chromosomes.

Un aspect important d’étudier le processus méiotiques est la capacité d’examiner des noyaux contenant des chromosomes homologues qui sont visuellement et optiquement ont décidé de mieux distinguent et identifient les événements de la prophase I est composée de 5 sous-stades de la Prophase I. qui se distinguent par des caractéristiques spécifiques, y compris la formation du complexe synaptonémal (SC). Le SC est un échafaudage de protéine tripartite qui permet le couplage et la réparation de cassure double brin d’ADN homologues. Pendant leptonema, homologues alignement comme éléments axiaux du SC sont fixées. Puis fixation des éléments centraux du complexe synaptonémal lors du zygotène facilite la connexion de l’appariement et physique (Synapse) entre des paires d’homologues. Au cours de pachytène, synapsis homologues devient complet et véhicules multisegments ADN sont formés d’une réparation d’une population de sélectionner des cassures double brin de l’ADN par recombinaison homologue. Le SC désassemble pendant diplonema, permettant aux homologues à desynapse mais restent attachées à leurs centromères et sur les sites de véhicules multisegments ADN. Enfin, au cours de la diacinèse, homologues recondenser et la transition à la métaphase¹.

Historiquement, l’étalement en surface de chromatine méiotique ont donné peu de noyaux, en particulier ceux des premiers stades de la prophase I². Par conséquent, ces méthodes ont été modifiés afin d’améliorer la séparation des cellules provenant de tissus (testicules ou ovaires), la technique de propagation de la chromatine méiotique et le rendement des noyaux méiotiques de haute qualité pour l’évaluation^{2,3, 4}. en outre, cette méthode s’est avérée utile dans la préservation nucléaire et la chromatine lié protéines dans les noyaux méiotiques tel que démontré par immunolocalisation publiées techniques^5,6,7. Par conséquent, la méthode décrite par Peters² initialement et démontré ici rendements plusieurs noyaux de spermatocytes rafale distinct contenant des homologues subissant les sous-stades leptotène, zygotène, pachytène, diplotène et diacinèse de la prophase I.

La technique de préparation des étalements de noyaux (également appelés analyse de propagation de chromatine) est largement utilisée pour étudier la méiose dans les domaines de la reproduction et la biologie cellulaire. Diapositives contenant des étalements noyaux peuvent être par la suite immunomarquage avec les anticorps dirigés contre les protéines d’intérêt ou soumis à la coloration à l’argent et ensuite analysées au microscope. La méthode est similaire chez les souris mâles et femelles, bien que les modifications ont été décrites pour les souris femelles². Il faut ne pas overmince les tubes séminifères. Noyaux doivent également être bien étalé afin que la suite immunostaining homologues et protéines associées sont bien visibles au microscope. Étalements noyaux peuvent être préparés en quelques heures et un immunomarquage immédiatement ou stockées à-80 ° C pendant un maximum de 3 semaines avant le dégel et immunostaining. Cependant, des résultats optimaux sont mieux obtenues pour certaines protéines si immunostaining est effectuée immédiatement ou dans les 2 semaines de préparation des étalements noyaux. Diapositives peuvent être immunomarquage avec un protocole standard à l’aide d’anticorps dirigés contre les protéines d’intérêt, suivie d’une incubation avec les conjugués à fluorescent protéines Anticorps secondaires ainsi que les teintures, puis photographié avec la microscopie de fluorescence⁸. À jour après la naissance 15-21, il y a suffisamment tissulaire par paire de testicules de type sauvage de céder 6-10 diapositives, et souris âgées (y compris les adultes) donneront plusieurs diapositives. Cependant, souris de type sauvage 6 semaines et plus aussi produira plus post méiotiques cellules (c'est-à-dire les spermatides) sur les diapositives suite immunostaining. En outre, tous les événements de la prophase je peux être observé chez les souris adultes et juvéniles. Les testicules des mâles à 10 à 15 jours donnera beaucoup plus de cellules leptotène et zygotène. Souris plus vieux que le jour après la naissance 14 à 15 produira plus noyaux pachytène et le diplotène.

Ici nous décrivons et démonstration d’une méthode largement utilisée de la préparation des étalements de noyaux de spermatocytes de souris.

Protocole

Toutes les méthodes impliquant la souris utilisent éthiques élevées et des normes relatives au bien-être et ont été approuvés par le Comité de l’urbanisme à la faculté de médecine de l’Université de Drexel et d’institutionnels animalier.

1. préparation des solutions et des instruments nécessaires

1. Préparer le tampon d’Extraction hypotonique (HEB) dans 50 mL d’eau de qualité laboratoire ultrapure, pH 8,2-8,4 (tableau 1). Faire la solution fraîche chaque fois, rester sur la glace et utiliser moins de 2 h de préparation des pâtes à tartiner ; Cela est nécessaire pour optimiser la réduction et la protéase empêchant les activités de TNT et de PMSF, respectivement. Utiliser 10 mL d’HE pour chaque paire de testicules de souris.
2. Préparer une solution de saccharose de 100 mM (frais chaque fois) en ajoutant 0,342 g de saccharose à 10 mL d’ultrapure laboratoire eau de qualité. Ajuster le pH à 8,2
3. Préparer la solution de fixation (paraformaldéhyde à 1 % (PFA), 0,15 % Triton X-100, pH ajusté à 9.2 avec 1 N HCl ou NaOH N 1) frais mensuels et magasin à la température ambiante abri de la lumière. Diluer un 16 % dans le commerce PFA départ stock disponible à 4 % en 1 X PBS pour utilisation comme un stock de travail et ensuite stocker les aliquotes de 4 % à-20 ° C.
   1. Pour préparer la solution de fixation, ajouter 10 mL de solution à 4 % PFA et 600 µL de 10 % Triton X-100 à 30 mL de solution de 1 PBS X, bien mélanger et ajuster le pH à 9.2 avec 1 N HCl ou NaOH N 1. Stocker la solution de fixation dans un tube conique de 50 mL, enveloppé dans du papier d’aluminium à température ambiante (pour pas plus de 4 semaines).
4. Préparer des solutions de lavage (alors que les diapositives sont séchage des 30 dernières minutes) avec Photo-Flo 200 : 0,4 % Photo-Flo 200/PBS (320 µL de 200 Photo-Flo dans 80 mL de solution 1 PBS X) et 0,4 % Photo-Flo 200/dH₂O (160 µL de 200 Photo-Flo dans 40 mL d’eau de qualité laboratoire ultrapure). Utilisez une coloration de 50 mL contenant 40 mL de solutions pour les lames de 10 ou moins à la fois.
5. Préparer les instruments suivants : 1 paire de ciseaux chirurgicaux (à inciser la peau), 1 paire de ciseaux chirurgicaux de pointe fine (à inciser le péritoine), 2 paires de pinces de pointe droite fine (à disséquer sur chaque testicule), 1 droite lame de rasoir (à inciser chaque testicule), 2 paires de courbe pointe pince (pour immobiliser chaque testicule et faire sortir les tubules séminifères), pots de 50 mL Coplin, téflon imprimé 3 glissières à anneau, 1 scalpel avec lame de taille 11, chambre humidifiée, Pétri 100 x 15 mm, marqueur permanent pointe fine ou un crayon et un agitateur-secoueur rotatif.
   1. Prime de place sans inculpation prélavée lames de verre dépoli fin verticale dans une jarre de Coplin 50 mL remplie de solution de fixation jusqu'à l’utilisation.
      NOTE : Crayon est préférable si les diapositives seront utilisés ultérieurement dans les procédures nécessitant l’éthanol, telles que l’hybridation de fluorescence in situ .

2. propagation des noyaux spermatocyte

1. Euthanasier une souris mâle selon les lignes directrices (p. ex. dislocation cervicale avec ou sans CO₂ asphyxie).
2. Utilisation P10 - P20 mâles afin d’évaluer les cellules méiotiques dans la première vague de la spermatogenèse ; Nous utilisons systématiquement P15 - P17 mâles pour obtenir des cellules de tous les événements de la prophase I. testicules adultes fournira les cellules de la prophase I trop, mais ils donneront également des cellules plus post-méiotique, comme les spermatides.
3. Récolter et peser les testicules (noter les poids appariés) ; puis rangez-les dans une boîte de Pétri contenant quelques gouttes d’HE de froid pour les garder humides.
4. Tenez les testicules contre le fond du plat avec une pince embout incurvé et utiliser un grattoir à lame droite pour faire une incision médiane verticale petit dans la capsule du testicule. Tout en maintenant les testicules contre le fond du plat avec une pince, utiliser un deuxième ensemble de pince embout incurvé ou un grattoir à lame droite à presser doucement les tubules séminifères des testicules.
   1. Placer les tubes dans un tube conique 15 mL contenant 10 mL d’HE froid, en ayant soin d’éviter de mettre les morceaux de la capsule dans le tube. Répétez ces étapes avec le second testicule.
5. Incuber les tubes séminifères décapsulés dans le tube à fond conique contenant HEB sur glace pendant 30 à 60 min, selon la taille des testicules. Incuber les tubes séminifères à partir d’une paire de testicules pesant 30 mg ou moins de 30 min, les tubules d’une paire de testicules peser de 31 à 50 mg pendant 30 à 45 minutes et de plus gros testicules pendant 60 minutes. Ne modifient pas le temps pour un seul testicule.
   Remarque : Le temps d’incubation optimale peut varier selon l’expérience de l’expérimentateur, les réactifs utilisés et les souris sont analysées.
6. Tandis que les tubes séminifères sont en incubation dans HEB, utiliser un feutre ou un crayon pour marquer les extrémités givrées de diapositives prélavées avec souris numéro, numéro de la diapositive et date. Puis placez les diapositives préalablement nettoyés dans une coloration contenant la solution de fixation.
7. Après incubation, versez tubules et HEB dans une boîte de Petri propre et distincts tubules en touffes de diamètre environ 3 mm. Chaque touffe donne 2 toboggans et le nombre de diapositives donné dépend de la taille des testicules.
   Remarque : On obtient 8 lames de type sauvage et 6 diapositives de subfertile Chtf18-null testicules P16 (qui sont plus petits en raison du nombre a diminué de⁸de la méiose et la mitose des cellules germinales). Un testicule adulte pesant 100 mg ou plus devrait céder 16 diapositives.
8. 23 place µL de solution de saccharose de 100 mM sur un même anneau d’un téflon imprimé, 3 anneau de glissement et ajouter un bouquet de tubes séminifères à l’anneau.  Puis à l’aide de courbe pointe pince pour tenir le bouquet, mâcher doucement les tubules avec une lame de rasoir taille 11 jusqu'à ce que la solution devient trouble.
   Remarque : Overmince pas que cela se traduira par des chromosomes fragmentés. Notez que les chromosomes fragmentés peuvent aussi être indicatives d’un phénotype mutant.
9. Enlever les débris, ajouter un autre 23 µL de solution de saccharose et utiliser une micropipette pour Pipetez doucement le mélange monte et descend plusieurs fois pour aider à séparer les cellules de la suspension.
10. Supprimer une diapositive trempage dans la coloration contenant la solution de fixation et incliner la lame sur le pot alors qu’une gouttelette généreux recueille au coin inférieur de la lame.
    1. Pipeter 20 µL de suspension cellulaire saccharose de la bague de la diapositive d’imprimé 3 bague Téflon dans la goutte fixateur sur une prime givré lame de verre et pipette la suspension haut et bas de 2 - 3 fois.
       Remarque : La goutte fixateur doit être suffisamment grande volume afin que l’ajout de 20 μL de la suspension cellulaire de saccharose qui lui permet une couverture à travers l’ensemble de la diapositive lorsque le mélange est répandu (voir 2.11 ci-dessous).
11. Lentement, incliner la lame vers le côté opposé de la gouttelette à répandre la suspension cellulaire sur toute la longueur de la lame. Puis, lentement inclinez la lame arrière pour répandre la suspension cellulaire le long de la largeur de la lame pour le couvrir complètement. Éviter la propagation de la suspension sur la même zone de la diapositive plus d’une fois par ailleurs, que les cellules seront chevaucheront entre eux.
12. Immédiatement, placez la lame plate dans une chambre humidifiée et répétez les étapes 2.8 à 2.11 jusqu'à toutes les touffes des tubules séminifères ont été utilisés pour faire des diapositives. Il est important de ne pas déplacer la chambre humidifiée lors du séchage pour éviter le déchirement et le chevauchement des cellules.
13. Laisser les lames à incuber dans une chambre humidifiée couverte à température ambiante pendant 2,5 heures afin qu’ils sèchent lentement et pas complètement. Forte humidité et un séchage lent dans cette étape sont importants pour assurer une diffusion adéquate de la chromatine. Puis retirez le couvercle de la chambre et laisser les lames sécher complètement un supplémentaire de 30 min à.
14. Placer les lames (dos à dos ou dans un motif en zigzag) dans une coloration contenant une solution de PBS de Photo-Flo 200/1 X 0,4 % et les deux fois, les lames 5 min chacun, en agitant doucement le Coplin jar sur une plate-forme rotative shaker. Utiliser la solution fraîche pour chaque lavage et garder diapositives de souris différentes dans des cuves séparées pour chacun de la lave.
15. Laver les lames dans une coloration contenant 0,4 % Photo-Flo 200/dH2O solution pendant 5 minutes une fois tout en agitant.
16. Retirer les lames de la Coplin jar (dernier lavage), essuient soigneusement les bords et le fond des diapositives pour enlever l’excès de liquide et placer les lames en position inclinée, presque verticale sécher. Un expérimentateur qui parle couramment cette technique peut traiter et préparer des étalements noyaux provenant de souris de 4 ou 5 en une seule journée.
17. Une fois sec (15-20 min), traiter les diapositives immédiatement pour immunofluorescence souillant ou conserver à-80 ° C dans une boîte de diapositive hermétiquement fermé, abrie de la lumière pour un maximum de 3 semaines (selon les protéines cibles envisagées ; résultat optimal peut être obtenu si teint le même jour, soit moins de 2 semaines).
    1. Si stocké à-80 ° C, puis laisser des lames à température ambiante et lavez dans une coloration contenant 1 X PBS ou bloc pendant 5 min avant la coloration.
       Remarque : Plusieurs protocoles de coloration différentes immunofluorescence fournira de bons résultats ; se référer à Berkowitz et coll. pour un immunomarquage protocole⁸.

Résultats

La capacité de cette méthode pour fournir un grand nombre de surface répartis noyaux contenant homologues intacts dépend de trois facteurs principaux : 1) temps d’incubation appropriés des tubules séminifères dans du tampon hypotonique (c.-à-d. HEB) pour obtenir correctement gonflé spermatocyte les noyaux qui éclatent, mais se désagrège pas de prolongée d’incubation dans Hébreux, 2) micropipetting les gouttes de saccharose de cellules pour obtenir une suspension séparée des noyaux qui ne ...

Discussion

Pour obtenir un nombre élevé de noyaux spermatocyte bien étalées, de bonne qualité, les étapes plus critiques du présent protocole incluent le temps d’incubation appropriés des tubules séminifères dans HEB, hacher des tubules séminifères, appropriée et de la technique employée pour étend la suspension cellulaire de saccharose sur les diapositives enduit fixatif. Nous Incuber les tubes séminifères des testicules des mâles type sauvage allant de jour après la naissance 15 à l’âge adulte dans HEB pendant 45 min, tandis que ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Photo-Flo 200	Kodak	1464510
16 % Paraformaldéhyde (solution aqueuse de formaldéhyde)	Microscopie électronique Sciences	RT 15710	Diluer la solution à 16 % dans des supports à 4 % avec 1X PBS et congeler les aliquotes à -20 ° ; C
Lames à 3 anneaux imprimées en téflon	Microscopie électronique Sciences	63418-11
Lames en verre dépoli de qualité supérieure à extrémité dépolie non chargée	Plusieurs marques		Nettoyez les lames dans de l’alcool éthylique ou isopropylique et laissez-les égoutter avant de les utiliser ; étiquetez les lames sur l’extrémité givrée avec un marqueur permanent ou un crayon en fonction de l’utilisation ultérieure des lames
Ciseaux chirurgicaux (pointes pointues et émoussées)	Outils	de science fine14001-12	marque différente d’un type similaire fonctionnera
Ciseaux chirurgicaux à pointe fine (pointes pointues)	Outils de science fine	14058-11	marque différente d’un type similaire fonctionnera
Pince à pointe fine droite	Outils de science fine	11050-10	marque différente d’un type similaire fonctionnera
Pince à pointe moyenne incurvée	Fisher	16100110	Une marque différente d’un type similaire fera l’affaire
Manche de scalpel	Outils scientifiques fins	10003-12	Une marque différente d’un type similaire fonctionnera
Souris anti-SYCP3	Abcam	ab97672	Utilisation à 1:300
Protéine anti-centromère (dérivée du sérum de patient humain CREST)	Anticorps incorporés	15-234-0001	Utilisation à 1:50
Chambre			Nous utilisons des plats de culture carrés Nunc 500 cm2/puits avec du papier humidifié serviettes
Microscope à grand champ avec épifluorescence	Microsystèmes		Tout modèle standard
Bocaux Coplin	Plusieurs marques		Capacité de 50 ml ; 40 mm (1,6 po) de diamètre, peut contenir 10 lames (dos à dos)
Boîtes de Pétri	Plusieurs marques		100 x 15 mm de diamètre, polystyrène stérile non traité

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