Rationalisé unicellulaire TCR isolement et génération des vecteurs rétroviraux pour In Vitro et In Vivo Expression de TCRs humaines

Résumé

Le cours combine protocole unicellulaire jumelé humain séquençage de TCR alpha et bêta de chaîne avec simplifié génération des vecteurs rétroviraux compatibles avec l’expression de TCR in vitro et in vivo .

Résumé

Bien que plusieurs méthodes de séquençage d’appariés T cell receptor (TCR) alpha et bêta chaînes de cellules T ont été développés, aucun jusqu'à présent ont été propices à l’aval en vivo analyse fonctionnelle des hétérodimères TCR. Nous avons développé un protocole amélioré basé sur une PCR en deux étapes de multiplex imbriquées, qui se traduit par un produit PCR qui s’étend sur les régions variables entières d’une chaînes humaines TCR alpha et bêta. Par identification des sites de restriction uniques et leur intégration dans les amorces PCR, nous avons fait le produit PCR compatible avec direct sous clonage dans le vecteur rétroviral de modèle. La construction rétrovirale qui en résulte encode une chimérique humain/souris TCR avec un domaine intracellulaire de la souris, qui est fonctionnel dans les cellules de souris ou de modèles de souris in vivo . Dans l’ensemble, le protocole décrit ici combine humaine seule cellule jumelé TCR alpha et bêta chaîne identification avec génération simplifiée des vecteurs rétroviraux aisément adaptables pour l’expression de TCR in vitro et in vivo . La vidéo et le matériel qui l’accompagne sont conçus pour donner une description très détaillée de la cellule unique PCR, afin que les étapes critiques puissent être suivies et potentiels pièges évités. En outre, nous fournir une description détaillée des étapes nécessaires pour générer le vecteur d’expression clonage. Une fois maîtrisé, tout le processus depuis la seule cellule de tri à l’expression de TCR peut être effectué dans un délai de deux semaines.

Introduction

Le récepteur des cellules T (TCR) dicte décision sort des lymphocytes T au cours de développement, l’état stationnaire/homéostasie et une stimulation antigénique en périphérie^1,2,3. Expansion récente des technologies de séquençage de profondeur a permis de découvrir une diversité TCR précédemment sous-estimé au sein de l’antigène des lymphocytes T spécifiques aux réponses. Diversité des TCR suggère un potentiel pour les lymphocytes T large point de vue fonctionnel. Afin d’intégrer l’analyse TCR répertoire des séquences avec des essais fonctionnels de TCR, les approches de séquençage devraient être conçus pour être compatible avec les systèmes expérimentaux et in vivo des modèles utilisés pour l’analyse fonctionnelle de select TCRs. Nous avons développé une approche efficace pour l’isolation de séquence humaine TCR et rationalisé sous clonage dans un vecteur de modèle des TCR de chimérique humain/souris compatible avec l’expression de TCR à souris humanisée HLA⁴. L’isolement des correspondants des chaînes alpha et bêta des hétérodimères TCRs nécessite l’amplification PCR des deux chaînes d’une seule cellule. Bien que plusieurs protocoles de clonage TCR unicellulaires ont été développés et utilisés, aucun jusqu'à présent ont été facilement compatible avec haut débit simplifiée clonage direct de TCRs Vα/Vβ inconnu dans des vecteurs rétrovirus nécessaires pour réexpression in vivo ^4,5,6,7. Des études antérieures ont utilisé deux approches majeures, soit pour amplifier sélectivement une partie limitée du TCR suffit d’extrapoler la séquence, ou d’amplifier les TCR toute séquence^{4,5,6 , 7}. analyse fonctionnelle en aval de TCR séquences obtenues par l’intermédiaire de la première approche exige la construction du TCR Assemblée et de novo coûteux en silico . Tandis que la seconde approche présente également la séquence complète de TCR, la région constante humaine n’est pas compatible avec in vivo l’expression des TCRs clonés dans des modèles murins. Notre approche est spécifiquement conçu pour être compatible avec in vivo analyse fonctionnelle des TCRs dans des modèles murins. Nous avons développé une cellule unique protocole PCR permettant directement sous clonage de fragments PCR dans le vecteur d’expression de modèle efficace et simplifiée.

Notre approche utilise une réaction de PCR de multiplex imbriqué très sensible qui s’effectue en deux étapes. Dans la première réaction de multiplexe étape une piscine de 40 amorces spécifiques pour toutes les chaînes de V-bêta et une piscine de 44 amorces spécifiques pour toutes les chaînes alpha-V sont utilisées pour amplifier la TCR-alpha ou bêta-TCR sans la connaissance préalable de la séquence (tableau 1). L’apprêt avant a une séquence de l’adaptateur, qui est incorporée dans la 5' du produit PCR. L’apprêt inverse est issu de la région constante du TCR. Nous avons identifié des sites de restriction uniques qui sont absents de la variable humaine ou jonction TCR régions et incorporés dans des amorces nouvellement redessinés de TCRα et TCRβ (Figure 1). Dans la deuxième réaction imbriquée, une amorce spécifique pour la séquence de l’adaptateur et une amorce inverse imbriquée au sein de la région constante sont utilisés pour amplifier encore les chaînes TCR avec une spécificité accrue (tableau 1, Figure 1). Après l’isolement de cellules du même, deux rondes de PCR (première réaction avec un pool d’amorces Vα tant Vβ et deuxièmement avec des amorces adaptateur) aboutir à un produit PCR qui peut être directement sous cloné dans le template vecteur rétroviral. La construction TCR finale doit pouvoir coder, dans un cadre de lecture seule (ORF), les régions variables humaines combinées avec les régions constantes souris reliées par la séquence protéique « Self clivage », P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)⁸. La séquence de P2A a été utilisée dans plusieurs systèmes et a été longuement testée spécifiquement pour l’expression de TCRs^8,9,10,11. Bien que, après traduction la plupart de la P2A séquence reste attachée à l’extrémité C-terminale de la chaîne alpha, reliée par un flexible linker, tandis que la séquence de signaux de chaîne bêta a une proline supplémentaire, cette modification n’a aucun effet néfaste sur la fonction TCR. La région constante de la souris est utilisée dans la construction au lieu de l’homme pour éviter des interactions altérées avec des composants de signalisation en aval lors de ré-exprimé dans les cellules de souris. L’ORF unique entraînera stoechiométrique expression distincte d’alpha et bêta chaînes^9,11. Le protocole actuel est issu des réactifs et des approches qui sont largement disponibles et est conçu pour être réalisées de manière simple et efficace. Bien que nous avons spécifiquement utilisé cette technique pour dosage de TCRs des cellules T autoréactives impliqués dans le diabète auto-immun, nous prévoyons que ce protocole peut être largement applicable pour l’identification et l’évaluation fonctionnelle des TCRs humaines spécifiques pour épitopes auto-immunes, cancer épitopes ou réponses aux pathogènes et aux vaccins.

Protocole

1. identifier la population des lymphocytes T.

Remarque : antigène spécifique prolifération en combinaison avec de la teinture de la division cellulaire (comme la carboxyfluorescéine succinimidyl ester, CFSE) peut être utilisée pour isoler les cellules T basé sur leur prolifération en réponse à une stimulation antigénique. Si à partir de PBMC, une expansion 7 jours in vitro devrait suffire identifier un antigène spécifique CFSE faible population ¹².

1. Mix PBMC 1:1 avec des cellules nourricières MHC assortie et étiquette avec de la teinture de la division cellulaire 5 µM CFSE.
2. Plaque de 2 à 2,5 x 10 ⁵ cellules / puits dans un fond rond 96 puits culture plaque dans 200 µL 10 % FCS complet RPMI médias.
   NOTE : Le RPMI complet contient 2 mM de l-glutamine, pyruvate de sodium 1 mM, 100 µM MEM acides aminés non essentiels, 5 mM HEPES, 5,5 × 10 ^{− 5} unités de 2-mercaptoéthanol, 100 mL de U ^{− 1} pénicilline et 100 µg mL ^{− 1} streptomycine.
3. Stimuler les cellules avec des antigènes de peptide 25 µM.
4. Sur la quatrième journée de la culture, soigneusement retirer et remplacer 100 µL de médias.
   Remarque : Une approche plus optimale pour l’identification spécifique de l’antigène des lymphocytes T est l’utilisation de peptide-HLA tétramères ¹³. Tétramère de coloration permettant l’évaluation simultanée de la spécificité de l’antigène, mais aussi de HLA-restriction.

2. Mettre en place le type de cellule unique.

1. Effectuer toutes les procédures dans une hotte ou d’un secteur désigné gratuitement modèle amplifié. Aliquote les réactifs pour éviter toute contamination, nettoyer toutes les surfaces de travail et, si c’est possible, équipement avec 10 % d’eau de Javel avant l’installation de la PCR. Utilisez les bouts filtrants, RNAse et DNAse réactifs gratuits et plastiques dans tous les PCR et vecteur de clonage des étapes. Réactifs clés se trouvent dans la Table des matières.
   Remarque : La réaction de PCR multiplexe est très sensible, et de faibles niveaux de contamination sont notamment imputables au produit amplifié.
Tampon de
2. Generate master mix transcription inverse en combinant 10 x réaction de droite, 25 X DNTPs, 9 enzyme RT U, 0,01 % Triton-X, inhibiteur de RNAse U 0,7 et 383 nM de chaque amorce RT-TCR (énumérée dans le tableau 1) dans un réservoir de pipetage stérile. Pour chaque plaque à 96 puits, composent assez mélange maître pour 10 réactions supplémentaires (total 106), pour compenser la perte de liquide pendant le pipetage. Voir le tableau 2 pour les composants de la réaction et montants / puits.
3. Préparer une collection de PCR 96 puits plaque pour cellule Tri par pipetage 6 µL du mélange maître transcription inverse / puits avec une pipette multicanaux. Maintenir la plaque sur la glace ou dans un bloc froid.
4. Étiquette de cellules avec des anticorps dans la cellule des marqueurs de surface (par exemple les CD4 et CD3, ou CD8, CD3, chacun à 2 µg/mL, en combinaison avec la division cellulaire colorant ou coloration tétramère).
5. Cellules de T de sorte à une cellule par puits, sauter la douzième ligne, qui servira de témoin négatif.
   Remarque : L’efficacité du tri dépendra alignement plaque collection précis dans le support de plaque, ainsi que maintenir les cellules et les plaques à une température basse avant la réaction de l’ADNc. Assiettes de collection doivent être conservés sur la glace en permanence, sauf pendant le tri, lorsqu’ils sont fixés au sein de la plaque de refroidissement. Pas tous les trieurs sont équipés d’un support de plaque réglementé de température ; Toutefois, l’utilisation de l’un est fortement recommandée. Puisque le tri prend généralement environ 10-15 min par plaque, il y a un risque accru pour la dégradation de l’ARN si la plaque n’est pas maintenue à basse température.
6. Comme témoin positif, ajouter un plus grand nombre de cellules (100) manuellement avec une pipette à l’un des puits à ce stade. Sinon, déjà isolé l’ARN des cellules regroupées peut être utilisé comme témoin positif à 10 ng / puits.
   NOTE : Pipetter purifiée control RNA avec précision et soin afin d’éviter la contamination croisée d’autres puits et des résultats faussement positifs.
7. Sceller la plaque avec film adhésif et tournez en bas à 1000 x g pendant 5 min à 4 ° C.
8. Transcrire immédiatement RNA d’ADNc en incubant la plaque à 25 ° C pendant 10 min, 37 ° C pendant 45 min et 85 ° C pendant 10 min.
   Remarque : Pour garantir la réaction PCR efficace, il est recommandé que la première réaction de PCR être effectué le même jour. Alternativement, les plaques transcrits peuvent être conservées à-80 ° C pendant 2 mois.

3. Effectuer imbriqué multiplex PCR

Remarque : préparer tous les mélanges maîtres dans une zone propre modèle pour éviter toute contamination.

Apprêt

1. reconstituer chaque région variable à 100 µM avec DNAse et RNAse libre H ₂ O. Ensuite, mélanger 20 µL de chacune des 44 amorces pour générer la piscine d’apprêt V-alpha. Pour générer la bêta V piscine apprêt combiner 20 µL de chacune des 40 amorces V-bêta plus 80 µL de DNAse et RNAse libre H ₂ O. Primer séquences sont répertoriées dans le tableau 1. Une fois mis en commun, la concentration de chaque amorce dans le mélange est 2.3 µM.
2. Reconstituer les amorces de la région constante de la solution mère de 100 µM à la DNAse et RNAse libre H ₂ O. diluer les amorces région constante 10 solution de travail µM et partie aliquote destiné.
3. Préparer deux mélanges maîtres distinctes pour l’amplification TCR-alpha et bêta-TCR. Générer les mélanges maîtres en combinant 5 X buffer, 80 µM dNTPs, 3 % DMSO, 2 µM amorce pool (concentration finale de 46 nM pour chaque amorce), 200 nM TCR-constant région inverse l’apprêt, 1 U ADN polymérase et DNAse et RNAse libre H ₂ O (tableau 2 < / strong >). Pour chaque plaque à 96 puits, composent assez mélange maître pour 10 réactions supplémentaires (total 106), afin de compenser la perte de liquide pendant le pipetage.
   Remarque : Les calculs sont basés sur le volume final de PCR de 25 µL / puits, où le mélange de 22,5 µL maître PCR se conjugue avec matrice d’ADNc 2,5 µL.
4. Garder la plaque avec l’ADNc sur la glace ou dans un bloc froid. Utilisez un multicanal pour distribuer 22,5 µL de réaction TCR-bêta dans une nouvelle plaque PCR 96 puits. Puis utilisez un multicanal pour transférer 2,5 µL d’ADNc dans la plaque PCR.
5. Utiliser un multicanal pour distribuer 22,5 µL de réaction TCR alpha directement dans le plat contenant le reste du cDNA.
6. Sceller les plaques avec une colle doucement vortex et spin down à 1000 x g pendant 5 min à 4 ° C.
7. Exécuter la réaction de PCR multiplexe avec les cycles suivants : 5 min à 95 ° C suivie de 34 cycles de 20 s à 95 ° C, 30 s à 54 ° C et 1 min à 72 ° C, suivie de 7 min à 72 ° C.
8. Carry out la réaction PCR imbriquée dans un volume final de 25 µL, à l’aide de 2,5 µL du mélange PCR multiplex en tant que modèle.
   1. Reconstituer les amorces internes et adaptateur à 100 µM avec DNAse et RNAse libre H ₂ O. faire 10 µM parties aliquotes pour le stock travail.
   2. Préparer deux mélanges maîtres distinctes pour ampl TCR-alpha et bêta-TCRfication. Mix 5 X tampon, 25 X DNTP, 3 % DMSO, 200 nM adaptateur avant apprêt, amorce imbriquée inverse de 200 nM, 1 U ADN polymérase et l’ADN polymérase et exempte de nucléase H ₂ O pour un volume final de 22,5 µL (tableau 2). Pour chaque plaque à 96 puits, composent assez mélange maître pour 10 réactions supplémentaires (total 106), pour compenser la perte de liquide pendant le pipetage.
      Remarque : Dans la deuxième utilisation de réaction PCR le 5 X PCR buffer contenant colorant de chargement pour faciliter le chargement de gel d’agarose.
   3. à l’aide d’un multicanal, pipette les mélanges maîtres pour les réactions TCR-alpha et bêta-TCR à 22,5 µL / puits dans deux nouvelles plaques de 96 puits PCR.
   4. Ajouter le modèle de réaction PCR multiplex à 2,5 µL / puits.
      Remarque : La première réaction de PCR restante devrait être scellée et conservée à-20 ° C et servir de source de modèles supplémentaires, si cela devient nécessaire (voir étape Note 4,3).
   5. Sceller les plaques doucement vortex et spin down à 1000 x g pendant 5 min à 4 ° C.
   6. Exécuter la réaction PCR imbriquée avec les cycles suivants : 5 min à 95 ° C suivie de 34 cycles de 20 s à 95 ° C, 30 s à 56 ° C et 1 min à 72 ° C, suivie de 7 min à 72 ° C.
   7. Exécuter 5 µL de la réaction finale sur un gel d’agarose de 1 % de gel contenant du bromure d’éthidium (y compris les puits des témoins négatifs et positifs).
      Remarque : La bande attendue doit tourner autour de 500 taille de bp. Une réaction de l’exemple est illustrée à la Figure 2.
   8. Purifier le reste de la seconde réaction (20 µL) en utilisant un format 96 puits kit de purification de PCR, éluer avec 15 µL de 70 ° C H ₂ O / puits et effectuer Sanger séquençage. Utiliser l’approprié TCR-alpha ou bêta-TCR adaptateur avant primaire de séquençage (tableau 1).
      Remarque : Les séquences peuvent être analysées avec logiciel immunogénétique disponibles en ligne.

4. Clonage des chaînes PCR alpha et bêta.

Remarque : la piscine de l’avant amorces utilisées dans la première réaction et les amorces inverses dans la deuxième réaction de PCR sont utilisés pour intégrer les sites de restriction. Par conséquent, les produits PCR chaîne alpha et beta obtenus sont prêts à être successivement Sub cloné dans le vecteur rétroviral modèle ( Figure 1).

Produits

1. Digest le PCR purifié de la beta imbriqués réaction avec BstbI et MfeI (tableau 3).
   Remarque : Ne pas dépasser 5 µg insert.
2. En parallèle, digérer le template vecteur avec BstbI et MfeI (tableau 3). Utiliser 1 à 2 µg de la template vecteur par TCR. Exécutez le vecteur digéré sur gel d’agarose et isoler la bande plus large (~ 7500 bp). Purifier le vecteur d’un gel kit de purification de l’ADN.
   Remarque : Pendant le digest de l’enzyme de restriction, la région variable de la murine TCR-bêta de modèle est supprimée, permettant l’ajout de la région variable de TCR-bêta humaine.
3. Purifier les produits de PCR digérés à l’aide d’un kit de purification PCR.
   Remarque : Vérifier la capacité de purification de l’ADN des colonnes incluses dans le kit ; Utilisez plusieurs colonnes si nécessaire. Le montant minimum d’un insert purifié nécessaire à une réaction de ligature réussie est de 50 ng à une concentration minimale de 10 ng/µL. Si le montant d’insert purifiée n’est pas suffisant pour une ligature avec succès, la seconde réaction de PCR peut être répétée.
4. Traiter le template vecteur avec 10 enzyme U CIP pendant 1 h à 37 ° C pour empêcher l’individu-ligature, suivie de l’inactivation par la chaleur pendant 10 min à 75 ° C. purifier l’ADN avec un kit de purification de l’ACP (tableau 3).
5. Bêta-TCR Ligate insérer et vector à l’aide de DNA ligase, pendant 30 min à température ambiante dans un volume total de 20 µL à 6 excès molaire de l’insert.
   Remarque : Au total, la réaction de ligature doit contenir environ 150 ng d’ADN (tableau 3).
6. Pour les transformations, mélanger 8 µL de la réaction de ligature 80 µl de cellules chimiquement compétentes de e. coli DH5α (Table des matières) et incuber sur glace pendant 30 min à 42 ° C pendant 45 s. ajouter 500 µL un choc thermique Super Bouillon optimal avec moyen de répression (O.S.C.) catabolique et agiter pendant 1,5 h à 37 ° C.
7. Plaque à 250 µL de culture bactérienne sur une ampicilline contenant de gélose lysogénie bouillon (LB). Incuber la plaque pendant la nuit (~ 16 h) à 37 ° C.
8. Le lendemain prélever des colonies bactériennes et eux grandisse dans un milieu 3 mL LB contenant l’ampicilline durant la nuit. Isoler l’ADN de plasmide à l’aide du kit de purification ADN plasmidique.
9. Confirmer l’insertion réussie de la chaîne bêta par un essai à petite échelle-digest avec les enzymes de restriction, BstbI et MfeI. Dans un volume de réaction totale 12 µL, mélanger 200 à 500 µg ADN plasmidique, 0,25 µL de chacune des enzymes et 10 X enzyme tampon (tableau 3). Exécutez la réaction dehors sur un gel d’agarose à 1 % contenant du bromure d’éthidium pour confirmer la taille de la bande d’insertion (~ 500 bp).
10. Après la confirmation de la présence de l’insert, séquencer la section RCT-bêta du vecteur à l’aide de l’apprêt inverse IRES (tableau 1).
11. Suite à la confirmation de la séquence de l’insert de TCR-bêta, effectuer un processus similaire pour l’insertion de la région variable alpha. Digérer les produits PCR purifiés de la réaction alpha imbriquée et l’insert de TCR-bêta nouvellement générée contenant le vecteur, avec SnaBI et SacII.
    Remarque : Pendant le digest de l’enzyme de restriction, la région variable de la murine TCR alpha de modèle est supprimée, permettant l’ajout de la région variable de TCR-alpha humaine.
Alpha
12. Ligate insère dans les vecteurs TCR codant la région variable correspondante de bêta à l’aide de DNA ligase, pendant 30 min à température ambiante dans un volume total de 20 µL à 6 excès molaire de l’insert.
    Remarque : Au total, la réaction de ligature doit contenir environ 150 ng d’ADN (tableau 3).
13. Pour les transformations, mélanger 8 µL de la réaction de ligature 80 µl de cellules chimiquement compétentes de e. coli DH5α (Table des matières) et incuber sur glace pendant 30 minutes un choc thermique à 42 ° C pendant 45 s. ajouter 500 µL O.S.C. moyen et agiter pendant 1,5 h à 37 ° C.
14. Plaque à 250 µL de culture bactérienne sur une ampicilline contenant de gélose lysogénie bouillon (LB). Incuber la plaque pendant la nuit (~ 16 h) à 37 ° C.
15. Le lendemain prélever des colonies bactériennes et eux grandisse dans un milieu 3 mL LB contenant l’ampicilline durant la nuit. Isoler l’ADN de plasmide à l’aide du kit de purification ADN plasmidique.
16. Confirmer l’insertion réussie de la chaîne alpha par un essai à petite échelle-digest avec les enzymes de restriction SnaBI et SacII. Dans un volume de réaction totale 12 µL mélanger 200 à 500 µg ADN plasmidique, 0,25 µL de chacune des enzymes et 10 x enzyme tampon (tableau 3). Exécutez la réaction dehors sur un gel d’agarose à 1 % contenant du bromure d’éthidium pour confirmer la taille de la bande d’insertion (~ 500 bp).
17. Après la confirmation de la présence de l’insert, séquencer la section TCR alpha du vecteur à l’aide de l’apprêt MSCV2-forward (tableau 1).
18. Une fois que la séquence de la chaîne alpha est validée, vérifier l’insertion complète de TCR par séquençage d’amorce de TCR-bêta-inversion et IRES-inverse (tableau 1).

5. Vérifier l’expression superficielle de cellules TCR et spécificité.

Remarque : cellules HEK293T sont utilisés pour tester le succès TCR chaîne paring et cell surface expression ( Figure 3 a) ⁸. Peptide-MHC tétramère coloration peut également être effectuée sur les cellules transfectées de HEK293T à tester pour le maintien de la spécificité antigénique poste TCR gène isolement ( Figure 3 b).

1. Plaque de cellules HEK293T en plaques de culture de tissu de 12 puits à 1 x 10 ⁵ cellules / puits dans 1 mL complet DMEM médias contenant 5 % FCS et de la culture pendant une nuit à 37 ° C. plaque sur suffisamment de cellules ont désignées au puits séparés pour chaque nouveau TCR , contrôle template TCR vecteur, vecteur de CD3 seulement, contrôler vecteur TCR seulement et un non transfectées bien.
   NOTE : Transfection avec un modèle entièrement souris TCR vector (RCTM-pMIA) en combinaison avec mCD3εγδζ-pMIG vecteur, vecteur du RCTM-pMIA seul, et mCD3εγδζ-pMIG vecteur seul sont utilisés comme témoins positifs et négatifs.
   NOTE : DMEM complet contient 2 mM de L-glutamine, 1 mM de Pyruvate de Sodium, 100 µM Non essentiels, acides aminés, 5 mM HEPES buffer, 5,5 x 10 ^-5 unités de 2-mercaptoéthanol, 100 U/ml de pénicilline/streptomycine.
2. Le lendemain, transfecter les cellules avec 1 µg chimérique h/RCTM-pMIA vecteur, vecteur de CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) 1 µg souris et un réactif de transfection axée sur les liposomes, suivant les instructions du fabricant.
3. Pour chaque TCR, ajouter 6 µL de réactif de transfection à 100 µL la température ambiante, sans sérum DMEM. Brièvement, vortex et incuber à température ambiante pendant 15 min.
4. Dans séparé 1,5 mL tubes mélanger 1 µg de vecteur de TCR-pMIA µg 1 souris CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) vecteur ou 1 µg de chaque vecteur distinct pour les contrôles.
5. Dropwise, ajouter la solution de réactif/DMEM de transfection pour les tubes contenant le vecteur ADN. Incuber à température ambiante pendant 15 min.
6. Dropwise, ajouter la solution de réactif/DMEM/ADN de transfection de cellules HEK293T. Tapoter légèrement la plaque pour mélanger. Incuber à 37 ° C pendant 24 h.
7. Après 24 h remplacer les médias et de garder les cellules en culture pour supplémentaires 24h.
8. Enlever les cellules de la plaque par pipetage vigoureux et tacher les cellules avec un anticorps anti-souris CD3 (2,5 µg/mL) afin de vérifier l’expression superficielle de la chimère-TCR par cytométrie.
9. Pour comparer l’expression CD3 entre les cellules qui ont été transfectées à un niveau similaire, porte l’analyse sur les cellules exprimant un haut niveau similaire de molécules journaliste fluorescente (GFP pour complexe CD3 et amétrine pour vecteur d’expression de TCR). Idéalement, l’analyse devrait être fermée sur GFP + amétrine + cellules dans 10 ⁴ 10 ⁵ intensité de fluorescence ( Figure 3 a).
   Remarque : Le niveau d’expression de CD3 dans les cellules transfectées par la construction chimérique devrait être comparable au vecteur contrôle souris (modèle d’origine) ( Figure 3 a). Les vecteurs rétroviraux générés de TCR sont compatibles avec les systèmes d’expression in vivo comme décrit précédemment ⁴.

Résultats

L’efficacité de la réaction de PCR multiplex imbriqué est activée à l’étape 3.2.7 (Figure 2) en exécutant sur 5 µl de la seconde réaction sur gel d’agarose. L’efficacité de l’amplification de la TCR-bêta en moyenne devrait se situer autour de 80 %, tandis que l’efficacité de la réaction de TCR-alpha est généralement plus bas, aux alentours de 50 %⁴. Seulement paires chaînes TCR-alpha et bêta-TCR peuvent être utilisés pour l’expression ...

Discussion

Dans le protocole actuel, nous décrivons une méthode efficace pour l’amplification de TCR unicellulaire et ultérieures sous clonage des chaînes appariées de TCR alpha et bêta dans un vecteur rétroviral expression de modèle. Bien que plusieurs protocoles PCR de cellule unique ont été développés, aucun jusqu'à présent ont été compatible avec immédiate sous clonage dans un vecteur d’expression. Dans la plupart des cas, une séquence partielle qui englobe les régions CDR3 très variables est amplifiée, avec assez de séquence d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
CFSE  ;	eBioscience  ;	65-0850-84	5 mM
anti-CD4 humain (OKT4) BV421	Biolegend  ;	317433	2 mg/mL
CD3 anti-humain (OKT3) PerCP/Cy5.5	Biolegend  ;	317336	2 mg/mL
d’anti-souris CD3 AF647	Biolegend  ;	100322	2,5 mg/mL
Inhibiteur de l’ARNAse recombinante biotech grd 2,5KU  ;   ;	VWR	97068-158	0.7 U
Applied Biosystems Kit RT ADNc à haute capacité  ;	Invirtogen  ;	4368814	9 U (enzyme RT)  ;
NF-H2O : Eau sans nucléase 1000mL	Invirtogen  ;	AM9932
Gotaq DNA polymérase 2500U	VWR	PAM3008	1 U
96 Puits Demi-Jupe Plaque PCR	Phénix	MPX-96M2
MicroAmp Film Adhésif Transparent  ;	ThermoFisher  ;
Agarose UltraPure  ;	Invirtogen  ;	15510-027
SnaBI	New England Biolabs  ;	R0130	15 U (insert) 30 U (vecteur)
SacII	New England Biolabs  ;	R0157	40 U (insert) 80 U (vecteur)
MfeI	New England Biolabs  ;	R3589S	40 U (insert) 80 U (vecteur)
BstBI	New England Biolabs  ;	R0519	40 U (insert) 80 U (vecteur)
Phosphatase intestinale du veau (CIP)	New England Biolabs  ;	M0290S	10 U
Ligase rapide  ;	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre  ;	M2200S
Wizard Plus minipreps systèmes de purification d’ADN  ;	Promega  ;	A1460
Wizard Plus midipreps systèmes de purification d’ADN²� ;	Promega  ;	A7640
DNA clean & concentrator-25 kit	Genesee Scientific  ;	11-304C
ZR-96 DNA clean & concentrator-5 kit	Genesee Scientific  ;	11-306A
QIAkit rapide d’extraction de gel	Qiagen	28704
QIAkit de purification PCR rapide	Qiagen	28104
Efficacité de sous-clonage DH5a Cellules compétentes  ;	ThermoFisher  ;
Transit LT-1 Réactif 1mL (réactif de transfection)	Mirus  ;
BD FACS Aria II (trieur)	BD
BD Fortessa (cytomètre en flux)	BD  ;