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Détection et enrichissement des rares cellules B spécifiques de l'antigène pour l'analyse des Phénotype et fonction

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DOI :

10.3791/55382

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16 février 2017

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1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, 3Barbara Davis Center for Childhood Diabetes, University of Colorado School of Medicine, 4Department of Biomedical Research, National Jewish Health

Dans cet article

Résumé

Une méthode simple mais efficace qui utilise des nanoparticules magnétiques pour détecter et enrichir les cellules B antigène réactif pour l'analyse fonctionnelle et phénotypique est décrite.

Résumé

cellules B réactives avec un antigène spécifique se produisent généralement à une fréquence de <0,05 % des lymphocytes. Pendant des décennies, les chercheurs ont cherché des méthodes pour isoler et enrichir ces cellules rares pour étudier leur phénotype et leur biologie. Les approches sont inévitablement basées sur le principe que les lymphocytes B reconnaissent l’antigène natif en vertu de récepteurs de surface cellulaire représentatifs en spécificité des anticorps qui seront éventuellement sécrétés par leurs filles différenciées. L’approche la plus évidente du problème consiste peut-être à utiliser des antigènes conjugués au fluorochrome en conjonction avec le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Cependant, l’utilité de ces méthodes est limitée par la fréquence des cellules et le taux d’analyse et d’isolement réalisable par tri électronique. Une nouvelle méthode d’enrichissement de lymphocytes B rares spécifiques de l’antigène à l’aide de nanoparticules magnétiques qui permet un enrichissement à haut rendement des lymphocytes B réactifs à l’antigène à partir de grandes populations de cellules de départ est décrite. Cette méthode permet d’améliorer le suivi du phénotype et de la biologie des cellules réactives à l’antigène avant et après la rencontre in vivo de l’antigène, par exemple après l’immunisation ou pendant le développement de l’auto-immunité.

Introduction

Dilution limitante analyse de la fréquence des précurseurs de cellules sécrétant des anticorps ont suggéré que les cellules B réactives à un antigène particulier se produit typiquement à une fréquence de 0,05 à 0,005% dans le répertoire normal, en fonction de l'état de vaccination et de la taille / nombre d'épitopes présents sur l'antigène. La faible fréquence de ces cellules, il a été difficile d'étudier l'évolution de leur état au cours du développement de réponses immunitaires, telles que la vaccination ou après une exposition à un antigène étranger, ou au cours du développement de l'auto-immunité. Tri 1, 2, 3, 4, 5, 6 cellules Auparavant, les chercheurs ont entrepris l' isolement des lymphocytes B de l' antigène réactif en utilisant des techniques allant de l' antigène revêtu des plaques ou des adsorbants des colonnes, à des globules rouges remise à zéro de l' antigène revêtu, à activé par fluorescence. though ces techniques ont réussi à identifier et isoler les cellules de l'antigène réactif B, les résultats ont varié en termes de rendement, la pureté et l'évolutivité. Récemment, nous avons développé une nouvelle méthode à la fois de détecter et d'enrichir rares sous-populations de lymphocytes B en utilisant des nanoparticules magnétiques. Le procédé permet l'enrichissement avec un rendement relativement élevé et la pureté des grandes populations de départ, et est compatible avec l'analyse des réponses à l'antigène. En enrichissant des populations de cellules en suspension, le procédé élimine les contraintes qui sont associées à la géométrie des plaques ou des colonnes recouvertes d'antigène, ce qui limite le débit. Enfin, étant donné que les cellules enrichies restent associées à l'antigène et d'un rapporteur fluorescent, ils peuvent être en outre purifiés par tri FACS. Comme décrit ici, nous avons utilisé cette approche pour l'étude des cellules périphériques du tétanos du sang anatoxine réactif B avant et après la vaccination des sujets humains, ainsi que les cellules de autoantigène réactif B des sujets avec différents autoitroubles mmune, y compris le diabète de type 1, la maladie de Graves, et la maladie de Hashimoto 7. Le procédé fonctionne aussi bien chez la souris et l'homme, et il est compatible avec une analyse des cellules présentatrices d'antigène réactif B à partir d'une variété de tissus (manuscrit en préparation).

Dans son format de base, les cellules mononucléaires du sang périphérique sont d'abord mises en incubation avec un antigène biotinylé avec des anticorps dirigés contre des antigènes de surface cellule requis pour l'analyse phénotypique. Cette étape de marquage est suivie par le lavage et la fixation, et l' addition de streptavidine couplée à un colorant rouge lointain fluorescent pour la détection des cellules de liaison biotinylé antigène (figure 1). Des études antérieures ont permis d' identifier des cellules B spécifiques de l' antigène d'une manière similaire , mais en utilisant directement les antigènes conjugués à un fluorochrome 8, 9, 10, 11. Bien que ce soit un digneapproche, l' utilisation d'antigènes biotinylés en conjonction avec la streptavidine permet une plus grande amplification du signal ( et donc une meilleure différenciation des cellules non contraignantes de liaison et), en particulier lorsque les antigènes sont de petite taille 12, 13, 14. Une autre considération est l'utilisation de la streptavidine à la place de l'avidine, car streptavidine est déglycosylée, ce qui diminue la liaison non spécifique. En outre, on utilise un colorant rouge lointain fluorescent comme fluorochrome en raison de sa photostabilité, le rendement quantique (luminosité) et de sa petite taille (~ 1,3 kDa). Fluorochromes de protéines tels que la phycoérythrine (~ 250 kD) et allophycocyanine (~ 105 kD) 15 ne sont pas optimales , car ils contiennent potentiellement de nombreux épitopes antigéniques. Utilisation d'un petit colorant organique fluorescent composé d'un seul épitope, tel que le colorant rouge lointain fluorescent, réduit la complexité de la population cellulaire isolée.

Une fois que les cellules sont biotinylées-antigen et adsorbé de colorant streptavidine rouge lointain fluorescent, ils sont enrichis en utilisant des nanoparticules magnétiques colorant conjugué anti-rouge lointain fluorescentes. Nanoparticules uniques ne sont pas détectés par la plupart des cytomètres de flux et donc ne doivent pas être enlevés avant la purification par FACS de tri et les essais en aval 16. sélection magnétique pour des cellules spécifiques de l'antigène B enrichit la population d'intérêt, éliminant ainsi le temps et le coût du tri des événements rares en utilisant un cytomètre de flux.

Ci-dessous, nous montrons des résultats représentatifs de l'enrichissement des cellules spécifiques anatoxine tétanique B à partir d'un sujet avant et sept jours après la vaccination de rappel antitétanique. Nous avons choisi cette application particulière , par exemple , afin de démontrer la capacité de cette méthode pour enrichir les cellules spécifiques de l' antigène B suivantes aiguë dans la stimulation in vivo. Lorsqu'il est couplé avec la cytométrie de flux, ce procédé est capable d'enrichir et de différencier naïve mémoire spécifique à un antigène, etcellules et plasmablaste B permet au chercheur de suivre l'évolution de leur fréquence au fil du temps. En outre, nous avons inclus un autre dosage en aval possible, par exemple , un essai ELISPOT, ce qui démontre que les cellules conservent l'aptitude à sécréter un anticorps suivant l' enrichissement. Une autre application de cette méthode pourrait impliquer le transfert adoptif de cellules enrichies dans un hôte. Nous avons précédemment montré les cellules conservent l'aptitude à agir en tant que cellules présentant un antigène à des lymphocytes T spécifiques de l'antigène ci-après isolement et de transfert (données non présentées). Par conséquent, il existe un certain nombre d'essais possibles en aval pouvant être couplé à la méthode qui informe ainsi la compréhension de la réponse immunitaire spécifique d'un antigène. Nous avons décrit la méthode ci-dessous, y compris les contrôles pour déterminer le rendement global, la pureté, la spécificité cellulaire, et pliez-enrichissement.

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Protocole

1. Isolement de PBMC humaines

  1. Recueillir 30-50 ml de sang à l'aide de tubes de collecte de sang héparinisés.
    NOTE: La quantité de sang utilisée dépend de la question expérimentale particulière et la fréquence dans le sang des cellules B spécifiques de l'antigène d'intérêt. sang héparinisé peut être traité immédiatement ou légèrement secoué pendant une nuit à la température ambiante pendant le traitement le jour suivant. Le retard dans le traitement a très peu d'effet sur l'efficacité de l'enrichissement et est associée à une perte minimale de viabilité.
  2. Mélanger le sang entier 1: 1 avec stérile, du magnésium à température ambiante et exempte de calcium du sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS).
  3. Dans un tube conique stérile de 50 ml, ajouter 10 ml d'une solution à gradient de densité à la température ambiante. Conserver les bouteilles de gradient de densité ouverts dans l'obscurité à 4 ° C, mais réchauffer à la température ambiante avant utilisation.
  4. Si possible mis le pistolet de pipette pour le réglage lent et / ou d'appliquer très peu, et pourtant cohérente pression de déclenchement lentementcouche de 30-35 ml de sang dilué sur le dessus du gradient de densité, en faisant attention de ne pas mélanger les deux.
    REMARQUE: Placer la pointe de la pipette contre le bord des 50 ml conique tout en ajoutant le sang dilué contribuera à assurer un flux constant cohérente.
  5. Centrifuger à 400 g pendant 30 min à 20 ° C avec le frein désactivé.
  6. Retirer la couche supérieure, qui contient le plasma et les plaquettes, en faisant attention à ne pas perturber la couche de cellules mononucléaires ci-dessous.
  7. En utilisant une pipette stérile, recueillir la couche de cellules mononucléaires (buffy coat) et placer dans un 50 ml tube conique stérile séparé.
  8. Ajouter du PBS à la suspension cellulaire à un volume de 50 ml. Centrifuger à 400 g pendant 10 min à 20 ° C avec frein.
  9. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules sédimentées dans 10 ml de PBS. Compter les cellules et déterminer la viabilité en utilisant un hémocytomètre ou compteur de cellules automatisé.
  10. Resuspendre les cellules à 10 7 cellules / ml et placer sur la glace jusqu'à ce prêt pour un traitement ultérieur.

2. coloration des cellules

  1. Retirer 1-2 x 10 6 cellules pour chaque compensation de fluorescence / contrôle FMO nécessaire, le cas échéant. reste centrifugeuse de cellules à 400 g pendant 10 min à 4 ° C avec frein.
  2. Resuspendre les cellules dans un tampon stérile filtré à froid FACS (PBS + 1% de sérum albumine bovine (BSA) + azoture de sodium 0,01%) à 3-6 x 10 7 cellules / ml (remove dans un tube de 1,5 ml par centrifugation). Assurez-vous que le tampon FACS est froid et le garder sur la glace tout au long de la procédure de coloration.
    1. Diviser la population de cellules en quarts (AD) lors de l'optimisation du dosage. Utilisez fraction A pour enrichir les cellules B spécifiques de l'antigène d'intérêt, l'utilisation des fractions B et C pour déterminer la spécificité de l'enrichissement / coloration (voir 2.5 et 2.6 ci-dessous), et l'utilisation fraction D pour déterminer la fréquence et le nombre de cellules spécifiques de l'antigène dans la population unenriched pour permettre le calcul du rendement et pliez-enrichissement.
  3. Ajouter FcyR re bloquant humainagent fractions AD sur la glace pour empêcher la liaison des anticorps aux récepteurs Fc.
    REMARQUE: Suivez les instructions du fabricant pour les conditions appropriées.
  4. Ajouter des anticorps conjugués au fluorochrome à la cellule des antigènes de surface d'intérêt pour les fractions AD pendant 30 min sur de la glace dans l'obscurité, en faisant attention de ne pas inclure fluorochromes qui peuvent traverser réagir avec les anticorps de colorant anti-rouge lointain fluorescents couplés à des nanoparticules magnétiques.
    NOTE: Ce sont des conjugués d'anticorps à infrarouge proche colorant fluorescent, Cy5, Cy5.5 et Cy7. Les taches de viabilité qui sont ajoutées doivent être compatibles avec l'utilisation d'un fixateur. Si l'on n'a pas l'intention d'analyser les cellules en utilisant FACS, mais de déterminer la fréquence d'anticorps sécrétant, par exemple, par ELISPOT, coloration de la surface avec des anticorps est inutile.
  5. Pour tester la spécificité du test, incuber la fraction B avec une quantité suffisante d'antigène non marqué pendant 30 minutes sur de la glace, de telle sorte que la majorité des récepteurs avec une affinité d'au moins10 -6 M sont bloqués.
    NOTE: En règle générale, une bonne concentration de départ est un 50-100 fois supérieure à la quantité d'antigène jugé suffisant en 2.6 ci - dessous (par exemple 50-100 uM). Cela devrait bloquer toutes les cellules B ayant une forte affinité pour l'antigène non marqué se lier à l'antigène biotinylé, qui est ajouté à l'étape 2.6 ci-dessous, permettant ainsi la confirmation de la spécificité des cellules enrichies. Cette étape peut être réalisée en conjonction avec l'étape 2.4 ci-dessus.
  6. Ajouter antigène biotinylé à Fractions A, B et D. Incuber sur la glace pendant 30 min.
    REMARQUE: La concentration d'antigène biotinylé doit être ajustée pour déterminer la quantité optimale requise pour assurer la détection et la séparation des cellules de liaison de cellules de voisinage non spécifique suffisante. Généralement, une bonne concentration de départ à l'essai est de 1-5 uM.
    NOTE: Pour les fractions A et D, cette étape peut être réalisée simultanément avec l'étape 2.4 ci-dessus. Pour la fraction B, cette étape doit être effectuée après l'étape 2.5 (lavage à l'entrétapes een est inutile).
  7. Omettre antigène biotinylé de Fraction C afin de déterminer toute liaison des cellules B à d'autres réactifs dans le protocole, comme colorant rouge lointain fluorescent streptavidine et les billes magnétiques.
  8. Laver les cellules deux fois par la suspension de cellules dans 1 ml de tampon FACS à froid par 5 x 10 7 cellules et centrifugation à 400 g pendant 5 min à 4 ° C.
  9. Après le lavage final, diluer la suspension concentrée de cellules dans 1 ml de 2% formaldéhyde par 5 x 10 7 cellules et laisser reposer dans l' obscurité sur la glace pendant 5 min.
    REMARQUE: La fixation des cellules à ce stade, en sorte que l'antigène biotinylé reste lié à la RCB pour le reste de la procédure. Pour les cellules viables - pour l'analyse en aval, par exemple dans ELISPOT ou les transferts adoptives, omettre l'étape de fixation.
  10. Laver les cellules deux fois avec 1 ml de tampon FACS à froid par 5 x 10 7 cellules et centrifuger à 400 g pendant 5 min à 4 ° C. Remettre en suspension dans 1 ml FACS froid tampon par 5 x 107 cellules.
  11. Ajouter le colorant 1-2 pg streptavidine-rouge lointain fluorescent / ml et incuber sur de la glace pendant 20 minutes dans l'obscurité. Titrer la quantité de streptavidine pour chaque application.
  12. Laver les cellules deux fois avec 1 ml de tampon FACS à froid par 5 x 10 7 cellules et centrifuger à 400 g pendant 5 min à 4 ° C. préparation Fraction D est terminée à ce moment car il ne sera pas soumis à l'enrichissement en utilisant les billes magnétiques.
    Remarque: Cet exemple sera utilisé pour déterminer la fréquence et le nombre de cellules B spécifiques de l'antigène dans l'échantillon. Il sera utilisé pour déterminer le rendement et plier l'enrichissement obtenu par enrichissement.

3. Magnetic Enrichissement à base de nanoparticules

  1. Resuspendre les cellules à partir d' échantillons AC dans 1 ml de tampon froid de séparation (PBS + 0,5% de BSA + EDTA 2 mM) par 5 x 10 7 cellules et de passer à travers un filtre de 40 um pour éliminer les grumeaux qui pourraient obstruer la colonne.
  2. Ajouter Anti-Cy5 / nanoparticules de colorant anti-rouge lointain fluorescentes. for des résultats optimaux, la concentration des nanoparticules doit être adaptée à chaque utilisation, mais un bon point de départ est de 50 pi de suspension par 5 x 10 7 cellules / ml. Tourner dans l'obscurité à 4 ° C pendant 10 min.
  3. Laver deux fois avec 1 ml de tampon de séparation à froid à 400 g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre les cellules dans 1 ml de tampon froid de séparation par 5 x 10 7 cellules.

4. Enrichissement magnétique utilisant LS ou Colonnes LD

  1. Placez trois LS ou des colonnes de LD dans le champ magnétique d'un séparateur magnétique et ajouter 3 ml de tampon de séparation pour mouiller les colonnes (voir description du produit pour déterminer quel type de colonne est le mieux adapté). Autoriser tous les 3 ml de passer à travers la colonne et jeter après la collecte.
    REMARQUE: Bien que la séparation des cellules marquées de nanoparticules magnétiques peut être réalisée en utilisant l'une quelconque des dispositifs de séparation magnétiques qui sont disponibles dans le commerce, le laboratoire a eu le plus de succès avec l'utilisation de colonnes LS, in terms de rendement, la pureté et l'efficacité de l'enrichissement.
  2. Placer les tubes coniques de 15 ml trois étiquetés "Fraction A / (B) / (C) négative", pour les cellules sélectionnées négativement, sous la colonne. Ajouter la particule magnétique de cellules marquées à leur colonne respective et permettre à tout le volume de passer à travers.
  3. Ajouter 3 ml de tampon de séparation à froid sur le dessus, et laisser ce passage à travers la colonne et répétez avec 2 ml. Recueillir les cellules sélectionnées négativement et mettre de côté sur la glace.
  4. Retirer la colonne du champ magnétique et placer sur le dessus d'un tube de 15 ml conique étiqueté "Fraction A / (B) / (C) positif", pour les cellules sélectionnées positivement.
  5. Remplir la colonne vers le haut avec environ 6 ml de tampon de séparation et immédiatement plonger ce volume à travers la colonne pour recueillir des cellules qui avaient liés au champ magnétique utilisant le piston fourni.
  6. Pour augmenter la pureté, les cellules sélectionnées positivement peuvent être enrichis en utilisant une deuxième colonne de nettoyage, en répétant le procedure.
  7. Faire tourner les deux fractions sélectionnées négativement et positivement à 400 xg pendant 10 min à 4 ° C et à mettre en suspension dans un volume final désiré. Procéder à l'analyse en aval, tels que FACS, ELISPOT ou transfert adoptif.

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Résultats

Analyse de la pureté, le rendement, et pliez-enrichissement par cytométrie de flux

Les populations enrichies comme décrit ci-dessus contiennent inévitablement des cellules contaminantes qui ne sont pas liés colorant streptavidine rouge lointain fluorescent mais sont piégés dans la matrice. Ces impuretés peuvent être retirées de populations enrichies par tri FACS. Pour estimer la pureté des populations enrichies, porte sur des cel...

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Discussion

Nous décrivons ici un nouveau procédé pour réaliser l'isolement et l'enrichissement de cellules B de liaison d'antigène provenant du sang périphérique humain. Le procédé est facilement applicable à des souris et à d'autres tissus, tels que les ganglions lymphatiques et la rate, et est compatible avec une analyse post-enrichissement du phénotype et la fonction (manuscrit en préparation) cellulaire.

L'utilisateur doit être conscient d'un certain nombre de variables qui ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de FRDJ (1-2008-994, 27-2012-450) et des National Institutes of Health (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201 et F30OD021477).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Antigène d’intérêtvariablevariableAu moins 100 &mu ; g pour biotinyler facilement ; si vous utilisez des protéines, essayez d’utiliser des protéines qui ont été validées par ELISA. Il doit s’agir d’un transporteur. Sans protéines.
Biotine pour l’étiquetage ; par exemple EZ link Sulfo-NHS-LC-BiotineThermo Scientific21335La biotine est disponible dans différentes formulations, telles que celles contenant des entretoises de différentes longueurs, de sorte que le type utilisé doit être déterminé par le chercheur
Streptavidin-Alexa Fluor 647InvitrogenS21374Peut obtenir d’autres fournisseurs.
Microbilles Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647Miltenyi Biotech130-091-395
Colonnes LSMiltenyi Biotech130-042-401
Séparateurs manuels MACSMiltenyi Biotechvariable
FormaldéhydeDiluer à 2 % avec PBS
vivantes PBS sans calcium ni magnésium
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
Sang total en tubes
Tampon FACS (PBS + 1 % BSA + 0,01 % d’azoture de sodium)
Tampon de séparation (PBS + 0,5 % BSA + 2 mM EDTA)
50 ml Tubes
15 ml Tubes
Eppendorf de 1,5 ml
Anticorps réactifs marqueurs de surface, Fc Block, coloration discriminante vivante/morte, si nécessaire
ELISPOT fournit, si nécessaire
; facultatif si le test en aval nécessite des cellulesde prélèvement héparinésconiques coniquesTubes

Références

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Mots-clés

Enrichissement par nanoparticules magn tiquesTri cellulaire activ par fluorescenceCellules mononucl es du sang p riph riqueLiaison d antig nes biotinyl sAnticorps conjugu la streptavidineBlocage des r cepteurs FcgammaCentrifugation sur gradient de densitS paration sur colonne magn tiqueAntig ne du toxo de t tanique

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