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Article de méthode

Expression de la cytokine exogène dans les xénogreffes dérivées par un patient par injection avec une lignée cellulaire Stromal transduites par une cytokine

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DOI :

10.3791/55384

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10 mai 2017

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1Department of Pathology and Human Anatomy, Loma Linda University, 2Department of Basic Sciences, Loma Linda University, 3Department of Medicine, Loma Linda University

Dans cet article

Résumé

On décrit ici un procédé pour produire une cytokine exogène chez des souris de xénogreffe (PDX) dérivées du patient par injection intrapéritonéale hebdomadaire d'une lignée cellulaire stromale transduit par cytokine. Cette méthode élargit l'utilité de PDX et fournit l'option pour la distribution de cytokines exogènes transitoires ou prolongées dans une multitude de modèles PDX.

Résumé

Les souris dérivées de xénogreffe (PDX) sont produites par transplantation de cellules humaines dans des souris immunodéficientes. Ces modèles sont un outil important pour étudier les mécanismes de l'hématopoïèse normale et maligne et constituent l'étalon-or pour l'identification de chimiothérapies efficaces pour de nombreuses tumeurs malignes. Les modèles PDX sont possibles car beaucoup de cytokines de souris agissent également sur des cellules humaines. Cependant, ce n'est pas le cas pour toutes les cytokines, y compris celles qui sont essentielles pour l'étude de l'hématopoïèse normale et maligne dans les cellules humaines. Les techniques qui engendrent des souris pour produire des cytokines humaines (modèles transgéniques et knock-in) nécessitent des dépenses importantes avant que l'utilité du modèle ne soit démontrée. D'autres techniques nécessitent beaucoup de travail (injection de cytokine recombinante ou lentivirus) et, dans certains cas, nécessitent des connaissances techniques élevées (injection hydrodynamique d'ADN). Ce rapport décrit une méthode simple pour générer des souris PDX qui ont une cyan humaine exogèneTokine (TSLP, lymphopoïétine stromale thymique) par injection hebdomadaire intraperitoneale de stroma qui a été transduit pour surexprimer cette cytokine. L'utilisation de cette méthode fournit une source in vivo de production continue de cytokines qui atteint des niveaux physiologiques de cytokine humaine circulante dans la souris. Les niveaux plasmatiques de cytokine humaine peuvent varier en fonction du nombre de cellules stromales injectées et la production de cytokines peut être initiée à n'importe quel moment de l'expérience. Cette méthode comprend également des souris témoins négatives pour les cytokines qui sont produites de manière similaire, mais par injection intraperitoneale de stroma transduit avec un vecteur témoin. Nous avons déjà démontré que les cellules de leucémie récoltées à partir de la PDX exprimant le TSLP, par rapport au PDX de contrôle, présentent un modèle d'expression génique plus semblable à l'échantillon original du patient. Ensemble, les souris PDX produisant des cytokines et des souris cytokines négatives produites par cette méthode fournissent un système modèle que nous avons utilisé avec succès pour étudier laRôle de TSLP dans l'hématopoïèse normale et maligne.

Introduction

Les xénogreffes dérivées de patients (PDX) sont un puissant modèle in vivo pour étudier la production de cellules hématopoïétiques normales et malignes dans un environnement de mammifère "natif". Le plus souvent, la PDX est produite par injection ou transplantation de cellules humaines dans des souris immunodéficientes. La production de PDX à l'aide de cellules souches hématopoïétiques humaines normales permet des études in vivo du sang humain normal et du développement de cellules immunitaires. La PDX produite à partir de leucémie ou d'autres cellules cancéreuses permet d'étudier les mécanismes oncogènes et d'identifier des thérapies efficaces dans le contexte de la gamme des paysages génétiques et des mutations présentes dans la population humaine. 1 Par conséquent, PDX est l'étalon-or actuel pour la recherche biomédicale translationnelle pour identifier les thérapies efficaces et un outil important pour comprendre les mécanismes de progression du cancer. Les modèles PDX sont un outil essentiel pour faciliter la recherche sur les disparités en matière de santé en raison de maladies spécifiques Les lésions génétiques ou toute maladie dans laquelle les variations du paysage génétique d'un patient peuvent contribuer de manière substantielle à l'oncogenèse et aux résultats du traitement.

Les modèles PDX souris-humains sont possibles car de nombreuses cytokines de souris imitent de manière adéquate leurs analogues humains dans l'activation des récepteurs de cytokines des cellules humaines alors qu'ils se trouvent à l'intérieur de la souris. Par exemple, l'interleukine-7 (IL-7) fournit un signal critique pour le développement des cellules B humaines. 2 Dans ce cas, l'IL-7 de souris a une homologie suffisante avec l'IL-7 humaine que la cytokine de souris stimule les voies de signalisation dans les précurseurs de cellules B humaines. 2 , 3 , 4 Cependant, ce n'est pas le cas pour la lymphopoïétine stromale thymique (TSLP), 5 , 6 qui, parmi d'autres cytokines (IL-3, facteur de stimulation des colonies de granulocytes-macrophages (GM-CSF), facteur de cellules souches (SCF) ,La cytokine de souris et humaine présente une faible homologie, les cytokines de souris n'activent pas leurs récepteurs respectifs sur les cellules humaines. Pour surmonter cet obstacle, un certain nombre de stratégies ont été utilisées Pour englober l'expression de cytokines humaines chez les souris PDX, notamment l'injection de cytokines humaines recombinantes, l'injection hydrodynamique de l'ADN, l'expression lentivirale, l'expression transgénique et le remplacement du gène knockin. 7 Ce rapport décrit une méthode pour l'ingénierie de PDX pour produire une cytokine humaine par médiation par le stromal Distribution de cytokines ( figure 1 ).

Dans la méthode démontrée ici, les souris PDX sont conçues pour exprimer la cytokine humaine, la TSLP, ou pour servir de témoins négatifs à la cytokine. TSLP-exprimant PDX sont réalisés par des injections intrapéritonéales hebdomadaires de cellules stromales qui ont été transduites pour exprimer des niveaux élevés de TSLP humaine.Les souris "contrôle" PDX "anti-cytokine négatives" sont conçues de manière similaire; Bien que le stroma de contrôle soit transduit avec un vecteur témoin. Cette méthode atteint des taux physiologiques normaux de TSLP humaine chez des souris PDX injectées avec le stroma TSLP +. Aucune TSLP détectable n'est observée chez les souris PDX recevant le stroma négatif des cytokines. Nous avons sélectionné la ligne cellulaire stromale humaine HS-27A pour nos études, car elle se développe de manière robuste en culture et affiche un très faible taux de production de cytokines qui ne supporte pas la prolifération de cellules progénitrices isolées dans les cultures de cultures. 8 Pour l'expression TSLP humaine, le stroma a été transduit avec un vecteur lentiviral auto-inactif à génération avancée dérivé d'un squelette décrit précédemment, 9 et comprend l'élément cPPT / cts et l'élément régulateur post-transcriptionnel hépatite de la marbrure (WPRE) pour augmenter l'expression du transgène. Le gène TSLP humain a été construit dans ce vecteur sous le contrôle du facteur d'allongement-1(EF-1) alpha pour obtenir une expression solide, constitutive et à long terme.

L'ingénierie de ce modèle PDX amélioré par les cytokines humaines se compose de 4 étapes majeures. Tout d'abord, le stroma transduit est développé in vitro et évalué par dosage immunosorbant enzymatique (ELISA) pour une production stable et à haute teneur en cytokines. Deuxièmement, l'activité de la cytokine humaine produite par les cellules stromales transduites (et le manque d'activité de la cytokine à partir du stroma témoin) est vérifiée à l'aide de la cytométrie à flux phosphore. Les lignées cellulaires connues pour réagir à la cytokine d'intérêt (dans ce cas, TSLP) sont incubées avec un surnageant de cellules stromales et testées pour la phosphorylation induite par les cytokines. Troisièmement, les souris sont injectées avec un stroma humain transduit, puis le plasma de souris est évalué par ELISA pour des taux de cytokines humains sur une base hebdomadaire. Quatrièmement, les cellules hématopoïétiques humaines sont transplantées et les effets fonctionnels in vivo de la cytokine humaine sont évalués sur une cible connue ( P.ex. Population cellulaire).

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Figure 1: Modèle PDX conçu pour produire des cytokines humaines exogènes chez les souris. ( 1A ) Expérience de conception et obtention de cellules stromales humaines transduites ( 1B ) Obtenir des cellules humaines (cellules souches hématopoïétiques, cellules de leucémie, etc. ) pour générer des souris PDX (xénogreffe dérivée du patient). ( 2A ) Injecter le stroma manipulé et ( 2B ) transplanter des cellules humaines dans des souris immunodéficientes selon le calendrier expérimental. ( 3A-B ) Surveiller les concentrations de cytokines dans le surnageant de stroma et le plasma de souris par ELISA. ( 4 ) Récolter des cellules humaines et évaluer les effets fonctionnels in vivo de la cytokine humaine présente dans la PDX. Cliquez ici s'il vous plaitPour afficher une version plus grande de cette figure.

La délivrance de cytokines humaines par l'intermédiaire de cellules stromales offre à la fois des avantages et des inconvénients par rapport à d'autres procédés de délivrance / production de cytokines humaines chez des souris PDX. 7 Par rapport à l'injection de cytokine humaine recombinante, la délivrance à médiation par le stroma est généralement moins coûteuse (le coût de la culture de cellules stromales est inférieur au coût de la cytokine recombinante) et moins de travail intensif (une injection par semaine par injection multiple par semaine). La question de la demi-vie courte des cytokines est également atténuée puisque le stroma produit continuellement la cytokine exogène. La délivrance de cytokine par injection hydrodynamique d'ADN peut être moins coûteuse que la délivrance par stroma. Cependant, il est également transitoire et peut nécessiter plus de compétences techniques que l'injection intrapéritonéale hebdomadaire simple requise pour l'administration par stimulation du stroma. L'expression du gène lentiviral chez la souris peut fournir moins de traMéthode de distribution de cytokines; Cependant, dans nos mains, les niveaux de TSLP physiologiques n'ont pas été atteints. En outre, cette méthode nécessite beaucoup de travail, nécessitant une production continue de vecteur lentiviral. Les souris transgéniques ou knock-in offrent une expression stable à long terme de la cytokine et peuvent être conçues pour une expression spécifique des tissus, ce qui peut être un avantage. D'autre part, l'expression transgénique du gène de la cytokine humaine sur le fond de souris immunodépendant requis pour les souris PDX nécessite un immense investissement de ressources avant que la valeur du modèle ne soit établie. En outre, les modèles transgéniques ne permettent généralement pas l'option de modifier le moment de l'initiation des cytokines ou le niveau de production de cytokines in vivo . Ceux-ci peuvent être atteints avec une distribution stimulée par le stroma en modifiant simplement le point de temps pour l'initiation de l'injection de cellules stromales ou la dose de cellules stromales injectées.

La méthodologie de distribution de cytokines médiée par une cellule stromaleOd détaillé ici a été utilisé pour développer PDX pour évaluer le rôle du TSLP dans le développement normal des cellules B humaines 4 , 6 et la leucémie lymphoblastique aiguë des cellules B à haut risque. 6 Cette méthode fournit une méthode de distribution de cytokine alternative utilisée pour générer des modèles similaires avec des cytokines humaines autres que TSLP. Ce modèle peut également être utile pour générer des données préliminaires qui peuvent aider à déterminer si la valeur d'un cytokine transgénique ou cytokine knock-in PDX modèle serait digne de l'investissement en temps et en argent important.

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Protocole

Des études ont été menées conformément aux protocoles approuvés par la Commission de révision institutionnelle (IRB) de l'Université de Loma Linda et les règlements approuvés par l'IRSC et selon toutes les lignes directrices fédérales.

ATTENTION: le PDX et les tissus humains doivent être manipulés conformément aux procédures de sécurité pour prévenir la transmission des agents pathogènes transmissibles par le sang.

1. Culture et expansion des cellules stromales transduites par la cytokine

REMARQUE: Chaque fois que le stroma est passé, récolter le surnageant de culture (1 ml d'aliquote) et stocker à -80 ° C pour la quantification future du niveau de cytokines par dosage ELISA.

  1. Préparer le milieu de culture R10 et le milieu de congélation comme décrit dans la Table des matières.
  2. Générer 10 , 11 ou obtenir un stroma de contrôle (transduit avec un vecteur vide) et un stroma produisant des cytokines (TSLP +)."> 6 Stocker dans de l'azote liquide (LN 2 ) jusqu'à l'utilisation. Décongeler les cellules stromales comme décrit 12 et les plaquer dans 5 mL de milieu R10 dans des flacons de culture de cellules T-25 séparés. Cellules de culture dans un incubateur à 37 ° C avec 5% CO 2. Il s'agit du "passage # 1" post-décongelage.
  3. Une fois que le stroma est confluent (24-48 h), les cellules de passage en trypsinisant en utilisant 1 × trypsine EDTA (0,25%) et rechapage dans un flacon de culture T-150. Il s'agit du "passage # 2" post-décongelage.
  4. Lorsque le stroma atteint la confluence dans les flacons T-150 (3-4 jours plus tard), passage des cellules par trypsinisation. Utilisez cette suspension cellulaire pour les besoins expérimentaux.
    1. Expansion cellulaire à plusieurs flacons
      1. Diviser les cellules récoltées entre trois flacons T-150 et la culture jusqu'à confluent. Répétez cette étape si l'extension du stroma est nécessaire. Le nombre de cellules stromales humaines (HS-27A) typiques à la confluence dans un ballon T-150 est de ~ 5 x 10 6 .
    2. Celluless'emporter
      1. Transférer la suspension cellulaire récoltée dans un tube conique et centrifuger à 500 xg pendant 5 min, décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un milieu de congélation. Geler et stocker dans LN 2 ~ 1,5 x 10 6 cellules par flacon.
    3. Pour les injections de stroma intra-périotoneal chez la souris, passez à l'étape 4.1.

2. Essais ELISA pour surveiller la production de cytokines in vitro à partir de Stroma transducteur

  1. Achetez un kit de dosage ELISA disponible dans le commerce pour détecter la cytokine d'intérêt.
  2. Décongeler le surnageant de cellules stromales à partir du stroma de contrôle et de production de cytokines (TSLP +) récolté aux passages tôt, moyen et tardif ( figure 2 ).
  3. Déterminer la concentration de TSLP dans les échantillons de surnageant en utilisant un kit ELISA selon les instructions du fabricant. 13 Compilez ces données en série pour surveiller la stabilité de la production de cytokines pendant la culture cellulaire E ( Figure 2A-B ).
    1. Identifier et éliminer le stroma produisant des cytokines avec une expression de cytokines réduite ou moins optimale, ainsi que les flacons correspondants en stockage ( Figure 2A-B ).
    2. Identifiez et maintenez le stroma produisant des cytokines qui démontrent des concentrations de cytokines stables et à haut niveau. Utilisez ces décongélations pour des expériences.
  4. Utilisez le kit ELISA pour surveiller systématiquement le stroma pendant toute la durée de la culture cellulaire (au moins 1 fois pendant les passages post-décongélation tôt, moyen et tardif) pour assurer une production stable de cytokines ou, dans le cas du stroma de contrôle, l'absence de production de cytokines .

3. Tests de cytométrie à flux phosphore pour évaluer l'activité de la cytokine produite par Stroma

NOTE: Évaluez le surnageant du stroma modifié avant la première expérience pour vérifier la bio-activité pertinente de la cytokine générée par le stroma pour une expérience individuelle.Ef "> 6 Une fois que le stroma manipulé est validé, d'autres tests ne sont pas nécessaires, à moins que des stroma ne soient introduits avec un nouveau vecteur.

  1. Achetez les lignées cellulaires de la leucémie MUTZ5 et / ou MHH-CALL4 (TSLP réactive), 14 cytokines humaines recombinantes et des anticorps approuvés pour une utilisation dans des analyses de cytométrie phospho-flux pour détecter des cibles appropriées de phosphorylation en aval.
  2. Décongeler le surnageant récolté du contrôle et du stroma exprimant les cytokines.
  3. Placer les lignées cellulaires de leucémie dans un milieu R20 (voir le tableau des matériaux ) à une concentration de 0,2 x 10 6 cellules par puits dans une plaque de culture tissulaire à 96 puits. Plaque 3 puits par condition pour permettre des essais en triple. Incuber pendant 2 h à 37 ° C. Cette fois permet de perdre toute phosphorylation qui s'est produite pendant les conditions de culture antérieures.
    NOTE: 12 puits par ligne cellulaire fournissent des essais en triple pour chaque condition expérimentale indiquée à l'étape 3.4.
  4. Après 2 h de culture, transférez les cellules de chaque puits pour séparer les tubes de 4 mL et centrifuger à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant.
    1. Réinstaller les cellules dans 200 μL pour chacune des conditions expérimentales suivantes (effectuer des analyses en trois exemplaires): 1) média de contrôle négatif, 2) milieu de contrôle positif avec cytokine recombinante à la (des) concentration (s) saturante (TSLP à 15 ng / ML, etc. ), 3) contrôle du stroma-surnageant du stroma de contrôle, et 4) surnageant de cytokine-stroma du stroma producteur de cytokines.
  5. Incuber les cellules pendant la durée spécifiée par un phospho-dosage commercial spécifique ( par exemple 30 min pour phospho-STAT5 dans MUTZ5 ou MHH-CALL4 en réponse à TSLP).
  6. Centrifuger à 500 xg pendant 5 min à 4 ° C et décanter le surnageant.
  7. Effectuer une coloration par cytométrie à flux phosphore par protocole du fabricant et recueillir des données de cytométrie en flux. 15
  8. Analyser les données de cytométrie en flux. 15
    1. Portez sur des cellules intactes en fonction de la dispersion de l'avant (FSC, indique la taille de la cellule) et côté (SSC, indique la granularité cellulaire).
    2. Déterminer l'intensité médiane de fluorescence (IMF) des cellules intactes dans chaque échantillon. Comparez l'IMF moyenne obtenue à partir des valeurs tripartites du surnageant de cellules stromales par rapport aux contrôles médiatiques positifs et négatifs.

4. Injection de stroma transducteur de cytokine en souris

REMARQUE: stroma HS-27A de culture pour un minimum de 3 passages post-décongélation avant de les injecter dans des souris pour assurer des cellules saines et une production adéquate de cytokines.

  1. Préparation du stroma
    1. Transférer la suspension de cellules stromales récoltées à un tube conique et une aliquote de 10 μL pour le nombre d'hémocytomètres; Obtenir un nombre de cellules vivantes en utilisant du bleu trypan. 16 Centrifugez le resteLl de suspension à 500 xg pendant 5 min.
    2. Aspirer le surnageant des cellules granulées et resuspendre doucement les cellules dans le volume nécessaire de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) pour l'injection de souris (selon le nombre de souris à injecter).
      NOTE Concentration typique des cellules stromales pour l'injection de souris: 0,5 x 10 6 -5 x 10 6 cellules par souris dans 200 ul de PBS.
    3. Gardez la suspension de la cellule stromale à 4 ° C (ou sur la glace) jusqu'à immédiatement avant l'injection. Assurez-vous que la suspension cellulaire est au moins à température ambiante (RT) (~ 25 ° C) pour l'injection de souris.
  2. Injection cellulaire stromale
    1. Désinfectez la hotte de sécurité biologique, assemblez les matériaux pour les injections, puis placez la cage de la souris à l'intérieur.
    2. Mélanger délicatement la suspension cellulaire par inversion avant d'établir 200 μL dans une seringue de tuberculine.
    3. En utilisant des techniques d'injection intrapéritonéale standard, 17Retenir la souris et administrer la suspension cellulaire de 200 μL dans la cavité péritonéale. Les détails ont déjà été démontrés par Machholz et al. 18

5. Collecte de sang en série et surveillance du plasma pour la cytokine humaine exogène chez les souris

  1. Collecte de sang par collage de queue
    1. Désinfectez le capot de biosécurité et assemblez le dispositif de retenue de la souris, les ciseaux et autres outils / fournitures pour la procédure.
    2. Placez la souris dans un dispositif de retenue et fixez le tube pour minimiser le mouvement de la souris.
    3. Désinfectez la queue et les ciseaux chirurgicaux avec de l'alcool isopropylique. Appliquer une crème anesthésique topique sur la queue.
    4. En utilisant des ciseaux chirurgicaux très pointues, retirez environ 0,5 à 1 mm de la pointe de la queue de la souris. Recueillir environ 80 μl de sang périphérique à l'aide de tubes capillaires héparinés.
      NOTE: Si le sang est collecté avec cette méthode, plus de six tiMes, l'élimination de la queue doit être conservatrice en ce qui concerne la quantité de queue enlevée. Au fur et à mesure que les poinçons progressent dans la queue, le diamètre augmente, il hémorragie plus rapidement et la guérison prend plus de temps.
  2. Séparation plasmatique
    1. Transférer le sang à l'aide d'une seringue à bulbe (pour l'expulser des tubes capillaires) dans un tube de microtain K2 EDTA marqué; Inverser 20 fois pour éviter la coagulation.
      REMARQUE: En règle générale, la coagulation du col de la queue est rapide. Cependant, si l'hémorragie persiste plus de ~ 2 minutes, utilisez un crayon / poudre styptique pour faciliter la coagulation.
    2. Centrifuger les tubes de collecte de sang selon les instructions du fabricant et allumer le plasma pour le stockage (-20 ° C) jusqu'à ce qu'il soit prêt pour le dosage ELISA.
    3. Si des données de chimère de cellule souris-humain sont nécessaires à partir du sang de souris, puis traiter la pastille restante comme décrit à l'étape 6.3.1. Sinon, jeter la pastille de cellules sanguines.
  3. ELISA modifié pour micro-volUn plasma de souris
    REMARQUE: La procédure ELISA du fabricant a été modifiée du volume d'échantillon recommandé de 100 μL à un volume de 40 μL pour tenir compte des micro-volumes recueillis auprès des souris. Il n'est pas possible d'exécuter les échantillons de plasma de souris in vivo en trois exemplaires avec ces volumes limités. À la fin de l'expérience, 500 μL de sang post-mortem sont recueillis par ponction cardiaque. Les concentrations de cytokines évaluées dans 100 μL de plasma d'euthanasie sont utilisées pour valider les données in vivo de 40 μL pour chaque souris.
    1. Décongeler les échantillons de plasma de souris congelés.
    2. Diluer les normes ELISA en série et les plaquer par triplicat à 40 μL par puits.
    3. Ajouter 40 μL de chaque échantillon de plasma souris à la plaque ELISA.
      REMARQUE: si un échantillon de souris est inférieur à 40 μL, augmentez le volume jusqu'à 40 μL avec un tampon ELISA. Notez ce volume de diluant et utilisez-le pour calculer un facteur de dilution pour chaque échantillon dilué. QuandL'analyse des données ELISA multiplie la concentration d'échantillon dilué par le facteur de dilution de l'échantillon pour déterminer la concentration réelle de cytokine dans l'échantillon d'origine.
    4. Compléter le dosage ELISA selon les instructions du fabricant.

6. Transplantation de cellules hématopoïétiques en souris

  1. L'irradiation sublimale pour conditionner la moelle osseuse pour transplanter
    NOTE: Loma Linda University (LLU) utilise une source de rayonnement Cobalt-60. Les animaux sont placés dans un dispositif de retenue de tarte qui est positionné à 80 cm de la source de rayonnement dans un champ de 20 x 20 cm et avec une couche de 0,5 cm de Lexan au dessus du dispositif de retenue. Le temps d'exposition est calculé pour obtenir une dose de 225 cGy basée sur l'étalonnage de source le plus récent (actuellement 2 à 3 minutes pour cette source).
    1. Souris sous-létalement irradiées (dose totale d'irradiation corporelle de 225 cGy maximum pour les souris immunodéficientes).
    2. Transplanter les cellules hématopoïétiques ~ 24 h plus tard via </ Em> injection intraveineuse de veine de queue.
  2. Transplantation intraveineuse de cellules hématopoïétiques
    1. Préparer des suspensions de cellules humaines pour la transplantation dans un volume de 200 μL de PBS stérile par souris: CD34 + cellules souches hématopoïétiques (HSC): 1 x 10 5 à 5 x 10 5 cellules par lignée cellulaire de la souris et de la leucémie / échantillons de patients: 1 x 10 6 à 5 x 10 6 cellules par souris.
    2. Garder les cellules à 4 ° C (transport sur glace) jusqu'à immédiatement avant la transplantation. Assurez-vous que les cellules sont au moins à la RT avant la transplantation.
    3. Désinfectez la hotte de protection biologique et prépare la zone du capot pour les injections de transplantation.
    4. Placez la souris dans la cage de réchauffement pendant au moins 5 minutes pour permettre la dilatation des veines de la queue.
    5. Mélanger doucement la suspension cellulaire et étirer 200 μL dans une seringue de tuberculine. Saisissez l'aiguille de façon sûre là où elle restera stérile.
    6. Placez la souris dans un dispositif de retenue et désinfectez la queue avec de l'alcool isopropylique.
    7. En utilisant des techniques d'injection intraveineuses standard, 17 injecte la suspension de cellules humaines dans la veine de queue de souris.
      REMARQUE: les injections de veine de queue peuvent prendre plusieurs tentatives, en particulier pour un manipulateur d'animaux débutants. La vidéo JoVE de Kovacscics et Raper 19 fournit une démonstration détaillée de cette technique animale.
    8. Surveillez la récupération de la souris pendant environ 5 min. Enregistrer les effets indésirables lors de l'injection ( p. Ex. Cellules renversées, hémorragie majeure, traumatisme excessif).
  3. Analyse du chimérisme des cellules humaines dans le sang périphérique de souris
    1. Obtenir la pastille de cellules sanguines restant dans le tube de microtainer après séparation par plasma (étape 5.2.3).
    2. Pour la lyse des globules rouges (RBC), réinsérez la pastille de sang restante dans un volume de PBS égal au plasma éliminé (pour remplacer le volume de plasma) et mélangez bien (vortex / pipette).
    3. Transférer chaque échantillon de sang ré-suspendu à un tube de 4 mL étiquetéEt ensuite ajouter un tampon de lyse RBC à chaque tube dans un rapport 1: 9 (900 μL de tampon de lyse RBC pour 100 μL de sang ré-suspendu). Incuber pendant 5 min à la RT. Centrifugeuse (5 min, 500 xg) et décantation.
    4. Effectuer une deuxième incubation du tampon de lyse RBC (5 min à la RT). Centrifuger et décanter comme précédemment.
    5. Laver les cellules restantes dans ~ 1 mL de PBS. Centrifuger et décanter comme précédemment.
    6. Resuspendre la pastille dans un volume de PBS approprié pour la coloration par cytométrie à flux standard (cela varie en fonction du fabricant et des protocoles de laboratoire individuels). 20 Utiliser des anticorps immunophénotypés validés pour la cyotérérité de flux pour identifier les cellules de souris (souris CD45 +) et les cellules humaines (CD45 + humain) 6 , 21 Ainsi que d'autres marqueurs de leucocytes humains spécifiques à la lignée cellulaire d'intérêt.
      REMARQUE: Il est recommandé de prendre un petit volume (5 μL-20 μL) de chaque échantillon de souris pour créer des "échantillons groupés"; À utiliser pour les échantillons non contrôlés, viables et isotypiques. Il est préférable d'avoir des contrôles non conservés et des isotypes pour chaque condition expérimentale.

7. Evaluation fonctionnelle de l'activité Cytokine In vivo

  1. Euthanasie de la souris et récolte des tissus
    1. Éuthaniser les souris par asphyxie au CO 2 au point de temps expérimental désigné.
    2. Récolte le sang par ponction cardiaque et collectez le plasma comme indiqué aux étapes 5.2.1-5.2.2.
      REMARQUE: Recueillir le sang avant d'autres tissus car il commence à coaguler immédiatement après la mort.
    3. Traiter le sang de la souris, l'aliquote et stocker le plasma comme à l'étape 5.2.2.
      1. A plus tard, évaluer la concentration exogène de cytokines dans le plasma obtenu à l'euthanasie par ELISA selon le protocole du fabricant. Évaluer et comparer les concentrations exogènes de cytokines dans le plasma de souris de la série in vivoLa collecte de sang et les échantillons de plasma d'euthanasie (décrits à la section 5.3).
    4. Ajouter le PBS à l'échantillon de sang restant pour remplacer le volume et le processus du plasma comme décrit aux étapes 6.3.1 et 6.3.2. Effectuer des analyses de cytométrie de flux immédiatement ou ré-endiguer les cellules dans un milieu de congélation pour le stockage de LN 2 .
  2. Ramasser la moelle osseuse (BM) et la rate à partir de souris PDX et préparer des suspensions de cellules simples comme décrit précédemment. 22
  3. Obtenez le nombre de cellules pour chaque échantillon de tissu de souris PDX en utilisant de l'acide acétique à 3% avec du bleu de méthylène (les membranes cellulaires de lyses et les globules rouges quittant les noyaux intacts de cellules vivantes) dans une dilution 1: 1 et comptez les cellules en utilisant un hémocytomètre. Tabuler le nombre total de cellules pour les échantillons de moelle osseuse et de rate pour chaque animal.
  4. Centrifuger (500 xg, 15 min) des suspensions de cellules et décanter le surnageant. Effectuer des analyses de cytométrie de flux de cellules de la moelle osseuse et / ou des cellules de la rate immédiatement ou resuspendre dans un milieu de congélation pour LN 2 de stockage.
    REMARQUE: congéluez 10 portions aliquotes BM (pour les futurs essais biochimiques) et ~ 5 portions aléatoires de rate (pour les futures transplantations PDX) par souris.
  5. Immunophénotypage pour identifier les effets fonctionnels in vivo
    1. Préparez un mélange maître (MM) d'anticorps anti-cytométrie en flux pour une population hématopoïétique immunophénotype répondant à la cytokine d'intérêt et un deuxième MM d'anticorps anti-isotype ( Figure 5 et Tableau des Matériaux).
    2. Découper les aliquotes de tissus PDX (bain de talon à 37 ° C) préparé à l'étape 7.4.
    3. Lavez les cellules décongelées en les transférant dans un tube conique et en ajoutant au moins 3x de volume de PBS. Centrifugeuse (500 xg, 5 min) et décantez le surnageant.
    4. Répétez l'étape de lavage (7.5.3).
    5. Créez des aliquotes groupées en prenant des cellules ~ 10 μL-20 μL de chaque échantillon PDX pour le contrôle non contrôlé, le contrôle de viabilité et les contrôles d'isotype (voir la note 6.4.6). Tenez tous les échantillons, à l'exception de vousContrôle intrinsèque, avec un colorant de viabilité fixable (marqueur de cellules mortes), incubation et lavage selon le protocole du fabricant.
    6. Tacher chaque échantillon de cellules PDX avec phénotypage-MM selon le protocole de coloration par cytométrie de flux standard; Tache également le (s) échantillon (s) d'isotype-contrôle mis en commun avec l'isotype-MM. Incuber tous les échantillons, laver avec du PBS et corriger les échantillons en les replaçant dans du paraformaldéhyde à 1%.
    7. Collectez des données de cytométrie de flux et analysez les données en utilisant une stratégie de verrouillage appropriée pour la (les) population (s) cellulaire (s) d'intérêt ( Figure 5 ). Un déclenchement typique est le suivant:
      1. Définissez les cellules intactes en dessinant une porte FSC et SSC qui exclut les débris.
      2. Identifiez la population des cellules vivantes en gating sur les cellules qui sont négatives pour le marqueur de la cellule morte (il s'agit des «cellules vivantes totales»).
      3. Utilisez des sous-portes dans les «cellules vivantes totales» pour définir les populations de cellules avec l'immunophénotype désiré (voir la figure 5).
      4. Obtenir leFréquence des populations de cellules sous-jacentes dans le nombre total de cellules vivantes provenant de l'analyse par cytométrie en flux. 6 , 21
    8. Calculer le nombre de cellules cibles dans chaque tissu en multipliant la fréquence du sous-ensemble de cellules B, dans les cellules vivantes totales (obtenues à l'étape 7.5.6.4) par le nombre total de cellules vivantes par tissu obtenu à l'étape 7.3 (% sous-ensemble de cellules B x " Nombre de cellules d'hémocytomètre ", voir le tableau 1 )
    9. Comparer les comptes cellulaires des populations de cellules cibles entre les souris PDX témoins et les souris PDX exprimant les cytokines (TSLP +) pour déterminer les effets fonctionnels in vivo de la cytokine humaine exotique ( tableau 1 ).

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Résultats

Un aperçu du modèle est illustré à la figure 1 . Une fois que la production de cytokine (TSLP + stroma) et le stroma de contrôle ont été obtenus, ils sont développés en culture. Avant l'injection de stroma chez la souris, le surnageant de cellules stromales est évalué par ELISA pour vérifier la production de cytokines ( Figure 2 ) et la cytométrie à flux phosphore (Protocole n ° 3) est utilisée pour vérifier l'activité de la cytokine produite par...

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Discussion

Ce manuscrit décrit une méthode simple, rapide et relativement rentable pour l'ingénierie PDX pour exprimer des cytokines humaines exogènes. La stratégie décrite ici est basée sur des injections intrapéritonéales hebdomadaires d'une lignée cellulaire stromale transduites pour exprimer la cytokine humaine, TSLP. Avant d'exécuter les méthodes décrites ici, le stroma conçu pour exprimer des niveaux élevés de cytokine d'intérêt (TSLP) et un stroma de contrôle de même ingénierie ont été générés. Dans les prot...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, une bourse Hyundai Hope on Wheels Scholar, le Département de pathologie et d’anatomie humaine, le Département des sciences fondamentales et le Centre pour les disparités en matière de santé et la médecine moléculaire de la Faculté de médecine de l’Université de Loma Linda, ainsi que par une subvention de l’Université de Loma Linda pour promouvoir la recherche collaborative et translationnelle de l’Université de Loma Linda (KJP). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles du NIH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
forts  ;
T-25 Nunc Cell Culture Treated EasYFlasks, capacité de 7 mL, surface de culture de 25 cm²Thermo Scientific / Fisher156367
T-75 Falcon Tissue Culture Treated Flask, capacité de 250 mL, surface de culture de 75 cm² et capuchon ventiléCorning Inc. / Fisher353136
T-150 Falcon Flacon traité pour la culture tissulaire, capacité de 600 ml, 150 cm² ; espace culturel & PipettesCorning Inc. / Fisher355001
10 mLFalcon357551
15 mL Tubes coniques en polypropylèneFisher05-539-12
Tubes en polystyrène à fond rond de 5 mLFalcon352054
50 mL Tubes coniques en polypropylèneFalcon352098
2,0 mL, filetage externeCorning Inc. / Fisher4230659
pointes de pipette de 1 mLFisher2707509
200 &mu ; L pointes de pipette  ;Denville ScientificP3020-CPS
10 &mu ; Pointes de pipette en LDenville ScientificP-1096-CP
Unités de filtration stériles jetables avec membrane SFCA, Nalgene Rapid-FlowFisher09-740-28D
2 NH2SO4  ; BioLegend423001
Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calicium ni magnésium, 1& fois ;Corning cellgro/ Mediatech21-031-CV
Human TSLP ELISA Max Deluxe SetBioLegend434204
3 % d’acide acétique avec bleu de méthylèneStemcell Technologies7060
Trypan Blue  ;Corning25-900-CL
"Trypsine » 1x 0,25 % Trypsine 2,21 mM EDTA dans HBSSThermoFisher25-053
TWEEN 20 BioXtraSigma-AldrichP-7949
 » R10" milieu de culture cellulaire, % du volume total (565 ml)--Lab Recipe
RPMI, 88,5 % (500 mL)  ;Mediatech10-040-CV  ;   ;
FBS, 9,9 % (56 mL)  ;Mediatech35-011-CV
L-Glutamine, 0,99 % (5,6 mL)  ;Mediatech25-005-Cl
Pénicilline-Streptomycine, 0,50 % (2,8 mL)  ;Mediatech30-002-Cl
2-Mercaptoéthanol, 0,10 % (560 µ ; L)  ;MP190242
" R20 » milieu de culture cellulaire, % du volume total (pour une dose de 195 ml)--<strong>Lab Recipe
  ;   ;   ;   ; RPMI, 76,84 % (150 mL)voir ci-dessusvoir ci-dessus
  ;   ;   ;   ; FBS, 20,49 % (40 ml)voir ci-dessusvoir ci-dessus
  ;   ;   ;   ; 2 mM de L-glutamine, 1,02 % (2 mL)voir ci-dessusvoir ci-dessus
.   ;   ;   ; 1 mM de Na pyruvate, 1,02 % (2 mLvoir ci-dessusvoir ci-dessus
  ;   ;   ;   ; Pénicilline-Streptomycine,  ; 0,51 % (1 ml)voir ci-dessusvoir ci-dessus
  ;   ;   ;   ; 2-Mercaptoéthanol, 0,10 % (0,1 M),  ; 0,10 % (200 et micro ; L)voir ci-dessusvoir ci-dessus
" Milieu de congélation », % du volume total--Recette de laboratoire
 » R10" moyen, 45 %voir « R10 »recipe-FBS
, 20 %voir ci-dessus35-011-CV
DMSO, 10Corning25-950-CQC
D(-)(+)-Tréhalose dihydraté, 5 %Fisher ScientificBP2687-100
NameCompanyCatolog Number Comments
Biologics  ;
"HS-27 » HS-27A lignée de stroma humainATCCCRL-2496
"CALL-4 » MHH-CALL-4 lignée cellulaire, leucémie précurseur de cellules B humainesDSMZACC 337
 » Souris NSG" HOCHER. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, mâle ou femelle, 6 ans &ndash ; 8 semainesJAX Mice  ;# 005557
lignée cellulaire MUTZ-5, leucémie précurseur des lymphocytes B humainsDSMZACC 490
Protéine TSLP humaine recombinanteR& D Systems1398-TS-010
Name>CompanyCatolog NumberComments
Anticorps anti-cytomère en flux (clone)*
Anti-souris CD45 FITC (30F11)Miltenyi Biotec130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (l’autre nom est IL-7R&alpha ;)Miltenyi Biotec130-098-094
CD34 APC (8G12)BD Biosciences340667
CD45 PE-Cy7  ; (HI30)eBioscience25-0459
"FVD » Colorant de viabilité fixable  ; eFluor 780  ;eBioscience65-0865
Ig &kappa ; chaîne légère FITC  ; (G20-193)BD Pharmingen555791
 ; chaîne légère FITC (JDC-12)BD Pharmingen561379
IgD PE (IA6-2)BioLegend348203
IgM PE-Cy5 (G20-127)BD Biosciences551079
pSTAT5 PE,  ; souris anti-STAT5 (pY694)BD PhosphoFlow612567
Nom CompanyCatolog NumberComments
Autres matériaux et équipements  ;
Animal Implantable Nano Transpondeur avec CanulaTrovan  ;ID-100B(1.25)
Crème anesthésique à la lidocaïne EMLA (obtenue par anticipation auprès d’un établissement de soins aux animaux)prescription
BD ½ ; cc LO-DOSE U-100 Seringue à insuline 28G½ ;   ;BD#329461
Tubes micro-récipients BD avec K2EDTABD  ;#365974
CentrifugeuseBeckman CoulterAlegra X-15R  ;
FisherBrand Tubes capillaires (héparinisés)Fisher Scientific22-260-950
HémocytomètreFisher02-671-6
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-343
Cage à tarte pour sourisBraintree Scientific, Inc.MPC-1
Mouse Tail Illuminator RestrainerBraintree Scientific, Inc.MTI STD
Pistol Grip ImplanterTrovan  ;IM-300(1.25)
µ ; Quant  ;Bio-Tek Instruments Inc.MQX200
Logiciel d’analyse par cytométrie en flux FlowJo, LLCVersion 10
*Tous les anticorps sont anti-humains, sauf indication contraire.
sérologiques )  % Ig &lambda

Références

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