La quantification absolue de Aß 1-42 Dans le LCR aide d'une référence Procédure de mesure de spectrométrie de masse

Summary

Une procédure de mesure de référence pour la quantification absolue de Aβ_1-42 dans le LCR humain basée sur l’extraction en phase solide et la chromatographie en phase liquide par spectrométrie de masse en tandem est décrite.

Abstract

La maladie d’Alzheimer (MA) est la maladie neurodégénérative la plus fréquente chez les personnes âgées et représente 60 à 80 % de tous les cas de démence. Actuellement, le diagnostic de la MA est basé sur des tests cognitifs et des examens de l’état mental, mais le peptide bêta-amyloïde (Aβ) dans le liquide céphalo-rachidien (LCR) est de plus en plus utilisé dans les essais cliniques et les contextes. Comme pour la plupart des biomarqueurs protéiques et peptidiques, la quantification est effectuée à l’aide de techniques basées sur les anticorps, telles que le dosage immuno-enzymatique (ELISA). Cependant, la variabilité intra et inter-laboratoire de ces tests entrave son utilisation comme marqueur diagnostique dans la routine clinique.

Une procédure de mesure de référence (RMP) indépendante des anticorps a été développée sur la base de l’extraction en phase solide (SPE) et de la chromatographie liquide (LC)-spectrométrie de masse en tandem (MS/MS), où des peptides Aβ stables et marqués par isotope ont été utilisés comme étalons internes, permettant une quantification absolue. Un instrument hybride quadripôle-orbite à haute résolution a été utilisé pour les mesures. La méthode permet de quantifier le LCR Aβ_1-42 entre 150 et 4 000 pg/mL.

Introduction

La maladie d'Alzheimer (MA) est la forme la plus courante de démence et affecte environ 35 millions de personnes à travers le monde ^1. Les caractéristiques neuropathologiques de la maladie largement soupçonné d'être au cœur de la pathogenèse de la MA sont des enchevêtrements neurofibrillaires intracellulaires de protéine tau hyperphosphorylée ² et plaques extracellulaires composées de agrégées bêta-amyloïde (Aß) peptides ^3. Conformément à cela, l'évaluation de la plaque pathologie in vivo par des biomarqueurs a récemment été inclus dans les critères diagnostiques de recherche....

Protocol

NOTE: Ce protocole exige des aliquotes d'au moins 50 ul, avec une concentration de 50 pg / ml pour chaque peptide Aß, en tant que matériau de départ. Les peptides Aß doivent être dissous dans 20% d'acétonitrile (ACN) et une solution à 4% d'ammoniac concentrée dans de l'eau déminéralisée (v / v) et stockées à 80 ° C.

Attention: Voir le tableau 1 pour les informations de sécurité.

1. Préparation des solutions

1. Préparer 100 ml de 20% d'ACN et de 4% d'une solution concentrée d'ammoniaque dans de l'eau déminéralisée (v / v) en diluant 20 ml d'ACN et 4 m....

Results

La configuration de la plaque à la figure 1 est utilisé pour une assiette pleine d'échantillons. Si moins d'échantillons inconnus sont à analyser, la deuxième calibrateur, RF, et QC ensembles doit être placé après la première moitié des échantillons inconnus.

Comme on le voit sur la figure 2, les calibrateurs sont proches de la ligne de régression, avec de faibles écarts - types. Cette méthode.......

Discussion

Pour le procédé décrit, au lieu d'utiliser une matrice de substitution, on a utilisé la méthode de remplacement de l' analyte ^{13, 14, 15, 16,} ce qui permet un calibrage dans le LCR humain. L'approche de l'analyte de substitution implique deux normes marqués par des isotopes différents. L' une ⁽¹⁵ NAβ ₁₄₂₎ est utilisé pour générer la courbe d'étalon.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eppendorf Protein LoBind Microtubes à centrifuger, 0,5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind Tubes à centrifuger, 1,5 mL	Eppendorf	022431081
Eppendorf Protein LoBind Tubes à centrifuger, 2 mL	Eppendorf	022431102
Eppendorf Protein LoBind Tubes à centrifuger, 5 mL	Eppendorf	0030 108.310
Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96	Eppendorf	951032905
Micronic 0,75 mL Tubes en polypropylène, à fond en V	Micronic	MPW32071BC3	Tubes utilisés pour collecter l’éluat SPE, mais d’autres dispositifs de collecte peuvent être utilisés tels que des plaques à 96 puits.
Micronic Split TPE Capcluster pour tubes de 96 pouces	Micronic	MP53026	Capuchons pour tubes Micronic.
Micronic Loborack-96 blanc avec couvercle haut code-barres	Micronic	MPW51015BC3	support pour tubes Micronic.
Embouts Biohit Optifit 1,2 mL	Sartorius	791210	Utilisé pour atteindre jusqu’au fond des plaques de puits profonds LoBind (96 puits). D’autres pointes étroites pourraient également fonctionner.
Eaux Oasis MCX 96-puits & micro ; Plaque d’élution	des eaux	186001830BA  ;
Réservoir de collecteur à plaques	Waters	WAT058942
Waters Collecteur à plaques d’extraction pour Oasis à 96 puits Plaques	186001831		d’hydroxyde
d’ammonium, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25 % base NH3	Sigma-Aldrich	30501-1L-D
Acétonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L	Fisher Scientific	A/0627/17X
Acide ortho-phosphorique 85 %, ACS,ISO,Reag. Ph Eur	Merck Millipore	1005731000
Chlorhydrate de guanidine, 500 g	Thermo Scientific	24110
Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Spectromètre de masse	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMAZR	Avec Dionex Ultimate 3000 LC et échantillonneur automatique fournis.
Dionex ProSwift RP-4H Colonne monolithique (1,0 x 250 mm)	Dionex	066640
Albumine sérique bovine, poudre lyophilisée, convient pour (pour la biologie moléculaire),	Sigma-Aldrich	B6917
Bêta-amyloïde (1-42), Ultra Pure, TFA	rPeptide	A-1002-2
15N Bêta-amyloïde (1-42), Uniformément étiqueté	rPeptide	A-1102-2
13C Bêta-amyloïde (1-42),	Agitateur de microplaques rPeptide	A-1106-2
TiMix 2	Edmund Bü ; HLER	6110 000