Article de méthode

Préparation du Primat tissu cérébral non humain pour immunohistochimie pré-enrobage et microscopie électronique

DOI :

10.3791/55397

⸱

3 avril 2017

 , 
1Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec, Department of Psychiatry and Neuroscience, Université Laval, 2Centre de recherche du CHU Sainte-Justine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous offrons un moyen facile, peu coûteuse et efficace protocole temps pour fixer chimiquement le tissu cérébral des primates avec acroléine fixatif, permettant la conservation à long terme qui est compatible avec l'immunohistochimie pré-enrobage pour la microscopie électronique à transmission.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En dépit de toutes les avancées technologiques au niveau de la microscopie optique, la microscopie électronique reste le seul outil en neurosciences pour examiner et caractériser les détails ultrastructuraux et morphologiques des neurones, tels que des contacts synaptiques. Une bonne conservation du tissu cérébral pour la microscopie électronique peut être obtenu par des procédés cryo-fixation rigoureux, mais ces techniques sont plutôt coûteuses et limiter l'utilisation de immunomarquage, ce qui est crucial pour comprendre la connectivité des systèmes neuronaux identifiés. méthodes gel de substitution ont été mis au point pour permettre la combinaison de cryo-fixation avec immunomarquage. Cependant, la reproductibilité de ces approches méthodologiques repose généralement sur des dispositifs de congélation coûteux. De plus, l'obtention de résultats fiables avec cette technique est très consommatrice en temps et compétences difficiles. Par conséquent, le cerveau traditionnel chimiquement fixe, en particulier avec l'acroléine fixatif, reste un temps efficace et méthode peu coûteuse pour combiner électroniquemicroscopie avec immunohistochimie. Ici, nous fournissons un protocole expérimental fiable en utilisant la fixation d'acroléine chimique qui conduit à la préservation du tissu cérébral des primates et est compatible avec immunohistochimie pré-enrobage et de transmission examen au microscope électronique.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopie optique, y compris la microscopie confocale et à deux photons, est avérée être un outil efficace pour l' étude in vivo des processus neuronaux, entre autres 1, 2. Bien que la résolution spatiale typique au niveau de lumière microscopique (LM) est d' environ 200 nm, les progrès technologiques récents utilisant différentes sources de lumière, telles que l' ultraviolet extrême et la microscopie à rayons X mous, ont notablement augmenté cette résolution à une résolution spatiale de près de 10 nm 3 , 4, 5. D' autres avancées technologiques dans l' imagerie comprennent l' imagerie par résonance magnétique combinés avec l' histologie et de fournir un nouveau procédé pour mesurer l'épaisseur de la gaine de myéline in vivo, un paramètre qui est traditionnellement mesurable seulement au niveau de microscopie électronique (EM) 6, 7. although ces progrès au niveau des LM fournissent un excellent outil pour l'étude des processus vivants, une vue détaillée et la caractérisation des structures, telles que les contacts synaptiques, ne peuvent être atteints avec EM, qui offre une résolution qui peut atteindre 0,5 nm. Cependant, l'observation au niveau EM exige que les spécimens morts et modifié à certains égards, avec fixateurs chimiques et des procédés de déshydratation, afin de préserver la cytoarchitecture. Ainsi, l' examen d' échantillons biologiques à haute résolution peut être difficile en raison de dégâts d'irradiation du faisceau d'électrons, un faible contraste, les écarts de structure des membranes, ou même la présence d'artefacts qui peuvent se produire suite à l' incorporation déshydratation et époxy 8, 9, 10.

La préservation des spécimens dans leur forme native pour l'analyse structurelle peut être obtenue en utilisant « Cryo EM des sections vitrifiés » ou CEMOVIS, qu'une approche tronçonnageconsiste à congeler rapidement et l' incorporation de l'échantillon dans de la glace vitreuse et en examinant les sections sous le EM à une température cryogénique 11, 12. Cette procédure permet l'examen des échantillons alors qu'ils sont encore solides et totalement hydratée, éliminant ainsi les artefacts causés par des processus de déshydratation 13. Cependant, cette méthode implique des dispositifs supplémentaires pour cryo-ultramicrotomie, ainsi que des dispositifs supplémentaires sur l'EM standard, afin de permettre cette observation à des températures très basses, qui génèrent des coûts supplémentaires importants. De plus, l'approche CEMOVIS exclut l'utilisation de techniques immunomarquage, car les anticorps doivent généralement être mis en incubation à la température ambiante. Sinon, il est possible de combiner l'analyse ultrastructurale des procédures immunohistochimie en utilisant une approche gel de substitution, au cours de laquelle des échantillons fixés Cryo sont lentement décongelés tout immerged dans les produits chimiques cryo-protecteurs et sont een embarqué dans des résines spécialisées, telles que Lowicryls. Immunomarquage post-enrobage peut ensuite être effectuée sur un tel matériau 12. Cependant, le gel de substitution et de techniques de cryopréservation fixation prennent beaucoup de temps. Ils nécessitent l'installation d' un équipement supplémentaire et nécessitent encore des échantillons d'être exposés au solvant organique et un fixateur chimique qui peut altérer la cytoarchitecture, malgré l'utilisation d'une basse température 14, 15. Par conséquent, en dépit de toutes les avancées technologiques , tant au niveau LM et EM, fixation chimique du tissu cérébral, en particulier avec l' acroléine, reste un faible coût et une méthode efficace de combiner le temps immunohistochimie avec EM 16.

Au cours des dernières décennies, de nombreuses tentatives ont été faites pour trouver un mélange d'aldéhydes qui offrent la meilleure conservation des tissus. Avant les années 1960, la seule fixatif chimique qui a donné des résultats acceptables pour EM était osmium tétroxyde. Cependant, tétroxyde d'osmium est hautement toxique et coûteux, ce qui empêche son utilisation dans le système vasculaire pour réparer des organes tels que le cerveau. Acroléine a été introduit dans les années 1950 comme une méthode fiable pour la conservation des tissus animaux appropriés pour l' observation EM des structures cellulaires 17. Il pénètre dans le tissu plus profondément et réagit plus rapidement que d' autres aldéhydes lorsqu'ils sont utilisés pour la fixation par immersion et permet une bonne conservation des composants cytoplasmiques, avec un retrait minimal du tissu 17. Une telle caractéristique permet la fixation de l' acroléine un net avantage sur d' autres aldéhydes lorsqu'il est utilisé dans les tissus frais, en permettant une localisation plus précise de la vie des composés moléculaires, tels que des enzymes et d' autres protéines 18. En effet, il a été validé au fil des ans comme un moyen facile, efficace et méthode peu coûteuse de fixation pour la visualisation au niveau EM dans de nombreuses espèces, y compris les amphibiens et les rongeurs, comme efficacement Stabiliconserve une antigénicité et fournit ultrastructure relativement intact lorsqu'il est utilisé en combinaison avec un autre aldéhyde fixatif 16, 18, 19, 20, des peptides et des protéines de zes, 21. Protocoles pour la fixation d'acroléine chez les rongeurs ont depuis été normalisés et largement utilisé, en particulier par le groupe Pickel, à mettre en œuvre pour double immunomarquage EM 16, 22. Quelques groupes ont utilisé la fixation de l' acroléine dans le tissu cérébral des primates non humains 23. Cependant, à notre connaissance, il n'y a qu'un seul protocole publié décrivant efficacement la fixation chimique avec de l' acroléine chez les primates non humains qui est compatible avec EM immunomarquage 24.

Dans cet article, nous proposons une méthode simple et fiable pour résoudre efficacement chimiquement non-humun cerveau de primate avec acroléine, ce qui permet une conservation potentiellement à long terme ainsi que immunomarquage pré-enrobage et de transmission EM examen.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Déclaration éthique: Tous les protocoles impliquant des animaux ont été approuvés par le Comité de Protection des Animaux de l'Université Laval et ont été faites conformément au Conseil canadien sur le Guide des animaux de soins sur le soin et l'utilisation des animaux (Ed 2.). Le protocole décrit ici a été optimisé pour les animaux adultes d'environ 800 g. Les volumes de fixatif doivent être ajustées en fonction de la taille de l'animal.

1. Préparation des solutions pour transcardiaque Perfusion

  1. Préparer 1 L d'une solution saline tamponnée au phosphate de sodium 50 mM (PBS), selon les étapes suivantes. Préparer la solution au plus 24 h avant la perfusion et de maintenir à 4 ° C jusqu'à utilisation.
    1. Mesurer 800 ml d'eau distillée dans un bêcher de 1 litre. Ajouter 5,87 g de phosphate de sodium dibasique anhydre (Na 2 HPO 4), 1,20 g de phosphate de sodium monobasique monohydraté (NaH 2 PO 4 · H 2 O), et 9 gde chlorure de sodium (NaCl). Remuez pour dissoudre.
    2. Ajuster le pH à 7,4 par addition progressive de NaOH 5 N. Ajouter de l'eau distillée pour atteindre un volume total de 1 L.
      ATTENTION: NaOH est un composé chimique corrosif. Porter le vêtement de protection approprié (EPI;. Blouse de laboratoire, des gants, des lunettes de protection, etc.).
  2. Préparer 2 L de 4% de paraformaldehyde (PFA) selon les étapes suivantes. Cette solution doit être préparée au plus 24 h avant la chirurgie et maintenue à 4 ° C jusqu'à utilisation.
    1. Mesurer 1,5 L d'eau distillée dans un bêcher de 2 litres. Ajouter 23,48 g de phosphate de sodium dibasique anhydre (Na 2 HPO 4) et 4,80 g de phosphate de sodium monobasique monohydraté (NaH 2 PO 4 · H 2 O). Remuez pour dissoudre. Ajouter de l'eau distillée pour atteindre un volume total de 2 L.
    2. Chauffer la solution sous une hotte d'évacuation jusqu'à ce que la température atteigne environ 45 - 55 ° C. Ne pas chauffer à plus de 60 ° C.
    3. Ajouter graduellement 80 g de PFA à la solution et on agite jusqu'à dissolution complète (environ 30 - 60 min). Continuer à surveiller la température pour le maintenir en dessous de 60 ° C.
      ATTENTION: PFA est très volatil sous sa forme de poudre. Il est très toxique en cas de contact avec les yeux ou la peau et est dangereux en cas d'inhalation ou ingestion. Porter l'EPI et utiliser avec précaution sous une hotte de ventilation.
    4. On refroidit la solution à 4 ° C et on filtre. Conserver à 4 ° C.
  3. Préparer 1 L de 3% d'acroléine dans 0,1 M de tampon phosphate (PB) selon les étapes suivantes. La solution PB doit être préparé au plus 24 h avant la perfusion.
    ATTENTION: Acroléine est en cas d'inhalation et hautement toxique peut produire des dommages immédiats. Il est également corrosif et très toxique en cas d'absorption par la peau. Il est cancérogène et mutagène. Porter l'EPI et utiliser sous une hotte de ventilation appropriée.
    1. Mesurer 800 ml d'eau distillée. Ajouter 8,66 g de phosphate de sodium dibasique anhydre (Na 2 HPO 4) et 5,38 g de phosphate de sodium monobasique monohydraté (NaH 2 PO 4 · H 2 O). Remuer jusqu'à ce que tous les sels se dissolvent. Ajouter de l'eau distillée pour atteindre un volume total de 1 L. Conserver la solution à 4 ° C.
    2. Avant la chirurgie, transférer 900 ml de la solution PB dans un récipient en verre de 1 L et ajouter 30,94 ml de 97% de solution d'acroléine sous une hotte de ventilation. Ajouter une solution PB pour atteindre un volume total de 1 litre et mélanger. Filtrer la solution et le maintenir à 4 ° C.

2. transcardiaque et Perfusion cerveau Dissection

  1. Conserver les solutions sur la glace pendant toute intervention chirurgicale. Préparer la pompe en plaçant le tube dans la première solution à utiliser (PBS; 50 mM) et en tournant la pompe jusqu'à ce que l'air ne reste dans le tuyau. Pour la perfusion transcardiaque d'un singe macaque, utiliser une aiguille 21 G et régler le débit à environ 80 mL / min.
  2. Anesthésier l'animal avec une injection intramusculaire d'un mélangeture de la kétamine (20 mg / kg), xylazine (4 mg / kg) et d'acépromazine (0,5 mg / kg). Maintenir l'animal sous l'isoflurane (3%) sédation.
  3. Attachez les membres de l'animal à une table de ventilation.
  4. Avec un scalpel, enlever la peau jusqu'aux aisselles. Couper les muscles abdominaux. Utilisez des ciseaux chirurgicaux lourds pour couper les côtes latéralement en évitant soigneusement les organes vitaux.
  5. Couper le diaphragme avec des ciseaux chirurgicaux et soulever la cage thoracique pour exposer le coeur. Une fois que le diaphragme est coupé, passez rapidement, puisque le cœur cesse de battre en quelques minutes.
  6. Retirer le péricarde avec une lame de scalpel et insérer l'aiguille dans le ventricule gauche. Avec un scalpel, faites soigneusement une petite excision à l'oreillette droite. démarrer rapidement la pompe à 72 mL / min et maintenir l'aiguille en place. Si possible, inclinez l'animal afin d'avoir sa tête sur un niveau inférieur au cœur.
    REMARQUE: Veillez à ne pas percer le septum interventriculaire lors de l'insertion de l'aiguille.
    1. Rinse le sang avec environ 300 ml de PBS jusqu'à ce que les poumons sont blancs et pas de sang sort de l'oreillette droite.
  7. Arrêter la pompe, transférer rapidement le tuyau / tube à la solution d'acroléine 3%, et recommencer la pompe. Augmentez progressivement la vitesse de pompage à 80 mL / min, une fois que le cœur a cessé de battre. Perfuser environ 500 ml de la solution d'acroléine.
  8. Arrêter la pompe, transférer rapidement le tuyau à la solution PFA 4%, et recommencer la pompe. Cette étape nécessite environ 1 L de PFA.
    NOTE: La fixation est terminée lorsque les pattes avant sont rigides et le cou est raide.
  9. Couper la tête et disséquer soigneusement le cerveau du crâne. Prenez soin de ne pas endommager le cerveau avec les instruments chirurgicaux. La perfusion est optimale lorsque le cerveau est pâle (aucune trace de sang) et rigide (figure 1A).
  10. Immerger le cerveau intact dans 4% de PFA pendant 1 h à 4 ° C.
  11. couper le cerveau en série avec un refroidissement vibratome (4 ° C)dans le plan désiré en 50 um d' épaisseur et sections les recueillir dans du PBS (0,1 M) (figure 1B).
    REMARQUE: Cette étape peut être effectuée de plusieurs façons selon le protocole souhaité. Hémisphères peuvent être séparés avant la coupe vibratome, ou ensemble conservé. Si le cerveau est trop grand pour la plate-forme vibratome, il peut être coupé en blocs plus petits. Après cette étape, les articles peuvent être stockés pendant une longue période de temps à -30 ° C dans une solution antigel faite de 40% PB (50 mM), 30% de glycerol et 30% d'éthylène glycol.

3. Immunohistochimie pré-enrobage (Figure 1C)

  1. Préparer un 4 L de solution mère saline tamponnée au Tris (TBS, 50 mM, pH 7,6) comme suit.
    1. Mesurer 2L d'eau distillée dans un bêcher de 4 L, ajouter 24,23 g de trihydroxyméthyl aminométhane (THAM, C 4 H 11 NO 3), et agiter pour dissoudre.
    2. Ajuster le pH à 7,6 avec environ 148 ml de 1 N HCl. L'acide doit être ajouté avec Cautià éviter d'atteindre un pH inférieur à 7,6. Le volume total devrait être 4 L.
      ATTENTION: HCl est très corrosif. Porter l'EPI approprié.
  2. Sélectionner sections (de l'étape 2.11) contenant la région d'intérêt devant être traitées pour immunohistochimie EM.
  3. Laver les sections flottantes 3x dans du PBS (0,1 M, pH 7,4) pendant 5 min à température ambiante pour rincer la solution antigel.
  4. Préparer une solution à 0,5% de NaBH 4 dilué dans du PBS.
    1. Peser 0,05 g de NaBH 4 et de le diluer dans 10 ml de PBS. Ne pas couvrir. Préparer cette solution juste avant l'utilisation.
  5. Incuber les sections dans la solution de NaBH 4 fraîchement préparée pendant 30 minutes à température ambiante. Bercer doucement. Ne pas couvrir.
  6. Laver 3x dans du PBS pendant 10 min à température ambiante, à bascule vigoureusement jusqu'à ce qu'aucun des gaz de réaction reste.
  7. Préparer une solution de blocage pour EM avec 2% de sérum normal approprié et 0,5% de gélatine de poisson froid dilué dans du PBS.
    NOTE: La quantité ShoulD est calculée afin d'avoir assez pour les trois étapes suivantes. Utilisation d'un sérum à base de la même espèce animale hébergeant l'anticorps secondaire. Évitez l'utilisation de méthodes de recherche d'antigènes ou addition de petites quantités de triton (pour augmenter la pénétration des anticorps), car ces méthodes compromettent considérablement la qualité du tissu.
  8. Incuber les sections dans la solution de blocage pendant 1 h à température ambiante. Bercer doucement.
  9. Préparer une solution d'anticorps primaire dilué dans la solution de blocage.
    NOTE: La concentration de l'anticorps primaire est généralement le même que pour l'immunohistochimie LM, mais envisager de procéder à des essais avec des concentrations d'anticorps différents au préalable, car certains anticorps primaires peuvent ne pas fonctionner avec de l'acroléine. Dans ce cas, il est possible d'utiliser un mélange de glutaraldéhyde (0,1 - 2%) et 4% PFA pour perfusion transcardiaque et d'obtenir des résultats similaires. Optimiser le temps d'incubation et de la température ainsi.
  10. Incuber les sections dans une solution d'anticorps primairependant une nuit à température ambiante avec agitation légère. Utilisez un temps d'incubation précédemment testée et la température.
  11. Laver les sections 3x dans du PBS pendant 5 min à température ambiante avec agitation légère.
  12. Préparer un mélange 1: 1000 solution d'anticorps secondaire biotinylé dilué dans la solution de blocage.
    NOTE: L'anticorps secondaire doit être soulevée contre les espèces hôtes utilisées pour produire l'anticorps primaire.
  13. Incuber les sections dans une solution d'anticorps secondaire pendant 1,5 h à température ambiante. Bercer doucement.
  14. Préparer une solution de peroxydase avidine-biotine (ABC) au moins 60 min avant la fin de l'incubation de l'anticorps secondaire.
    1. Utiliser une pipette calibrée pour mesurer 8,80 ul / ml de solutions A et B et les diluer dans du PBS.
    2. Basculer légèrement pendant au moins 60 min à température ambiante pour permettre la liaison complète entre les molécules d'avidine et de la biotine.
  15. Après l'incubation dans une solution d'anticorps secondaire, laver 3x dans du PBS pendant 10 min à température ambiante.
  16. Incuber les sections de l'ABC afinlution pendant 1 h à température ambiante. Bercer doucement.
  17. Laver une fois dans du PBS et deux fois dans du TBS pendant 10 minutes à température ambiante avec agitation légère.
  18. Préparer une solution fraîche de 0,05% de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) avec 0,005% de H 2 O 2 dilué dans du TBS.
    1. Peser 12,5 mg de DAB et le diluer dans 25 ml de TBS froid. Protéger de la lumière.
      ATTENTION: La poudre DAB est très volatile et nocif en cas d'inhalation. Il est cancérigène et tératogène. Ainsi, les femmes enceintes ou qui allaitent ne doivent pas manipuler ce produit, même lorsqu'il est dilué. Utilisez un masque N95 lors de la manipulation et de porter des EPI.
    2. Filtrer la solution et ajouter 4,5 ul de 30% de H 2 O 2 juste avant utilisation.
  19. Incuber sections dans la solution DAB pendant 3 à 7 min à température ambiante. Bercer doucement.
    NOTE: Le précipité brun ne doit pas être trop sombre afin d'éviter un niveau élevé de coloration de fond. Le temps d'incubation doit être optimisée en conséquence.
  20. Arrêter la réaction en rapidement deux lavagesdans du TBS froid, puis deux fois pendant 10 min dans du TBS froid à la température ambiante, suivie par deux fois pendant 10 minutes dans PB, avec basculement doux.
    NOTE: L'utilisation de PB (et non PBS) est essentielle en vue d'éliminer toute trace de NaCl, car il réagirait avec des cristaux d'osmium et de forme.

4. Osmification et Embedding pour Electron Observation Microscopique

  1. Préparer une solution de 1% de tétroxyde d' osmium (OsO 4) dilué dans du PB. Protéger de la lumière.
    ATTENTION: osmium est hautement toxique et ne doit pas entrer en contact avec la peau, les yeux ou la bouche et ne doit pas être inhalée. Il peut entraîner la mort en cas d'ingestion. Il ne doit être utilisé sous une hotte de ventilation et de protection individuelle approprié.
  2. Incuber les sections en solution OsO 4 pendant 30 min à température ambiante sous la hotte d' évacuation (sans agitation) et les recouvrir d' une feuille d'aluminium pour les protéger de la lumière. Complètement aplatir les sections avant d'ajouter la solution OsO 4.
    NOTE: Les sections deviennent très sombres et rigid et doit être manipulé avec précaution suite à cette étape.
  3. Préparer une résine époxy résistant à l'eau lors de la osmification.
    1. Ajouter des quantités appropriées de chaque composant de la composition de résine époxy (20 g de résine époxy, 20 g de durcisseur, 0,6 g d'accélérateur et 0,4 g de plastifiant) dans une grande tasse en plastique. Agiter avec une baguette en bois ou pipette en plastique jusqu'à l'obtention d'une couleur marron homogène.
      NOTE: Il est essentiel d'utiliser la proportion exacte de chaque composant.
    2. Transfert des quantités égales tasses en aluminium de dimensions appropriées, en fonction du nombre de sections à traiter. Laisser reposer.
  4. Laver les sections osmificated 3x dans PB pendant 10 min à température ambiante avec basculement faible vitesse.
  5. Déshydrater les sections de la série suivante de l'éthanol gradué pendant 2 minutes chacune: 2 fois dans 35% d'éthanol; 1 heure chacun à 50, 70, 80, 90, et 95% d'éthanol; et 3 fois dans 100% d'éthanol.
  6. Transférer les sections dans des flacons de verre pour compléter les dehydratile processus en incubant les sections 3 fois pendant 2 minutes dans de l'oxyde de propylène.
    ATTENTION: L'oxyde de propylene est un solvant organique très volatil et toxique. Il peut causer des dommages graves aux yeux ou la peau en cas de contact ou par inhalation ou ingestion. Il a été classé comme substance cancérigène grade 2. Il ne doit être utilisé sous une hotte de ventilation et EPI. Il est également très inflammable et doit être tenu à l'écart de toute source de chaleur.
    REMARQUE: Avant cette étape, les articles doivent être soigneusement transférés dans des flacons en verre, étant donné que l'oxyde de propylène est un solvant organique et est incompatible avec le plastique. À ce stade, les sections sont très fragiles et doivent être manipulés avec soin. Les sections peuvent être alternativement transférés dans des flacons de verre avant l'étape 4.5.
  7. sections de transfert avec soin, un par un, dans les tasses en aluminium et éviter tout contact avec de l'air autant que possible. -Plat intégré les sections en résine époxy hydrofuge préalablement mélangés et les incuber pendant une nuit sous la Venting hotte à température ambiante.
    NOTE: A ce stade, les sections sont complètement déshydratés et très fragile et doit être manipulé avec précaution.
  8. Utilisation de l'huile minérale, de préparer des lames de verre revêtues de graisse, avec des lamelles en plastique graissés.
  9. Ramollir la résine par incubation des tasses en aluminium à 60 ° C pendant 12 à 15 min au maximum. aplatir soigneusement les sections sur le côté graissé de la lame de verre. Placez la lamelle graissé et soigneusement pousser tout l'air.
  10. Incuber les lames à 60 ° C pendant 48 h.
    NOTE: Il est essentiel de ne pas dépasser 48 h temps d'incubation, comme la résine deviendra trop dur.
  11. Enlever les lamelles en plastique.

5. Préparation d'échantillons pour ultraminces et Observation Sectionnement L'utilisation d'un microscope électronique à transmission

  1. Utilisez des jumelles pour trouver la région d'intérêt et couper un petit morceau quadrangulaire d'environ 1 mm 2 avec un scalpel.
  2. Déposer la pointe d'un bloc de résine et de colle de la quadrangular pièce sur celui - ci (Figure 1C). Laisser sécher la colle pendant au moins 1 h ou pendant une nuit avant la coupe.
  3. Utilisation d' un ultramicrotome, couper la pièce quadrangulaire en 80 sections um d'épaisseur (Figure 1D).
    1. Placer le bloc de résine dans un pont ultramicrotome en position verticale et, en utilisant une lame de rasoir, couper progressivement de chaque côté du bloc de résine pour former un trapèze avec des côtés lisses.
    2. Mettre la plate-forme dans sa position horizontale et faire pivoter le bloc jusqu'à ce que le côté le plus long du trapèze est tourné vers le bas.
    3. Utilisez un outil de coupe en diamant ou un couteau de verre pour couper la surface de la pièce quadrangulaire. Réglez le ultramicrotome pour couper à 300 um d'épaisseur à sections de 1 mm / s. Ajuster le couteau verticalement pour être parallèle à la pièce quadrangulaire et pour afficher un angle horizontal très faible d'environ 1 °.
      NOTE: Cet angle permet à l'utilisateur d'approcher le tissu presque parallèle à la surface du bverrouiller, où les éléments immunomarquées sont plus susceptibles de se trouver. Lors de l'utilisation de ces paramètres avec l'outil de coupe de diamant, la résine affiche une couleur blanche brillante. Lorsque le tissu est coupé, il se transforme en une couleur pourpre ou verdâtre.
    4. Utiliser un couteau en diamant ultra 45 ° équipé d'un bateau rempli d'eau distillée pour réduire de 80 um sections épaisses, lisser les sections en passant sur eux avec un morceau de papier absorbant pointe dans le xylène, et de recueillir des coupes en série sur des grilles de fente nickel revêtu formvar-ou nues 150 mailles des grilles de cuivre (Figure 1E).
  4. Placez les grilles dans une zone de stockage de grille.
  5. Colorer les grilles avec du citrate de plomb.
    1. Utiliser une seringue de 5 ml et d'un filtre à seringue de 0,2 um pour préparer une solution 1: 1 de solution de réserve de citrate de plomb filtrée et l'eau distillée filtrée. Protéger de la lumière.
      REMARQUE: La solution mère de citrate de plomb doit être frais tous les mois pour éviter la formation de solides DEPOSses. Voir la fiche produit pour la recette de stock. De plus, si de nombreuses séries de grilles doivent être colorées, changer la solution diluée quand elle devient laiteuse.
    2. Placer chaque grille sur une goutte de la solution diluée, avec la section en contact avec la solution. Incuber pendant 3 min.
    3. Utilisez de petites pinces pour tenir la grille, et bien rincer dans deux béchers contenant de l'eau distillée.
    4. Éliminer l'eau en excès à l'aide de papier absorbant doucement. Conserver les grilles dans une boîte de grille. Attendre 30 min avant d' examiner les articles par microscopie électronique à transmission (TEM; Figure 1F).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cette section, nous présentons les résultats représentatifs qui ont été obtenus suite à l'observation, au niveau de l'EM de transmission, des tissus du cerveau de primate immunocolorées chimiquement fixé avec un mélange de 3% d'acroléine et 4% de PFA. Nous avons obtenu une bonne conservation de l'ultrastructure, comme indiqué par la gaine de myéline relativement intacte et la visualisation nette des doubles membranes (figure 2A). Contacts synaptiques, ainsi que des ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cet article, nous présentons un protocole fiable pour la perfusion transcardiaque des primates non humains et immunohistochimie pré-enrobage approprié pour l'examen de l'échantillon EM. Bien que typique cryo-EM, comme CEMOVIS, fournit une bonne conservation des ultrastructure du cerveau, elle limite également l'utilisation de 12 immunohistochimie. D' autres techniques, y compris cryo-substitution et technique Tokuyaso, permettent immunohistochimie post-intégration, mais ces t...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été soutenue par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG, 401848-2011 à MP). Le député a reçu une bourse de carrière du Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S). LE a été le récipiendaire d'une bourse de doctorat des FRQ-S (FRQ-S 14D 29441). Nous remercions Marie-Josée Wallman d'assistance technique.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Phosphate de sodium anhydre dibasique (Na2HPO4)Fisher scientificS374-500
Phosphate de sodium monohydraté monobasique (NaH2PO4· ; H2O)EM ScienceSX0710-1
Chlorure de sodium (NaCl)Fisher scientificS271-3
Hydroxyméthyl aminométhane (THAM)Fisher scientificT370-500
HCl  ;EMDHX0603-3Dilution 1 N. Le produit est corrosif. Utiliser avec une protection appropriée.
NaOHEMDSX0590-1Dilution 5 N. Le produit est corrosif. Utiliser avec une protection appropriée.
Paraformaldéhyde (PFA)SigmaP6148dilution à 4 %. Le produit est très volatil sous forme de poudre et très toxique. Utiliser avec prudence sous une cagoule de ventilation avec une protection appropriée.
Acroléine (90 %)Sigma110221dilution de 3 %. Le produit est hautement toxique. À utiliser sous une cagoule de ventilation avec une protection appropriée.
Table de ventilation d’autopsieMopecCE400
Pompe de perfusion électroniquecole parmermasterflex L/S 7523-90
Aiguille (perfusion)terumo  ;NN-1838R18 G 11/2
Aiguilletérumo  ;NN-2713R21 G 1/2
Kétamine20 mg/kg
Xylazine4 mg/kg
Acépromazine0,5 mg/kg
Scalpel
Lames de scalpelPlume  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; lance201011   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ; J9913N°22 pour la chirurgie et N°11 pour l’EM
Ciseaux chirurgicaux
Rongeurs
Vibratome LeicaVT 1200SCalibrer la lame avant chaque utilisation, lorsque l’appareil le permet
Vibratome Lame de rasoirGilletteGIN 642107
GlycérolFisher scientificG33-4Dilution à 30 %
Éthylène glycolFisher scientificE178-4Dilution à 30 %
Borohydrure de sodium (NaBH4)SigmaS-9125
Sérum de cheval normal (NHS)Jackson immunoResearch Laboratories008-000-121Dilution à 2 % Gélatine
de poisson froidAurion900.033Dilution à 0,5 %. Le produit original est concentré à 40 %
Anticorps primaire, SERTSanta Cruz biotechnologieSC-1458dilution 1/500
Anticorps primaire, ChATChemicon (Millipore)AB144Pdilution 1/25
Anticorps primaire, THImmunoStar22941dilution 1/1 000
Anticorps secondaire biotinylé, chèvreLaboratoires vectorielsBA-95001/1 000 dilution
Anticorps secondaire biotinylé, sourisLaboratoires VectorBA-2000Dilution 1/1 000
Vectastain elite ABC kit Vectorlaboratories PK61008.8 & micro ; L/mL de A et B chacun
3,3'-diaminobenzidine (DAB)SigmaD5637dilution à 0,05 %. Le produit est très volatil sous forme de poudre et toxique. Ne jetez pas de déchets dans l’évier.
Peroxyde (H2O2) 30 %Fisher scientificH-3230,005 % dilution
Tétroxyde d’osmium (OsO4)Microscopie électronique2 % 19152
4 % 19150
La solution originale peut être de 2 ou 4 %. Gardez attention à celui qui est utilisé pour calculer la dilution finale de 1 %. Le produit est très sensible à la lumière. L’osmium est très toxique. Utiliser uniquement sous une cagoule de ventilation avec une protection appropriée.
Résine époxy hydrofuge DurcupanSigmaA : M résine époxy (44611)
B : durcisseur 964 (44612)
C : accélérateur 960 (DY 060) (44613)
D : plastifiant (44614)  ;		Polymériser 48 h à 58 ° ; C avant de jeter les déchets.
Gobelets en aluminiumMicroscopie70048-01
ÉthanolAlcools commerciaux1019CDiluer dans de l’eau distillée avec une concentration appropriée
Oxyde de propylèneMicroscopie électronique20401Solvant organique. Très volatil et toxique. À utiliser sous une hotte de ventilation.
Medium non revêtu Lames de verrelaboratoires de recherche sur le cerveau3875-FRGraisse de surface à l’huile minérale
Film plastique (film d’enrobage Aclar)Microscopie électronique50425-25Graisse de surface à l’huile minérale
UltramicrotomeLeica UC7EM UC7
Outil de coupe au diamant (ultratrim)Diatomée  ;UT 1081Peut utiliser un couteau en verre alternativement
Ultra 45° ; Diatomée Couteau diamantDiatomée  ;MC13437équipé d’un bateau
XylenesFisher scientificX5SK-4
Grilles de cuivre à 150 maillesScience microscopique électroniqueG150-cu
Grid-boxScience microscopique électronique71138Peut stocker jusqu’à 100 grilles
Citrate de sodiumAnachemie81983
Nitrate de plombSigmaL-6258Faire une solution mère de citrate de plomb composée de 1,33   ; g de nitrate de plomb et 1,76 g de citrate de sodium dilué dans 42  ; mL d’eau distillée prébouillie et refroidie à laquelle 8 mL de 1  ; Les N NaOH sont ajoutés une fois la conversion du nitrate de plomb en citrate de plomb terminée. Le pH doit être d’environ 12. Conservez la solution dans une bouteille en plastique hermétique et à l’abri de la lumière.
Seringueterumo  ;SS-05LFiltre
seringueCorning4312220.2 µ ; m
Papier absorbant (papier bibuleux)Microscopie électronique70086-1
ParafilmFilm de laboratoirePM-999
Huile minéraleSigmaM5904
électronique à 5 mL

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005(2015).
  2. Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
  3. Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
  4. Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
  5. Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
  6. Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
  7. Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
  8. Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
  9. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
  10. Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
  11. Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
  12. Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
  13. Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
  14. Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
  15. Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
  16. Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
  17. Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
  18. Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
  19. King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
  20. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
  21. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
  22. Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
  23. Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
  24. Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
  25. Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
  26. Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
  27. Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
  28. McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
  29. Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
  30. Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
  31. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
  32. Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
  33. Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
  34. Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
  35. Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
  36. Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
  37. Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
  38. Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
  39. Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S. Jr, Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
  40. Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 1st ed, Academic Press. 83-90 (2014).
  41. Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
  42. van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
  43. Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
  44. Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
  45. Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008(2016).
  46. Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
  47. Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Fixation l acrol inesectionnement tissulaireincubation d anticorpsmarquage au DABt troxyde d osmiuminclusion en r sine poxyultramicrotomie

Articles connexes