L'évaluation simultanée de l'hémodynamique cérébrale et Light Scattering Propriétés du In Vivo Cerveau de rat en utilisant multispectral Imaging Diffuse Réflectance

Summary

L'évaluation simultanée de l'hémodynamique cérébrale et des propriétés de diffusion de la lumière du tissu cérébral de rat in vivo est démontrée à l'aide d'un système d'imagerie de réflectance diffus multispectral conventionnel.

Abstract

L’évaluation simultanée de l’hémodynamique cérébrale et des propriétés de diffusion de la lumière du tissu cérébral de rat in vivo est démontrée à l’aide d’un système d’imagerie multispectrale à réflectance diffuse conventionnel. Ce système est construit à partir d’une source de lumière blanche à large bande, d’une roue à filtres à filtres motorisés avec un ensemble de filtres d’interférence à bande étroite, d’un guide de lumière, d’une lentille collectrice, d’un zoom vidéo et d’une caméra CCD (dispositif à couplage chargé monochromatique). Une fenêtre crânienne ellipsoïdale est pratiquée dans l’os du crâne d’un rat sous anesthésie isoflurane pour capturer in vivo des images multispectrales à réflectance diffuse de la surface corticale. La régulation de la fraction d’oxygène inspiré à l’aide d’un dispositif de mélange gazeux permet l’induction de différents états respiratoires tels que la normoxie, l’hyperoxie et l’anoxie. Une analyse de régression multiple basée sur la simulation de Monte Carlo pour les images de réflectance diffuse multispectrale mesurées à neuf longueurs d’onde (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 et 760 nm) est ensuite effectuée pour visualiser les cartes bidimensionnelles de l’hémodynamique et les propriétés de diffusion de la lumière du cerveau du rat in vivo.

Introduction

Multispectrale imagerie par réflectance diffuse est la technique la plus usuelle pour obtenir une carte spatiale des signaux optiques intrinsèques (IOS) dans le tissu cortical. IOS observée dans le principalement cerveau in vivo sont attribués à trois phénomènes: variations dans l' absorption de lumière et des propriétés de diffusion en raison de l' hémodynamique corticales, la variation de l' absorption en fonction de la réduction ou l' oxydation des cytochromes dans les mitochondries et les variations dans les propriétés de diffusion de la lumière induite par des altérations morphologiques ^1.

La lumière dans le visible (VIS) à la plage spectrale de l'infrarouge proche (NIR) est efficacement absorbée et diffusée par les tissus biologiques. Le spectre de réflectance diffuse du cerveau in vivo est caractérisé par spectres d' absorption et de diffusion. Les coefficients de diffusion réduit u _'s du tissu cérébral dans la gamme de longueurs d'onde VIS-NIR à la suite d'une exposition de spectre de diffusion monotoneing amplitudes plus petites longueurs d'onde plus longues. Le coefficient de diffusion réduit μ spectre _S '(λ) peut être approchée à être sous la forme de la fonction de loi de puissance ^{2, 3} comme μ _S' (λ) = a × λ ^-b. La puissance de diffusion b est liée à la taille de diffuseurs biologiques dans un tissu vivant ^{2, 3.} Altérations morphologiques du tissu et de la réduction de la viabilité des tissus vivants cortical peuvent affecter la taille des diffuseurs biologiques ^{4, 5, 6, 7, 8, 9.}

Système optique pour l'imagerie multispectrale de réflectance diffuse peut être facilement construit à partir d'un li incandescentcombattre la source, des composants optiques simples, et un dispositif à couplage de charge monochromatique (CCD). Par conséquent, divers algorithmes et des systèmes optiques pour l' imagerie multispectrale de réflectance diffuse ont été utilisées pour évaluer l' hémodynamique corticales et / ou la morphologie des tissus ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18.}

La méthode décrite dans cet article permet de visualiser à la fois l'hémodynamique et les propriétés de diffusion de la lumière du tissu cérébral de rat in vivo en utilisant un système d'imagerie par réflectance diffuse multispectral classique. Les avantages de cette méthode par rapport aux techniques alternatives sont la capacité d'évaluer les changements spatio-temporels dans les deux hémodynamique cérébrales et tissus corticauxLa morphologie, ainsi que son applicabilité à différents modèles animaux de dysfonctionnement cérébral. Par conséquent, la méthode sera appropriée pour les enquêtes sur les lésions cérébrales traumatiques, les crises épileptiques, les accidents vasculaires cérébraux et l'ischémie.

Protocol

soins des animaux, la préparation et les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité de recherche animale de Tokyo Université de l'Agriculture et de la technologie. Par cette méthodologie, le rat est logé dans un environnement contrôlé (24 ° C, 12 h cycle lumière / obscurité), avec de la nourriture et de l' eau disponibles ad libitum.

1. Construction d'un système conventionnel multispectral Imaging Réflectance Diffuse

1. Mont neuf filtres d'interférence optique à bande étroite de longueurs d'onde de centre de 500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, et 760 nm pour les trous de filtration de la roue de filtre motorisée.
2. Construction d'un système d'imagerie multispectrale à l'aide d'une source de lumière blanche à large bande, une roue de filtre motorisée à l'ensemble ci-dessus pour les filtres d'interférence à bande étroite, un guide de lumière, une lentille collectrice, une lentille de zoom vidéo et une caméra monochrome CCD. La disposition des composants optiques, représentés sur la figure 2, peut être nommé pour eest la procédure de construction.
   NOTE: L'angle d'illumination est d'environ 45 ° par rapport à la surface de l'échantillon.
3. Allumer la source de lumière d'une lampe halogène pour éclairer la surface de l'échantillon par l'intermédiaire d'un filtre d'interférence, le guide de lumière et la lentille de collecte.
4. Ouvrez le logiciel d'exploitation de la caméra CCD.

2. Préparation des animaux

NOTE: Dans ce protocole, le rat n'a pas été utilisé pour les futures expériences et il a été sacrifié immédiatement après les mesures des images multispectrales.

1. Connecter le port d'entrée d'une chambre d'induction à l'orifice de sortie d'une machine d'anesthésie avec un tube. Connecter le port de sortie de la chambre d'aspiration à l'orifice d'entrée de l'appareil d'anesthésie avec un second tube.
2. Placez le rat dans la chambre d'induction et induire une anesthésie avec 5,0% d'isoflurane. Maintenir l'anesthésie à une profondeur telle que le rat ne répond pas aux pincements des orteils. Lower à 2,0% d'isoflurane à l'aide d'un bouton rotatif sur l'appareil d'anesthésie.
3. Fixer la tête de rat dans un cadre stéréotaxique. Fixer un porte-parole de l'anesthésie au cadre stéréotaxique.
4. Connecter le port d'entrée de l'embout buccal à l'orifice de sortie de l'appareil d'anesthésie avec un tube. Connecter le port de sortie de l'embout buccal à l'orifice d'entrée de l'appareil d'anesthésie avec un tube.
5. Raser la région de la tête au-delà du site d'incision prospective utilisant un coupe-cheveux jusqu'à ce que la surface de la peau apparaît.
6. Faire une incision longitudinale d' environ 20 mm de long le long de la ligne médiane de la tête à l' aide d' un scalpel chirurgical (figure 1 (a)) et d' exposer les tissus conjonctif sous - cutané (Figure 1 (b)).
7. Retirer les tissus conjonctif sous - cutané en utilisant une curette tranchante ou une pince et tirer sur les deux côtés de la tête pour exposer l'os du crâne (Figure 1 (c)).
8. Creuser un fossé ellipsoïdale sur l'os du crâne à l'intérieur du crâne Sutur(es de suture coronale, sagittale suture et la suture lambdoïde) à l' aide d' une perceuse à grande vitesse (figure 1 (d)).
9. Lentement et de manière homogène creusent l'os du crâne dans le fossé à l'aide de la perceuse à grande vitesse.
10. Appuyez légèrement sur la surface du crâne amincie avec la pointe de la pince pour estimer l'épaisseur osseuse et la force après un vaisseau sanguin cérébral apparaît. Si la région du crâne amincie facilement déprime, mettre fin à la réduction de l'os du crâne avec le foret à grande vitesse.
11. Couper la ligne frontière ellipsoïdale du crâne amincie en utilisant peu à peu la pointe de la pince ou de petits ciseaux chirurgicaux.
12. Retirez le crâne amincie de la surface du cerveau en utilisant lentement et doucement la pince.
13. Doucement baigner la fenêtre crânienne avec du sérum physiologique et le couvrir avec une plaque de verre transparent d'environ 0,1 mm d'épaisseur.

3. La régulation de la fraction d'oxygène inspiré

REMARQUE: Le Condi respiratoiretion peut être modifiée par réglage de la fraction d'oxygène inspiré (FiO _2).

1. En utilisant un tube, relier le premier orifice d'un raccord de tube en forme de Y (connecteur 1) au premier port d'un autre raccord de tube en forme de Y (connecteur 2).
2. Connecter le port d'entrée de l'embout buccal vers le second orifice de raccord de tube 1.
3. En utilisant un tube, connecter le troisième orifice de raccord de tube 1 à un dispositif de surveillance de concentration d'oxygène.
4. Avec un tube, relier le second orifice de raccord de tube 2 à l'orifice de sortie d'une machine d'anesthésie.
5. En utilisant un tube, relier le troisième port du connecteur de tube 2 à l'orifice de sortie d'un dispositif de mélange de gaz.
6. Se connecter un orifice d' entrée du dispositif de mélange de gaz à une haute pression de 95% O ₂ - bouteille de gaz de 5% de CO ₂ au moyen d' un tube.
7. Connecter l'autre orifice d' entrée du dispositif de mélange de gaz à une haute pression de 95% N ₂ - bouteille de gaz de 5% de CO ₂ au moyen d' un tube.
8. Modifiez les débits de gaz of O ₂ et N ₂ en utilisant les boutons rotatifs sur le dispositif de mélange de gaz.
9. Vérifier et régler la FiO ₂ en utilisant le dispositif de surveillance de concentration d'oxygène.

4. Acquisition des multispectral Images Réflectance Diffuse

1. Acquisition d'images de référence
   REMARQUE: Les composants optiques utilisés dans cette expérience, comme la source de lumière, fibre optique et des détecteurs ont leurs propres caractéristiques spectrales. Par conséquent, l'intensité de la lumière à travers ces composants passé doit être enregistrée comme une image de référence. L'image de référence est une image prise avec un diffuseur blanc standard éclairé avec la lumière provenant de la source lumineuse.
   1. Placez le diffuseur blanc standard sur la scène horizontalement.
   2. Focaliser la lentille de la caméra sur la surface du diffuseur blanc en faisant tourner la bague de zoom sur le canon.
   3. Réglez le temps d'intégration de la caméra en sélectionnant la valeur appropriée de laliste déroulante des temps d'intégration dans le logiciel d'exploitation de l'appareil afin que la plus grande quantité de lumière produit un signal qui est d'environ 75% des chefs d'accusation au maximum. Tout en regardant l'histogramme des valeurs de pixels, réglez le temps d'intégration jusqu'à ce que le niveau d'intensité du signal est d'environ 75% des chefs d'accusation au maximum.
   4. Sélectionnez la commande « Enregistrer » dans le menu fichier pour enregistrer une image dans un fichier.
   5. Modifier l'emplacement du filtre en tournant la roue de filtre.
   6. Enregistrer une image sur les autres longueurs d'onde selon le procédé décrit ci-dessus. Le nom du fichier doit identifier l'échantillon et la longueur d' onde utilisée (par exemple, W500, W520, W540 ... W760).
2. Acquisition d'échantillons d'images
   Remarque: Les images de l'intensité lumineuse diffuse réfléchie du cerveau exposé des rats à neuf longueurs d'onde sont capturées et enregistrées sur le disque dur d'un ordinateur personnel en utilisant les mêmes conditions d'acquisition.
   1. Placez délicatement le rà sur la scène et ajuster lentement le niveau de la scène pour que l'appareil puisse se concentrer sur la surface du cerveau de rat.
   2. Sélectionnez la commande « Enregistrer » dans le menu fichier pour enregistrer une image dans un fichier.
   3. Modifier l'emplacement du filtre en tournant la roue de filtre.
   4. Enregistrer une image sur les autres longueurs d'onde selon le procédé décrit ci-dessus. Le nom du fichier doit identifier l'échantillon et la longueur d' onde (par exemple, R500, R520, R540 ... R760).
3. Acquisition d'images sombres
   REMARQUE: La caméra CCD peut générer une intensité de la lumière en réponse à un signal électrique. Cependant, il y a une production mineure en raison du bruit dans les circuits électriques et détecteurs, même si la lumière ne pénètre pas au détecteur; ce qu'on appelle le bruit de courant d'obscurité. Pour mesurer avec précision l'intensité spectrale de la lumière, la composante de courant d'obscurité doit être enregistrée comme une image sombre et ensuite soustrait du signal de mesure. L'image sombre est une prise d'imagen avec le trajet de lumière bloquée.
   1. Éteignez la source de lumière de la lampe halogène.
   2. Bloquer le trajet de lumière vers le système de caméra CCD utilisant une plaque de blindage.
   3. Sélectionnez la commande « Enregistrer » dans le menu fichier pour enregistrer une image dans un fichier. Le nom du fichier doit identifier l'échantillon (par exemple, foncé).

5. Visualiser le contenu Hémoglobine et la diffusion de la lumière Paramètre

NOTE: Un ensemble d'images multispectrales de réflexion diffuse est enregistrée sur le disque dur d'un ordinateur personnel et analysé hors ligne. Une analyse de régression multiple aidé par une simulation Monte Carlo ¹⁹ des images de réflectance diffuse multispectrales à neuf longueurs d' onde (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 et 760 nm) est alors effectuée pour visualiser les deux dimensions cartes de concentration de l'hémoglobine oxygénée, une concentration de l'hémoglobine désoxygénée, la concentration d'hémoglobine totale, la saturation en oxygène cérébral régional et excrémentsTering puissance. L'algorithme détaillé a été publié dans la littérature ^{17, 18.}

1. Soustraire l'image sombre à la fois l'image de référence et l'image de l'échantillon à chaque longueur d'onde.
2. Normaliser l'image d'échantillon par l'image de référence à chaque longueur d' onde λ. Traiter l'image normalisée à l'image de facteur de réflexion diffuse R.
3. Calculer l'absorbance (ou densité optique) image A en prenant le logarithme de l'inverse de l'image de réflexion diffuse R à chaque longueur d' onde λ:
   (1)
4. Générer une matrice en trois dimensions en empilant les images d'absorbance dans l'ordre de leurs longueurs d' onde, où le plan x - y indique les informations de structure obtenue pour la surface du cerveau et l'axe z représente l'information spectrale.
5. PeRform une analyse de régression multiple pour le spectre d'absorbance A ( λ ) à chaque coordonnée xy.
6. Utiliser le spectre d'absorbance A ( λ ) comme variable dépendante et les spectres du coefficient d'extinction molaire de l'hémoglobine oxygénée ε _HbO ( λ ) et de l'hémoglobine désoxygénée ε _HbR ( λ ) comme variables indépendantes pour l'étape 5.5 (valeurs publiées pour ε _HbO ( λ ) Et ε _HbR ( λ ) sont fournis dans le tableau 1 ).
7. Vérifiez les cartes bidimensionnelles (images) des trois coefficients de régression multiples a _HbO , _HbR et ₀ .
8. Générer une matrice tridimensionnelle en empilant les images des coefficients de régression multiples dans l'ordre _HbO , _HbR et ₀ , où la y indique les informations de structure obtenue pour la surface du cerveau et l'axe des z représente les multiples coefficients de régression.
9. Calculer la concentration en hémoglobine oxygénée C _HbO, la concentration de l' hémoglobine désoxygénée C _HBr, et la puissance de diffusion de b à partir de l'ensemble de la régression multiple coefficients a _HbO, un _HBr, et un ₀ à chaque coordonnées XY à l' aide des formules empiriques suivantes (il valeurs de β _{HbO, i,} β _{HBr, i,} et β _{0, i} (i = 0,1,2,3) sont fournis dans le tableau 2):
   (2)
   (3)
   (4)
10. Vérifiez les cartes bidimensionnelles (images) de la concentration d'hémoglobine oxygénée C _HbO , la concentration d'hémoglobine désoxygénée C _HbR et la puissance de diffusion b .
11. Calculez une carte bidimensionnelle de la concentration totale d'hémoglobine C _HbT en _additionnant C _HbO et C _HbR à chaque _coordonnée x - y .
12. Calculer une carte bidimensionnelle de la saturation cérébrale régionale de l'oxygène rSO ₂ en divisant la concentration d'hémoglobine oxygéné C _HbO par la concentration totale d'hémoglobine C _HbT à chaque _coordonnée x - y .

Results

Images spectrales représentatives de la réflexion diffuse acquise in vivo de cerveaux de rats sont présentés dans la figure 3. Les images à 500, 520, 540, 560, 570 et 580 nm visualiser clairement un réseau dense de vaisseaux sanguins dans le cortex cérébral. La détérioration du contraste entre les vaisseaux sanguins et le tissu environnant observée dans les images à 600, 730 et 760 nm reflète la plus faible absorption de la lumière par l'hémoglobine au plus et d...

Discussion

L'étape la plus critique de ce protocole est l'élimination de la région du crâne amincie pour que la fenêtre crânienne; cela devrait être réalisé avec soin pour éviter des saignements inattendus. Cette étape est importante pour l'obtention de haute qualité diffuse des images multispectrales réflectance avec une grande précision. L'utilisation d'un stéréomicroscope est recommandé pour la procédure chirurgicale si possible. De petits morceaux d'éponge de gélatine sont utiles pour hémostatique.

...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Source lumineuse à lampe halogène 150 W	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japon	LA-150SAE
Guide de lumière	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japon	LGC1-5L1000
Lentille collectrice	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japon	SH-F16
Filtres d’interférence l@ 500 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japon	#65088
Filtres d’interférence l@ 520 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japon	#65093
Filtres d’interférence l@ 540 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japon	#65096
Filtres d’interférence l@ 560 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japon	#67766
Filtres d’interférence l@ 570 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japon	#67767
Filtres d’interférence l@ 580 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japon	#65646
Filtres d’interférence l@ 600 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japon	#65102
Filtres d’interférence l@ 730 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japon	#65115
Filtres d’interférence l@ 760 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japon	#67777
Roue à filtres motorisée  ;	Andover Corporation, NH, États-Unis Caméra	8 bits FW-MOT-12.5
	THE IMAGINGSOURCE, Allemagne	DMK21BU618. H
Objectif zoom vidéo	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japon	VZMTM300i
Spectralon standard blanc avec réflectance diffuse de 99 %	Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, États-Unis	SRS-99-020