L’utilisation d’un test de base de β-lactamase conductimétriques biocapteur pour détecter des Interactions biomoléculaires

Summary

Dans ce travail, nous présentons une nouvelle méthode pour étudier les interactions de protéine-protéine à l’aide d’un biocapteur conductimétrique basé sur la technologie de β-lactamase hybride. Cette méthode repose sur la libération de protons par hydrolyse des β-lactames.

Abstract

Biocapteurs deviennent de plus en plus important et mis en œuvre dans différents domaines tels que la détection des pathogènes, diagnostic moléculaire, la surveillance environnementale et contrôle de sécurité des aliments. Dans ce contexte, nous avons utilisé des β-lactamases comme enzymes journaliste efficace dans plusieurs études sur les interactions protéine-protéine. En outre, leur capacité à accepter des insertions de peptides ou de protéines/domaines structurés fortement encourage l’utilisation de ces enzymes pour produire des protéines chimériques. Dans une étude récente, nous avons inséré un fragment d’anticorps à domaine unique dans la β-lactamase de Bacillus licheniformis BlaP. Ces petits domaines, également appelés nanocorps, sont définis comme le domaine de liaison antigène anticorps seule chaîne camélidés. Comme les anticorps double chaîne commune, ils montrent des affinités élevées et les spécificités de leurs cibles. La protéine chimérique qui en résulte ont montré une grande affinité contre sa cible tout en conservant l’activité β-lactamase. Ceci suggère que les fractions nanobody et β-lactamases restent fonctionnelles. Dans le présent travail, nous présentons un protocole détaillé qui combine notre système de β-lactamase hybride à la technologie des biocapteurs. La fixation spécifique de la nanobody vers sa cible peut être détectée grâce à une mesure conductimétrique des protons libérés par l’activité catalytique de l’enzyme.

Introduction

Biocapteurs sont des dispositifs analytiques qui combinent une interaction biomoléculaire avec les dispositifs de signalisation physiques ou chimiques appelés transducteurs¹. Les signaux enregistrés soient interprétés et convertis pour surveiller les interactions entre les partenaires immobilisées et libres. La plupart des biocapteurs impliquent l’utilisation d’un anticorps pour détecter les analytes tels que les hormones ou autre agent pathogène marqueurs². Formats de capteur différent peuvent être utilisés et comprennent des biocapteurs basée sur la masse, magnétiques, optiques ou électrochimiques. Ces derniers sont pa....

Protocol

1. protein préparation des échantillons

1. Produire et purifier la protéine hybride BlaP-cAb-Lys3 comme indiqué dans notre précédente étude¹⁵. Stocker la protéine en 50 mM tampon phosphate pH 7.4 composée comme suit : 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ et 0,24 g de KH₂PO₄ dissous dans 800 mL d’eau distillée Difficulté le pH de la solution à 7,4 avant réglage du volume final de la solution à 1 L. filtre stériliser la solution protéique.
2. Préparer une solution-mère poule blanc d’oeuf lysozyme (lysozyme). Dissoudre 100 mg (40 000 unités/mg) de lysozyme acheté dans le commerce da....

Results

Conception et l’ingénierie des protéines chimériques BlaP-cAb-Lys3

La figure 1 représente l’insertion du cAb-Lys3 dans une boucle permissive de la β-lactamases de classe A BalP Bacilluslicheniformis. L’insertion a été effectuée entre les résidus Asp198 et Lys199. Un site de clivage de la thrombine a été introduit sur chaque côté du cAb-Lys3. Cellules transformés avec un expression constitutive de plasmide codant la protéin.......

Discussion

Dans ce travail, nous présentons une méthode pour fonctionnaliser un nanobody à l’aide de la β-lactamase BlaP comme protéine porteuse et nous montrons que nous pouvons implémenter avec succès la protéine hybride résultant dans un essai de capteur potentiométrique. La principale innovation de notre travail par rapport aux autres tests biocapteur est le couplage covalent de la partie de l’anticorps à l’activité enzymatique qui génère le signal électrique. Cette technologie d’insertion dite protéine présente des avantages e.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
réactifs
KH2PO4	Sigma-Aldricht	V000225  ;
K2HPO4	Sigma-Aldricht	1551128
NaCl	Sigma-Aldricht	S7653
Tris&ndash ; HCl	Roche	10812846001
EDTA  ;	Sigma-Aldricht	E9884
KCl	Sigma-Aldricht	P9541
Na2HPO4  ;	Sigma-Aldricht	NIST2186II
2-mercaptoéthanol	Sigma-Aldricht	M6250
alanine	Sigma-Aldricht	A7627
HClO4	Fluka	34288	1M HClO4 solution, distributeur : Sigma-Aldricht
hydrolysat de caséine	Sigma-Aldricht	22090
benzylpénicilline sodique	Sigma-Aldricht	B0900000
lysozyme de blanc d’œuf	de poule Roche	10837059001
heptane	Sigma-Aldricht	246654
méthanol	Sigma-Aldricht	322415
solution d’hydroxyde d’ammonium	Sigma-Aldricht	380539	28 % NH3  ; en H2O, purifié par double distillation (concentré ?)
Consommables de laboratoire
Plaque à 6 puits  ;	Greiner Bio-One	657165	CELLSTAR 6-Well Plate
Equipment
pH-mètre	WTW	1AA110	PH-mètre de laboratoire inoLab pH 7110
système de vide et de filtration	Nalgene	NALG300-4100	Porte-filtres avec récepteur, distributeur :
Puces			fabriquées par Yunus et collègues (ref 16)
PGSTAT30 Autolab	Metrohm Autolab		abandonné, successeur Autolab PGSTAT302N
multimètre numérique, METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		abandonné, successeur Metrahit Base