Article de méthode

En utilisant biocapteurs à base d'enzymes pour mesurer Tonic et Phasic Glutamate dans les modèles murins d'Alzheimer

DOI :

10.3791/55418

⸱

3 mai 2017

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1Department of Psychology, West Virginia University, 2Department of Drug Discovery & Development, Auburn University, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky Medical Center

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous décrivons la configuration, la navigation logicielle, et l' analyse de données pour une méthode spatiale et temporelle précise de la mesure tonique et les changements de glutamate extracellulaire phasiques in vivo en utilisant des réseaux de microélectrodes enzyme-linked (MEA).

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

perturbation neurotransmetteur est souvent un élément clé des maladies du système nerveux central (SNC), jouant un rôle dans la pathologie sous-jacente de la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la dépression et l'anxiété. Traditionnellement, microdialyse a été le plus commun (louangé) technique pour examiner les changements de neurotransmetteurs qui se produisent dans ces troubles. Mais parce que microdialyse a la capacité de mesurer les changements lents 1-20 minute dans de vastes zones de tissu, il présente l'inconvénient d'invasivité, risque de détruire les connexions intrinsèques dans le cerveau et une capacité d'échantillonnage lente. Une technique relativement récente, la matrice de microélectrodes (MEA), présente de nombreux avantages pour la mesure des changements de neurotransmetteurs spécifiques au sein des régions discrètes du cerveau comme ils se produisent, ce qui rend une approche spatiale et temporelle précise. En outre, en utilisant les AME est peu invasive, permettant la mesure des modifications de neurotransmetteurs in vivo. Dans notre laboratoire, nous have été particulièrement intéressés par des changements dans le neurotransmetteur, le glutamate, lié à la pathologie de la maladie d'Alzheimer. En tant que tel, la méthode décrite ici a été utilisé pour évaluer les perturbations potentielles hippocampiques en glutamate dans un modèle de souris transgénique de la maladie d'Alzheimer. En bref, le procédé utilisé consiste à enduire une microélectrode multi-site avec une enzyme très sélective pour le neurotransmetteur d'intérêt et l'utilisation de sites d'auto-référencement pour soustraire le bruit de fond et les interférents. Après étalement et d'étalonnage, on peut construire la MEA avec une micropipette et abaissé dans la région du cerveau d'intérêt à l'aide d'un appareil stéréotaxique. Ici, le procédé décrit consiste à anesthésier RTG (TauP301L) 4510 souris et en utilisant un appareil stéréotaxique afin de cibler avec précision les sous-régions (DG, CA1 et CA3) de l'hippocampe.

Introduction

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La mesure des modifications de neurotransmetteurs dans le cerveau est un outil essentiel pour l'étude des maladies neuroscientifiques du système nerveux central (SNC) qui sont souvent caractérisées par la dérégulation des neurotransmetteurs. Bien que microdialyse en combinaison avec une Chromatographie liquide haute pression (HPLC / CE) est la méthode la plus largement utilisée pour mesurer les changements dans les niveaux de neurotransmetteurs extracellulaires 1, 2, 3, 4, la résolution spatiale et temporelle des sondes de microdialyse peuvent ne pas être idéal pour les neurotransmetteurs , tel que le glutamate, qui sont étroitement régulée dans l'espace extracellulaire 5, 6. En raison des progrès récents de la génétique et de l' imagerie, il existe d' autres méthodes qui peuvent être utilisées pour cartographier le glutamate in vivo. Utilisation reporters fluorescents glutamate génétiquement codés (iGluSnFR) und ' imagerie à deux photons, les chercheurs sont capables de visualiser la libération de glutamate par les neurones et les astrocytes in vitro et in vivo 7, 8, 9. En particulier, cela permet d'enregistrer à partir d'un champ de vision plus large et ne perturbe pas les connexions intrinsèques du cerveau. Bien que ces nouvelles techniques optiques permettent la visualisation de la cinétique du glutamate et mesure des réponses sensorielles et de l'activité neuronale évoqués, ils ne sont pas capables de quantifier la quantité de glutamate dans l'espace extracellulaire dans les régions discrètes du cerveau.

Une autre méthode est la matrice de microélectrodes (MEA) lié à une enzyme qui permet de mesurer de manière sélective les niveaux de neurotransmetteurs extracellulaire, tels que le glutamate, par l'utilisation d'un système d'enregistrement auto-référencée. La technique de MEA a été utilisée pour étudier les modifications dans le glutamate extracellulaire après cérébrales traumatiquesblessure 10, 11, 12, vieillissement de 13, 14, le stress 15, 16, l' épilepsie 17, 18, la maladie d'Alzheimer 19, 20, et l' injection d'un synoptique viral 21 et représente une amélioration par rapport aux limites spatiales et temporelles inhérentes à la microdialyse. Alors que microdialyse limite la capacité à mesurer près de la synapse 22, 23, AME ont une haute résolution spatiale qui permet des mesures sélectives de glutamate extracellulaire empiétement synapses près de 24, 25. En second lieu, la faible résolution temporelle de microdialyse (1 - 20 min) limite la possibilité d'étudier ladynamique rapide de la libération et la clairance du glutamate qui se produisent dans la milliseconde à la deuxième plage 26. En raison des différences dans la libération ou la clairance du glutamate peuvent ne pas être évident dans les mesures de tonique, de repos taux de glutamate, il peut être essentiel que mesurer directement la libération et la clairance du glutamate. AME permettent de telles mesures en raison de leur haute résolution temporelle (2 Hz) et faibles limites de détection (<1 um). En troisième lieu, les AEM permettent l'examen des variations sous-régionales dans les neurotransmetteurs dans une région particulière du cerveau, telles que l'hippocampe de rat ou de la souris. Par exemple, en utilisant AME on peut cibler séparément le gyrus denté (DG), corne d' Ammon 3 (CA3) et corne d' Ammon 1 (CA1) de l'hippocampe, qui sont reliés par l' intermédiaire d' un circuit trisynaptic 27, pour examiner les différences sous - régionaux de glutamate extracellulaire. En raison de la taille des sondes de microdialyse (1 - longueur de 4 mm) et les dommages causés par l' implantation 28 </ sup>, 29, les différences sous - régionales sont difficiles à traiter. En outre, les systèmes optiques ne permettent la stimulation par des stimuli externes, comme une stimulation ou quartiles le scintillement de lumière, ce qui ne permet pas la stimulation sous - régionale 7. Un dernier avantage des AME par rapport aux autres méthodes est la possibilité d'étudier ces sous - régions in vivo sans perturber leurs relations extrinsèques et intrinsèques.

Ici, nous décrivons comment un système d'enregistrement (par exemple, FAST16mkIII) en combinaison avec les AEM, consistant en une microélectrode multisite à base de céramique, peut être revêtue de façon différentielle sur les sites d'enregistrement pour permettre à des agents interférant être détectés et supprimés à partir du signal d'analyte. Nous démontrons également ces tableaux peuvent être utilisés pour des études à base ampérométrie-de régulation du glutamate in vivo au sein de la DG, CA3 et sous - régions hippocampiques CA1 de ELO anesthésié (TauP301L) 4510 souris, un couramment utilisé mmodèle Ouse de la maladie d'Alzheimer. De plus, nous confirmons que la sensibilité du système de MEA à la dynamique rapide de la libération du glutamate et la clairance en traitant les souris avec riluzole, un médicament montré in vitro pour diminuer la libération du glutamate et d' augmenter l' absorption du glutamate 30, 31, 32, 33, et de démontrer ces changements respectifs in vivo dans le modèle de souris TauP301L.

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Protocole

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1. Le revêtement de la matrice de microélectrodes avec des enzymes ou couche matricielle

  1. Préparation de la solution de matrice protéique
    1. Peser 10 mg d'albumine de sérum bovin (BSA) et le transférer à la 1,5 mL tube de microcentrifugation.
    2. Ajouter 985 ul d'eau DI au microtube contenant de la BSA. Mélanger la solution par agitation manuelle (re-pipetage avec une pipette de 1000 ul ~ 3 fois, jusqu'à ce que la BSA est dissous).
      REMARQUE: Ne pas utiliser vortex pour mélanger la solution car cela peut introduire de l'air dans la solution. En outre, définir la pipette à un volume <1 000 pi (par exemple 700 ul) pour éviter l' introduction de bulles d'air. La solution peut être placée dans une microcentrifugeuse si nécessaire.
    3. Une fois la solution BSA est dissous, ajouter 5 pi de solution à 25% de glutaraldéhyde. Mélanger la solution en retournant le tube fermé 3 - 5 fois. La solution résultante est de 1% de BSA avec 0,125% de glutaraldéhyde.
    4. Mettez de côté la matrice protéique Solution pendant 5 min. La solution apparaît jaune clair.
  2. Préparation de la solution d'enzyme souhaitée (par exemple, glutamate oxydase)
    1. Préparer la solution d'oxydase de glutamate par addition d' eau filtrée désionisée à la lyophilisée, enzyme purifiée (par exemple, de l' eau DI 50 ul ajoutés à 25 unités d'oxydase de glutamate pour donner 0,5 U / ul).
      REMARQUE: Aliquoter solution mère (par exemple, 1 pi) et stocker les aliquotes dans des récipients de taille appropriée (par exemple, 500 ul des tubes de microcentrifugation) à -20 ° C. Aliquotes peuvent être conservés jusqu'à 6 mois dans ces conditions.
    2. Ajouter 4 ul de la solution de BSA / glutaraldéhyde à la microcentrifugeuse tubes aliquotes contenant l'oxydase de glutamate. Mélanger la solution par agitation manuelle (re-pipetage avec une pipette 10 ul. La pipette doit être réglé à un volume <5 pi). La solution résultante est de 1% de BSA, 0,125% de glutaraldéhyde et 0,1 U / uL glutamate oxydase.Utiliser la solution de revêtement immédiatement.
      Remarque: solution de revêtement oxydase Glutamate ne peut être utilisé dans les 15 minutes. Bien que plusieurs AME peuvent être enrobés d'une solution préparée, il est recommandé de ne pas dépasser la fenêtre de temps utilisable pour glutamate oxydase. Le nombre d'électrodes qui peuvent être revêtus dans les 15 min varient. En général, 4 à 6 électrodes peuvent être appliquées à la fois.
  3. Revêtement de la MEA
    1. En général, le revêtement d'une paire de sites d'enregistrement (s) sur un MEA avec l'enzyme désirée (glutamate oxydase) et une autre paire de sites d'enregistrement (s) (le site « sentinelle » (s)) est revêtu avec la protéine-matrice inactive.
    2. Utilisez-pointe émoussée microseringues Hamilton (par exemple 10 pi) de MEA manteau avec L-glutamate oxydase ou d'une solution de matrice de protéine inactive (BSA + glutaraldéhyde). Les procédures utilisées pour des revêtements à matrice de protéine enzymatique ou inactives sont les mêmes.
    3. Nettoyer les seringues avant et après utilisation (3 rinçages avecde l'eau DI, 3 rinçages avec du methanol, 5 rinçages avec de l'eau DI).
      REMARQUE: Les seringues dédiés sont utilisés pour appliquer des couches d'enzyme (oxydase de glutamate) ou de la protéine-matrice. Ne pas utiliser la même seringue pour une autre solution. Il est recommandé d'effectuer des revêtements à matrice de protéines avant revêtements d'enzymes.
    4. Etablir matrice oxydase ou une protéine glutamate en utilisant une seringue Hamilton de 10 ul. appuyer légèrement sur le piston pour distribuer une petite perle de solution à la pointe de la seringue (visualisée à l'aide d'un microscope de dissection).
    5. Utilisation du microscope à dissection pour cibler les sites d'enregistrement de la MEA, appliquer la solution sur les sites d'enregistrement appropriés en mettant en contact brièvement les sites d'enregistrement avec la gouttelette de solution / bille, ce qui représente une couche. Trois couches sont suffisantes à la fois pour la protéine de la matrice et la couche d'enzyme. Des couches épaisses peuvent réduire la sensibilité de l'AEM.
    6. Soulever vers le haut la gouttelette de solution et en dehors des sites d'enregistrements ( par exemple le Syringe pointe ne doit pas gratter à la surface de MEA).
    7. Réglez une minuterie pendant 1 min. Ceci est la durée minimale requise entre les applications de revêtement sur le site d'enregistrement (s). Permettre AME recouvert d'une enzyme pour durcir à 4 ° C pendant 5-7 jours.
    8. Notez le nombre de couches appliquées, combien de temps il a fallu appliquer les revêtements, le nombre d'électrodes, et un nom et la date dans un cahier de laboratoire.

2. galvanoplastie avec m-phénylènediamine pour Sélectivité améliorée

  1. Préparation de m-phénylènediamine (MPD) solution
    REMARQUE: La plaque de la couche d'exclusion, DPV, pour empêcher l'oxydation de la dopamine et d' autres grosses molécules interférents (par exemple, l' acide ascorbique), améliorant ainsi la sélectivité de la sonde pour le glutamate / H 2 O 2 par rapport à d' autres molécules potentiellement interférents.
    1. Mesurer 50 ml de 0,05 M de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans une fiole jaugée de 50 mL et transférer de 0,05M PBS à un plus grand (150 ml) fiole d'Erlenmeyer.
    2. Utilisation de la tubulure reliée à un réservoir d'azote (par exemple, en utilisant la tubulure raccordée d' un éjecteur de pression), fixer un embout de pipette (par exemple , de la pointe P200) à l'extrémité ouverte du tube. Placer le tube avec la pointe de pipette fixée dans une solution de PBS et de couvrir la solution de manière lâche avec du parafilm. Allumer l'azote et lentement une solution de bulle pendant 20 min.
    3. Peser 0,045 g de mPD.
      Attention: mPD est une substance potentiellement cancérigène. Pesée des mPD doit être réalisée à l'aide d'une échelle contenue dans une hotte. Porter des gants et un masque lors de l'utilisation mPD. Assurez-vous que le capot est fonctionnel et que la ceinture est tirée au niveau de travail approprié. surfaces immédiatement propres qui peuvent avoir été contaminés par DPV pour éviter une coloration permanente.
    4. Après bouillonnement, transférer tous mpd à la solution PBS dégazé. Couvrir l'ouverture du flacon avec du parafilm et doucement tourbillonner la solution pour dissoudre mPD en solution. Évitez aggressive mélange ou l'utilisation d'un vortex Cela pourrait introduire des gaz dans la solution.
    5. Transférer la solution dans un bécher de 50 ml. Une barre d'agitation n'est pas nécessaire.
  2. Electroplating l'électrode
    1. Obtenir une électrode de référence. Utiliser des électrodes de référence dédiées à mPD placage seulement. Utiliser une électrode de référence différente pour les procédures d'étalonnage.
    2. Positionner le bras en plastique du porte-électrode de référence sur le bêcher. Voir les bulles d'air dans l'électrode de référence en verre (peut ne pas être en mesure de voir). flick doucement l'extrémité distale de l'électrode de référence pour éliminer les bulles d'air à la pointe.
    3. Placer l'électrode de référence à travers l'ouverture dans le bras inférieur en plastique et dans le bécher contenant du PBS. Assurez-vous que l'électrode de référence ne touche pas le fond du gobelet.
    4. Connecter l'électrode de référence au headstage (par exemple 2 pA / mV) et connecter (par exemple connecteur DIP) du MEA soit plaque mPDd au headstage.
    5. Abaisser la MEA dans la solution de bécher de sorte que seule la pointe de la MEA est immergée dans une solution. Ne pas immerger les pointes de MEA dans le liquide au-delà de la « bulle » noir (le noir d'isolation située au-dessus de la pointe de MEA). Cela pourrait endommager l'AEM.
    6. Exécuter un étalonnage « test » pour vérifier la fonctionnalité des canaux d'électrode et la connexion au headstage.
      REMARQUE: Bien que les paramètres matériels devraient refléter l'équipement utilisé, les détails liés à l'analyte / type interférent et la concentration ne doit pas être entré pour l'étalonnage « test ». Le mode d'enregistrement doit être « Ampérométrie » et le « V appliqué » doit être -0,7 V. Vérifier l'enregistrement typique pour tous les canaux.
    7. Annuler en sélectionnant « Annuler » lorsque la connectivité de tous les sites d'enregistrement est vérifiée. Il ne faut pas enregistrer les données d'étalonnage.
    8. Sélectionnez l'icône « Galvanoplastie » sur le bureau. La galvanoplastie Pourol menu apparaît. Vérifiez les paramètres corrects sont entrés:
      amplitude PP: 0,25
      Décalage: -0,5
      Fréquence: 0,05
      Durée (min): 20
    9. Cliquez sur le bouton « pause » pour commencer le placage. Le champ de temps écoulé doit commencer le compte à rebours.
    10. À la fin (tout le temps écoulé), sélectionnez « autre MEA » dans le menu pour commencer à sauté mPD un placage MEA supplémentaire. Remplacer l'AEM plaqué avec un MEA à mPD plaqué et répéter la procédure de dépôt électrolytique en utilisant l'outil de galvanisation.
      NOTE: Il est recommandé d'utiliser la solution préparée mPD pas plus de 2 fois ou dans un laps de temps de 1 h. Préparer une solution fraîche pour préparer plus de 2 AME.
    11. Sélectionnez « logiciel de sortie » pour terminer la galvanoplastie. Rincer pointes d'électrodes MPD-plaqué avec de l'eau déminéralisée (pour éviter un résidu de sel) et le magasin (24 h) avant l'étalonnage.
    12. Retirer l'électrode de référence de la solution et rincer à l'eau déminéralisée avant de le placer dans les s appropriéstorage solution (par exemple 3 M NaCl). Vérifiez que la pointe de l'électrode de référence est immergée dans la solution. Lentement inférieur électrode de référence en verre dans la solution pour éviter d'endommager le verre.
    13. Jeter la solution mPD dans un conteneur de déchets dangereux marquée de manière appropriée.

3. Calibrer le MEA pour la détection et la sélectivité Glutamate (Figure 1) 21

  1. Préparation des solutions nécessaires pour l'étalonnage.
    REMARQUE: Se reporter au Tableau 1.
  2. Effectuer le calibrage sous agitation constante (batterie magnétique actionné l'agitateur) à 37 ° C. Mettez le coussin chauffant ou circulant bain d'eau et obtenir un petit barreau d'agitation. Incorporer lentement mais assez vite que lorsqu'une addition est faite (ci-dessous), le nouveau plateau est atteint rapidement.
  3. Connecter le headstage (2 pA / mV) au système de commande d'enregistrement et insérer l'embout de MEA dans 40 ml de PBS 0,05 M sous agitation (en utilisant un bêcher de 50 ml).
  4. Connectez le référence électrode. Flick la fin pour assurer qu'il n'y a pas de bulles d'air.
  5. Ouvrez le programme d'enregistrement et cliquez sur « étalonnage ». Assurez-vous que les paramètres sont corrects (vérifier que les sites sentinelles sont sélectionnés car cela peut changer avec des électrodes différentes), choisir le numéro de MEA et appuyez sur « Démarrer ».
  6. Attendre 5 - 10 min pour atteindre l'équilibre; commencer une fois la ligne de base est stabilisée (<0,004 nA / min changement).
  7. Sélectionnez « de base » et ajouter 500 ul de 20 mM d'acide ascorbique (interférents, finale [250 uM]) une fois que le courant a atteint un nouveau plateau stable et sélectionnez « Interférent » (AA est considéré comme interférent du cerveau à l'échelle), si tout. Laisser 0,5 à 1 min entre les additions. Si l'AEM est correctement galvanoplastie, presque aucun changement ne devrait être observée.
  8. Ajouter 40 ul de 20 mM L-glutamate (finale [20 uM]) et une fois que le courant a atteint un nouveau plateau stable, marque 1 er addition "Analyte". Répétez trois fois pour un total de 3 glutamatadditions e.
  9. Ajouter 40 ul DA. Ne pas sélectionner « Analyte »; sélectionnez « Substance d'essai » - DA peut être seulement une interférent dans les zones contenant DA.
  10. Ajouter 40 pi Peroxyde. Ne pas sélectionner « Analyte »; sélectionnez « Substance d'essai ».
  11. Cliquez sur le bouton « Stop » une fois que la calibration est terminée.
  12. Pour déterminer la fonctionnalité de l'AEM, cliquez sur l'onglet calcul et enregistrer les paramètres suivants dans un cahier de laboratoire.
    1. Pour la conception de MEA (3000 um 2) utilisé dans ces étalonnages, utilisez un MEA avec une pente de ≥ 0,004 nA / iM mais pentes inférieures peuvent être utilisées pour certaines expériences. S'il y a moins d'une différence de 10% de pente entre enzymes revêtement et les sites non couchés, utilisez ces AME pour la libération évoquée uniquement ou propre / rejeter l'AEM.
    2. Utiliser une limite de détection (LD) ≤ 1,5 uM. Si le LOD est supérieure à 1,5 uM, puis utiliser ces AME pour releas évoquése et l'absorption seulement. Ne pas utiliser ces électrodes pour enregistrer les niveaux toniques.
    3. Utiliser une sélectivité pour l'analyte désiré (c. -à- glutamate) sur la substance interférente de> 20 unités arbitraires. Si la sélectivité est inférieure à 20, puis nettoyer / éliminer l'AEM.
    4. Utiliser une linéarité (R 2) de la courbe d'étalonnage de ≥ 0,90. Si la linéarité est inférieure à 0,90, puis nettoyer ou jeter MEA.
  13. Enregistrez le fichier avec le # de la MEA, la date et les initiales de la personne calibreur.

4. Monter le Micropipette

REMARQUE: Micropipettes (verre capillaire) doit avoir une pointe avec un diamètre interne de 10 - 15 um.

  1. Placer la micropipette centralement entre tous les quatre sites d'enregistrement de platine et de 50 à 100 um monter au-dessus du MEA avec de la cire collante et la pâte à modeler.
  2. Pour charger la micropipette, en utilisant une seringue de 1 mL rempli de glutamate ou d'une solution de KCl, une seringue stérile de 0,22 um filter, et 97 mm de longueur, de calibre 28 remplissage de la pipette, le remblayage de la micropipette. Qui est, insérer l'aiguille dans la partie supérieure de la micropipette et remplir au bas de la micropipette (l'extrémité vers le MEA), faire en sorte qu'il n'y a pas de bulles.
  3. Fixer la micropipette au système d'éjection de la pression de 2 - 20 psi pendant environ 1 s.

5. Plaque de la miniature électrode de référence pour l' utilisation in vivo

  1. Préparer la solution de placage (50 g NaCl / 90 ml de HCl 1 M dans un bécher de 100 ml (bain de dépôt)) et couper l'électrode de bain (~ 10 cm de longueur de fil de platine (Pt) (~ 0,02" de diamètre)).
  2. Coupez un 10 - long morceau de fil d'argent revêtu de téflon 15 cm (0,008" nu) et en utilisant une lame de rasoir pour gratter ~ 1 cm de revêtement en téflon de chaque extrémité de fin du fil d'argent.
  3. Souder un goujon d'or sur une extrémité et placer une extrémité de fil d'argent exposé dans le bain de placage.
  4. L'utilisation d'un adaptateur à courant continu (utiliser uniquement un adaptateur en courant continu ayant une sortie de ~ 9 -. 15 VDC max),serrer le fil « rouge » (+) pour le fil d'argent préparée (électrode de référence) sur le côté de la broche d'or. Fixer le « blanc » - fil de cathode du bain Pt ().
  5. Branchez l'adaptateur DC. Recherchez le procédé de placage correct - les bulles doivent apparaître à l'électrode de bain; électrode de référence devient un argent / couleur grise.
    ATTENTION: Ne mettez pas les fils [Noir (-) vs Red (+)] - bain de dépôt sera ruinée si cela se produit et une solution de plaquage frais devra être fait. Une mauvaise solution devient jaune en couleur: NE PAS UTILISER!
    REMARQUE: La réaction de placage prend généralement 2-5 min: 0 Ag + Cl - → AgCl + e -
  6. Test de l'électrode de référence.
    1. Définir un multimètre pour 100 - 200 mV DC réglage.
    2. Placer un point de référence (autrement dit, une électrode précédemment testée connue pour être fonction) d'électrode de référence dans 3 M de NaCl et d'essai contre l'électrode de référence nouvellement plaqué.
      NOTE: Si nousing une nouvelle électrode de référence, le tremper dans du NaCl 3 M avant l'utilisation (12 h recommandé).
    3. Placez le « rouge » (+) plomb sur la broche d'or de l'électrode de référence à tester. Placez le « noir » (-) de l' électrode de référence sur. Une plage de lecture acceptable est de ± 10 mV. 0 mV est idéal pour les 2 électrodes de référence.

6. Chirurgie générale des animaux pour les enregistrements MEA

  1. Préparation pour la chirurgie
    1. Placez les outils de chirurgie dans un désinfectant la veille.
    2. Retirez les outils du désinfectant et rincez à fond et placer les outils sur un bloc de chirurgie stérile. Procurez-vous un coussin chauffant.
    3. Calibrer deux électrodes et fixer la micropipette comme décrit dans les procédures 3 et 4.
    4. Faire l'électrode de référence comme décrit à la section 5.
    5. Faire 200 uM de glutamate et 70 mM KCI. Se reporter au Tableau 1.
    6. Obtenir l'animal et enregistrer son poids sur les feuilles de chirurgie.
    7. Préparer l'anesthésie et mettez le coussin chauffant.
  2. Effectuer la chirurgie MEA
    1. Utilisation de l'isoflurane (débit de 4% d'oxygène), anesthésier les animaux dans une chambre d'induction jusqu'à ce que la fréquence respiratoire a considérablement diminué et que l'animal ne répond pas aux pieds ou pincement de la queue. fréquence respiratoire enregistrement et la température du corps toutes les 15 min.
    2. Placez l'animal dans le dispositif stéréotaxique à l'aide des barres d'oreilles pour stabiliser la tête. Assurez-vous que l'animal est sûr et la tête ne bouge pas. Abaisser le débit d'isoflurane à 1,5 - 3% en oxygène. Assurez-vous que le coussin chauffant est correctement positionné sous l'animal et réglé à 37 ° C pour fournir de la chaleur supplémentaire. Le défaut de fournir une chaleur supplémentaire peut entraîner une hypothermie profonde et la mort prématurée de l'animal.
    3. Appliquer une pommade ophtalmique à l'aide d'un applicateur de coton stérile et enregistrer la fréquence respiratoire ettempérature corporelle. L'utilisation d'une tondeuse à piles, raser le sommet de la tête. Utilisez les petits ciseaux chirurgicaux pour enlever la fourrure près des oreilles.
    4. À ce stade, mettre les gants de chirurgie stériles. Appliquer l'iode et l'alcool (trois fois) sur le cuir chevelu.
    5. L'utilisation d'un scalpel, faire une incision vers le bas au milieu du cuir chevelu et la propagation de la peau à l'aide des pinces de chien de taureau. Prenez un bout de coton stérile pour absorber toute trace de sang. Utilisation du peroxyde d'hydrogène pour faciliter l'apparition du bregma et lambda.
    6. Vérifier que la tête est correctement positionnée par la mesure de la D / V et les coordonnées M / L de bregma et lambda. Changements de coordonnées doivent être zéro si la tête est sur un plan plat. Ajuster les barres de la tête et l'oreille que nécessaire pour assurer un plan plat.
    7. Trouver bregma et zéro les coordonnées. En utilisant les coordonnées désirées, passez à gauche et à droite et faire une marque à l'aide d'un marqueur permanent. L'utilisation d'un cauterizer / marqueur, faire une grande place autour de la marque avec suffisamment d'espace pour atteindre larégion désirée.
    8. L'utilisation d'un outil rotatif stérile, percez autour de la marque carrée. Absorber de sang en utilisant un applicateur de coton stérile. désinfectez soigneusement le foret avant chaque utilisation.
    9. Fixer la MEA au headstage et remblayer la pipette avec la première solution souhaitée. Assurez-vous laisser un vide dans la pipette sans solution afin que la solution en cours d'expulsion peut être examinée. Fixez le tuyau à la micropipette de verre.
    10. Allumer le réservoir d'azote et l'éjecteur de pression (psi = 5, le temps = 0,6 s). Test (presse manuelle bouton rouge) pour assurer la pipette ne soit pas obstruée avant de commencer.
    11. Calibrer la micropipette. Commencez à 0 sur le réticule et placez un morceau de ruban bleu sur le headstage pour indiquer le point de départ. Allumez le lecteur numérique et le remettre à zéro. Aller en bas 1 mm (DV) et compter le nombre de tiques de la solution est déplacée sur le réticule. 10 tiques doivent être égaux à 1 mm (1 mm = 250 nL), de sorte que 1 tick = 25 nL.
    12. Placer l'électrode de référence dans unemplacement éloigné du MEA de telle sorte qu'elle est toujours en contact liquide avec le cerveau pour compléter le circuit.
    13. Trouvez bregma avec le MEA ci-joint et zéro le lecteur numérique. Déplacer le MEA aux coordonnées souhaités. Abaissez lentement la MEA jusqu'à ce que la pointe touche le cerveau. Zéro les coordonnées DV et l'AEM LENTEMENT baisser dans le cerveau.
    14. Sur le programme d'enregistrement, cliquez sur l'électrode calibrée souhaitée, puis cliquez sur « Exécuter expérience. » Le système commence alors à des niveaux d'enregistrement tonique pour l'analyte d'intérêt alors que l'animal est anesthésié.
    15. Zoom sur un axe qui aidera à observer la ligne de base et permettre à l'électrode de référence pour 20 - 45 min.
    16. Après la ligne de base est stable, régler l'éjecteur de pression à .6 s et 5 psi et appuyer sur le bouton rouge de l'éjecteur de pression pour éjecter. Enregistrer le temps et la pression ainsi que le volume / tiques déplacé sur la feuille d'injection (figure 2). Apportez toutes les notes nécessaires (c. -à-de plus grands pics, des effets de dilution, pipette bouché, la ligne de base de bruit / o-portée).
    17. Pour les injections de glutamate, attendre 3 - 5 min entre les injections. Pour les injections KCI attendre 1 - 2 min entre les injections. Injecter en utilisant la même pression et le temps d'au moins 3 fois. Changer le temps et répéter. Essayez de ne pas modifier la pression à moins que la micropipette est obstruée.
    18. Si la micropipette est obstruée, augmenter la pression jusqu'à 30 livres par pouce carré.
    19. Enregistrement des régions du cerveau souhaitées, en répétant sur les deux côtés du cerveau en utilisant des solutions différentes. Enregistrer une base de référence dans chaque nouvelle région pendant 20 min.
    20. Prenez le MEA avec micropipette attaché, rincer à l'eau DI et laisser tremper dans du PBS pendant la nuit jusqu'à ce que tout le sang a disparu.
    21. Euthanasier l'animal et de sauver le cerveau dans un tube pré-étiquetés et conserver au congélateur -80 ° C ou de garder un côté pour la fixation. Pour euthanasier l'animal, l'overdose avec isoflurane (inhalation). Effectuer décapitation à l'aide des ciseaux chirurgicaux et disséquer les régions souhaitées.

7. Nettoyage après utilisation Coated AME

  1. Ne nettoyez pas MEAS utilisé. S'il y a peluches ou la poussière sur la surface, propre avec du méthanol et laisser sécher pendant 24 heures avant le revêtement.
  2. Allumer le bain-marie (80 ° C) et faire tremper la pointe de la MEA pendant 30 min. essuyer avec précaution la pointe de l'électrode avec un applicateur à bout en coton pour enlever les débris qui peuvent être laissés sur la pointe d'électrode. Ne pas obtenir la « partie d'isolation » noire de la MEA humide.
  3. En utilisant trois différents sonicateurs, faire tremper la pointe de la MEA dans (1) Citrisolv, un solvant et un agent de compensation commercial (2) un groupe isopropyle, et (3) d'eau DI pendant 5 minutes. essuyer avec précaution la pointe de l'électrode avec applicateur à bout en coton pour enlever les débris qui peuvent être laissés sur la pointe d'électrode.
  4. Examiner les conseils au microscope de dissection pour assurer les couches ont été supprimés.

8. Analyse

  1. Pour analyser les données,d'abord exporter l'expérience souhaitée en double-cliquant sur l'expérience terminée et la sélection des « données à l'exportation » à partir du fichier menu déroulant.
  2. Sauvegardez ces données à l'emplacement du fichier désiré et ouvrir le programme d'analyse. Cliquez sur « ouvrir » dans le programme d'analyse et choisissez le fichier enregistré récemment.
  3. Donnez au programme quelques instants pour télécharger le fichier, puis vérifier l'expérience sous l'onglet marqueurs d'événement. Sous sortie, vérifier les cases correspondant aux paramètres souhaités. Par exemple, la ligne de base, l' amplitude, la surface de pic (surface sous la courbe), l' élévation T, et T 80.
  4. Cliquez sur Actualiser, puis analyser pour exporter les données vers une feuille de calcul (cela peut prendre quelques minutes). Le programme donnera une invite pour enregistrer le fichier vers l'emplacement souhaité. Une fois enregistré, le fichier peut être modifié dans une feuille de calcul.

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Résultats

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Bien que cette technologie peut être utilisée pour mesurer des modifications dans glutamatergique de signalisation dans de nombreux types de modèles animaux, tels que des lésions cérébrales traumatiques, le vieillissement, le stress et l'épilepsie, ici nous montrons comment la technologie MEA peut être utilisé pour examiner les modifications glutamatergiques dans le modèle de souris transgénique de tauopathie humain 19, 20. La RT...

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Discussion

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La technique de MEA permet de mesurer la cinétique rapide de la libération et l' absorption neurotransmetteur in vitro et in vivo. Par conséquent, la technologie produit une grande variété de la production de données, y compris les niveaux de neurotransmetteurs tonique, la libération des neurotransmetteurs évoqué, et la clairance des neurotransmetteurs. Cependant, parce que l'utilisation des AME est une procédure relativement complexe, il existe de nombreux facteurs qui peuvent avoir besoin d&#...

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Déclarations de divulgation

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GG est le propriétaire unique de Quanteon, LLC qui rend le système d'enregistrement FAST-16 utilisé pour les mesures de glutamate dans cette étude. JEQ est un consultant rémunéré pour Quanteon.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par l'Institut national des sciences médicales générales (MRN, U54GM104942), NIA (MRN, R15AG045812), l'Association Alzheimer (MRN, NIRG-12-242187), WVU Faculté Sénat Subvention de recherche (MRN), et WVU PSCOR Grant (MRN).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
FAST-16mkIII-8 canauxQuanteon16mkIII
Réseaux de microélectrodesCenMetW4 ou 8-TRK
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-AldrichA-305910 g (expire après 1 mois)
GlutaraldéhydeSigma-AldrichG-6257100 mL (expire après 6 mois)
Glutamate oxydaseUS Biological ou Sigma AldrichG4001-01 ou 10064650 UI (expire après 6 mois)
Seringues HamiltonHamilton#803832 seringues
MéthanolBDHUN12304 L
de dichlorhydrate de m-phénylènediamine (mPD)ACROS Organics133056025025 g
Électrodes de référence (RE-5B)BASMF-20793 électrodes
Alimenté par batterie Magnétique plaque à agitationCole-parmerEW-04804-01Peut acheter auprès d’un autre fournisseur
GlutamateSigma-AldrichG-1626100 g
Acide ascorbiqueTCI50-81-7500 g
Chlorhydrate de dopamineAlfa Aesar62-31-75 g
Acide perchloriqueVWRUN2920500 mL
Chlorure de postassiumVWR7447-40-71 kg
Chlorure de sodiumVWR7647-40-71 kg
Chlorure de calciumMP153502100 g
Hydroxyde de sodiumBDH1310732500 g
Pipettes à éjection sous pression en verreCenMet
Cire collanteKerrlab625Peut acheter auprès d’un autre fournisseur
MicroseringueWorld Precision InstrumentsMF28G-5
Pâte à modelerWalMartPeut acheter auprès de différents fournisseurs
Picospritzer IIIParker
Silver wireAM systems#786500
Acide chlorhydriqueBDH76470102.5 L
Platinum wireAM Systems778000
Pistolet à souderLowes ou Home DepotPeut acheter auprès d’un autre fournisseur
MultimètreWalMartPeut acheter auprès d’un fournisseur différent
PhysioSuiteKent ScientificPeut acheter auprès d’un fournisseur différent
SomnoSuiteKent ScientificPeut acheter auprès d’un fournisseur
différent DispositifstéréotaxiqueStoeltingPeut acheter auprès d’un autre fournisseur
Digital Lab StandardStoeltingPeut acheter auprès d’un autre fournisseur
Meiji EMZ microscopeMeijiEMZ-5
DrillDremelMicro
MetricideMetrex102800
ScalpelVWRPeut acheter auprès d’un autre fournisseur
Ciseaux de chirurgieVWRPeut acheter auprès d’un autre fournisseur
Cotons-tiges stérilesPuritan25806Peut acheter auprès d’un autre fournisseur
Pommade pour les yeuxPuralube Vet PommadeObtenir auprès du vétérinaire
Écouvillons d’iodeVWRS48050Peut acheter auprès de différents fournisseurs
Tampons d’alcool PharmacielocalePeut acheter auprès de différents fournisseurs
Champ de chirurgie stérileDynarex4410Peut acheter auprès de différents fournisseurs
Saline stérileTeknovaS5815Peut faire sa propre solution à l’aide
de filtres Peroxyde d’hydrogène (3 %)PharmaciePeut acheter auprès de différents fournisseurs
Coussin chauffantWalMartPeut acheter auprès de différents fournisseur
locale

Références

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