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Les espèces réactives d'oxygène (ROS) régulent les processus cellulaires essentiels, y compris l'expression des gènes, la migration, la différenciation et la prolifération. Cependant, les niveaux excessifs de ROS induisent un état de stress oxydatif, qui s'accompagne de dommages oxydatifs irréversibles à l'ADN, aux lipides et aux protéines. Ainsi, la quantification de ROS fournit une procuration directe pour l'état de santé cellulaire. Étant donné que les mitochondries sont parmi les principales sources et cibles cellulaires des ROS, l'analyse conjointe de la fonction mitochondriale et de la production de ROS dans les mêmes cellules est cruciale pour mieux comprendre l'interconnexion dans les pathologies physiopathologiques. Par conséquent, une stratégie basée sur la microscopie à haut contenu a été développée pour la quantification simultanée des niveaux de ROS intracellulaires, du potentiel de membrane mitochondrial (ΔΨ m ) et de la morphologie mitochondriale. Il est basé sur la microscopie de fluorescence automatisée à large champ et l'analyse d'image de cellules adhérentes vivantes, cultivées dans des plaques multi-puits, et StaineD avec les molécules rapporteurs fluorescentes perméables aux cellules CM-H 2 DCFDA (ROS) et TMRM (ΔΨ m et la morphologie mitochondriale). Contrairement à la fluorimétrie ou à la cytométrie en flux, cette stratégie permet de quantifier les paramètres subcellulaires au niveau de la cellule individuelle avec une résolution spatiotemporelle élevée, avant et après la stimulation expérimentale. Fait important, la nature basée sur l'image de la méthode permet d'extraire des paramètres morphologiques en plus des intensités de signal. Le jeu de caractéristiques combinées est utilisé pour l'analyse de données multivariées exploratoire et statistique pour détecter les différences entre les sous-populations, les types de cellules et / ou les traitements. Ici, une description détaillée de l'analyse est fournie, ainsi qu'un exemple d'expérience qui prouve son potentiel de discrimination sans équivoque entre les états cellulaires après une perturbation chimique.