Évaluation des cardiomyocytes types suivants Reprogrammation Transcription Factor médiée par des fibroblastes embryonnaires de souris

Antonio Fernandez-Perez; Nikhil V. Munshi

doi:10.3791/55456

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Article de méthode

Évaluation des cardiomyocytes types suivants Reprogrammation Transcription Factor médiée par des fibroblastes embryonnaires de souris

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DOI :

10.3791/55456

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22 mars 2017

Antonio Fernandez-Perez¹ , Nikhil V. Munshi¹

¹Department of Internal Medicine- Cardiology, UT Southwestern Medical Center

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole étape par étape pour la génération et la quantification de divers sous-types cardiaques reprogrammés à l’aide d’une administration médiée par un rétrovirus de Gata4, Hand2, Mef2c et Tbx5.

Résumé

La reprogrammation directe d’un type de cellule en un autre est récemment apparue comme un paradigme puissant pour la médecine régénérative, la modélisation des maladies et la spécification de lignée. En particulier, la conversion des fibroblastes en myocytes induits de type cardiomyocytes (iCLM) par Gata4, Hand2, Mef2c et Tbx5 (GHMT) représente une voie importante pour générer des myocytes cardiaques de novo in vitro et in vivo. Des preuves récentes suggèrent que la GHMT génère une plus grande diversité de sous-types cardiaques qu’on ne le pensait auparavant, soulignant ainsi la nécessité d’une approche systématique pour mener des études supplémentaires. Cependant, avant que la reprogrammation directe puisse être utilisée comme stratégie thérapeutique, les fondements mécanistes de la conversion de lignée doivent être compris en détail pour générer des sous-types cardiaques spécifiques. Nous présentons ici un protocole détaillé pour générer des iCLM par reprogrammation de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) médiée par GHMT.

Nous décrivons des méthodes pour l’isolement des MEF, la production de rétroviraux et l’infection par les MEF afin d’accomplir une reprogrammation efficace. Pour déterminer l’identité du sous-type des cellules reprogrammées, nous détaillons une approche étape par étape pour effectuer l’immunocytochimie sur des iCLM à l’aide d’un ensemble défini d’anticorps compatibles. Des méthodes de microscopie confocale, d’identification et de quantification des iCLM et des sous-types individuels auriculaires (iAM), ventriculaires (iVM) et stimulateurs cardiaques (iPM) sont également présentées. Enfin, nous discutons des résultats représentatifs d’expériences de reprogrammation directe prototypiques et soulignons les aspects techniques importants de notre protocole pour assurer une conversion efficace de la lignée. Dans l’ensemble, notre protocole optimisé devrait fournir une approche par étapes aux chercheurs pour mener des expériences de reprogrammation cardiaque significatives qui nécessitent l’identification de sous-types individuels de MC.

Introduction

Le cœur est le premier organe fonctionnel à se développer dans l'embryon ^{^1,} ^2. En conjonction avec le système circulatoire, il fournit de l'oxygène, des nutriments, et un mécanisme d'élimination des déchets au cours du développement. Trois semaines après la fécondation, le cœur humain bat pour la première fois et sa réglementation appropriée est maintenue par cardiomyocytes (SGC). La perte irréversible de ces cellules spécialisées est donc la question fondamentale qui sous-tend l'insuffisance cardiaque progressive. Tandis que certains organismes , tels que le poisson zèbre et Xenopus ont un po....