Method Article

Protocoles pour Visualizing stéroïdogénique organes et leurs organes interactifs avec Immunostaining dans le Fruit Fly Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/55519

⸱

April 14th, 2017

 ,  ,  , 
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance, University of Tsukuba, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons un protocole pour la dissection, la fixation et immunomarquage des organes stéroïdogenèse chez les larves de drosophile et les femelles adultes pour étudier la biosynthèse des hormones stéroïdes et son mécanisme de régulation. En plus des organes stéroïdogenèse, nous visualisons l'innervation des organes stéroïdogenèse ainsi que les cellules cibles stéroïdogenèse telles que les cellules souches germinales.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans les organismes multicellulaires, un petit groupe de cellules est doté d'une fonction spécialisée dans leur activité biogénique, ce qui induit une réponse systémique à la croissance et la reproduction. Chez les insectes, la glande prothoracique des larves (PG) et les femmes jouent un rôle essentiel de l'ovaire adulte dans les hormones stéroïdes biosynthèse principales appelées ecdysteroids. Ces organes sont innervés ecdysteroidogenic du système nerveux, à travers lequel le moment de la biosynthèse est affectée par des facteurs environnementaux. Nous décrivons ici un protocole pour visualiser les organes ecdysteroidogenic et leurs organes interactifs chez les larves et les adultes de la mouche Drosophila melanogaster, qui fournit un système modèle approprié pour étudier la biosynthèse des hormones stéroïdes et son mécanisme de régulation. dissection adroite nous permet de maintenir les positions des organes ecdysteroidogenic et leurs organes interactifs, y compris le cerveau, le cordon nerveux ventral, et d'autres tissus. Immunocoloration avec unntibodies contre enzymes ecdysteroidogenic, ainsi que des protéines de fluorescence transgéniques commandés par des promoteurs spécifiques d'un tissu, sont disponibles pour marquer des cellules ecdysteroidogenic. De plus, l'innervation des organes ecdysteroidogenic peuvent également être marqués par des anticorps spécifiques ou une collection de pilotes GAL4 dans divers types de neurones. Par conséquent, les organes ecdysteroidogenic et leurs connexions neuronales peuvent être visualisées simultanément par immunocoloration et techniques transgéniques. Enfin, nous décrivons comment visualiser les cellules souches de la lignée germinale, dont la prolifération et de maintenance sont contrôlés par ecdysteroids. Cette méthode contribue à la compréhension globale de la biosynthèse des hormones stéroïdes et son mécanisme de régulation neuronale.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans les organismes multicellulaires, un groupe de cellules est doté d'une fonction spécialisée dans leur activité biogénique qui est essentiel pour le corps entier. Pour remplir leurs missions, chaque tissu ou organe exprime une série de gènes liés à leurs fonctions et communique avec d'autres tissus pour orchestrer leurs activités dans le cadre du développement. Pour caractériser ces fonctions cellulaires spécialisées et les interactions entre les organes, nous avons besoin de spécifier un groupe de cellules ainsi que d'autres types de cellules étant conservées intactes dans l'architecture multicellulaire.

Un exemple de ces organes spécialisés est un organe stéroïdogénique, où de nombreuses enzymes biosynthétiques les étapes de médiatisent conversion du cholestérol aux hormones stéroïdes actifs 1. La plupart de ces gènes d'enzymes sont exprimés spécifiquement dans les organes stéroïdogenèse, et la voie de biosynthèse est étroitement régulée par de nombreux stimuli externes via des entrées humorale et entrées neuronales. Une fois quesynthétisés, les hormones stéroïdes sont sécrétés dans l'hémolymphe et sont destinés à de nombreux tissus et organes de régulation de l'expression d'une variété de gènes 2. Par conséquent, l'action d'une hormone stéroïde induit une réponse systémique à maintenir l'homéostasie, la croissance et la reproduction.

Pour étudier les fonctions de la biosynthèse des hormones stéroïdes et les actions pléiotropiques des hormones stéroïdes, Drosophila melanogaster peut être utilisé comme système modèle approprié. Au cours des stades larvaires, dans un organe endocrine spécialisé l'hormone stéroïde insecte, ecdystéroïde, biosynthesized appelée la glande prothoracique (PG) 3. Dans le PG, plusieurs enzymes catalysent spécifiquement ecdysteroidogenic les multiples étapes de conversion du cholestérol à l' ecdysone, qui contrôle la mue et de la métamorphose à des stades de développement appropriés 4. Par conséquent, un changement dynamique du titre ecdystéroïde est réglementépar de nombreuses voies de signalisation en réponse aux signaux environnementaux. D'autre part, dans le stade adulte, ecdystéroïde joue un rôle essentiel dans la physiologie, y compris la reproduction, le sommeil, la mémoire et la durée de vie 5, 6, 7, 8. Il est connu que ecdystéroïde est synthétisée activement dans l'ovaire, la régulation de la progression de l' ovogenèse 6, 7, 8, 9, 10, 11. Récemment , nous avons rapporté que le nombre de cellules souches germinales (CSS) est affectée par ecdystéroïde et le sexe de signalisation peptidique en réponse à l' accouplement des stimuli 12.

Des outils puissants de D. melanogaster la génétique et la biologie cellulaire, y compris l' information du génome bien annoté, gène binairesystèmes d'expression, et des techniques transgéniques ARNi, nous ont permis d'identifier des gènes essentiels à la biosynthèse ecdystéroïde dans la PG et l'ovaire 13, 14, 15. Une fois que les gènes ecdysteroidogenic sont identifiés, la régulation de la transcription de ces gènes et les dynamiques de produits Localisations de gènes peuvent être examinés dans la voie de biosynthèse 16. A cet effet, la transcription-PCR quantitative en sens inverse, l' ARN par hybridation in situ, et l' analyse immunohistologique sont effectuées. L'application de ces techniques comprend une tâche difficile; la dissection élaborée du PG ou de l'ovaire. En particulier, le PG de la mouche des fruits est relativement plus faible que celle d'autres insectes (par exemple , le ver à soie et la mouche de coup), donc on a besoin de pratiquer la compétence essentielle de la mouche des fruits dissection pour l' échantillonnage. En outre, les deux organes ecdysteroidogenic reçoivent innervations du système nerveux central (SNC) 17, 18, 19, 20. Ainsi, pour les analyses anatomiques précises, les organes ecdysteroidogenic doivent être conservés intacts ainsi que le système nerveux central et d'autres organes, de ne pas perturber leurs connexions neuronales.

Ici , nous fournissons des protocoles pour la dissection et la visualisation des organes stéroïdogenèse dans D. melanogaster. L'apprentissage de la technique de dissection est la clé point de départ de ces expériences. De plus, on peut étiqueter avec succès les organes stéroïdogenèse ainsi que leurs organes interactifs avec plusieurs anticorps et des lignes de pilote GAL4. Profitant de ces techniques, les matériaux et la génétique, on peut étudier les mécanismes complets de biosynthèse des hormones stéroïdes.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTE: Le schéma d' ensemble des protocoles est illustré à la figure 1.

1. La Dissection du larvaire Anneau Gland (RG)

NOTE: Dans D. melanogaster, qui appartient à cyclorrhaphous Diptera, le PG est dans un organe endocrine composite appelé le presse - étoupe annulaire (RG, figure 2D). Comme il est impossible que le PG est chirurgicalement séparé des autres types de cellules (voir plus loin), une cible pratique est d'isoler un RG par dissection intact et non endommagé.

  1. Préparation des larves aux stades de développement appropriés
    REMARQUE: Pour synchroniser les stades de développement des larves de D. melanogaster, il est nécessaire de ramasser les œufs dans une étroite fenêtre de temps et de recueillir les larves au moment opportun.
    1. Ramassez les œufs pendant 2 h sur une plaque d'agar-jus de raisin à 25 ° C.
    2. Recueillir nouvellement éclos 1 st larves du sous microscope à dissection avec une pince et les transférer dans un petit flacon contenant de la levure / semoule de maïs alimentaire mouche norme purée.
      NOTE: L'âge des larves est représenté par « heures après la ponte des œufs (HAEL) », « heures après l'éclosion (HAD) », ou « heures après L3 exuviation (hAL3E) ».
    3. Au point de temps approprié, recueillir les larves mis en scène avec une boucle en plastique jetable pour éviter les blessures indésirables. Afin de minimiser une différence dans la progression du développement des larves de dernier stade 3 ème, recueillir les larves du 2 ème à 70 HAEL (48 HAD) et leur permettre de muent dans des intervalles de 2 h. Ensuite, recueillir les 3 e stade larvaire dans les 2 heures après la L3 exuviation; cette procédure donne 0-2 larves hAL3E.
    4. Transférer les larves par étapes dans une boîte remplie de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
    5. Rincer les larves avec du PBS pour enlever la nourriture résiduelle du corps.
  2. Dissection grossière des larves sousmicroscope disséquant
    1. Tenez le crochet de la bouche d'une larve avec une pince. Séparer le corps de la larve au tiers antérieur de la longueur du corps en utilisant des micro ciseaux.
    2. Maintenir l'extrémité de coupe du corps de la larve antérieure avec une paire de forceps. Utilisation de l'autre paire de forceps, pousser doucement le bout de la tête vers l'intérieur du corps; cette procédure transforme le corps de la larve intérieur.
      REMARQUE: Cette étape peut être ignorée pour la dissection du 1 er stade larvaire.
    3. Répétez les étapes 1.2.1-1.2.2 avec des larves supplémentaires pendant 5-10 min.
      NOTE: Le nombre de larves doit être égale ou inférieure à 20 pour gagner du temps pour la dissection.
  3. Dissection Fillet des larves
    REMARQUE: Cette méthode permet de maintenir la position des tissus reste intacte.
    1. Laisser les larves dans l'eau seulement pendant 1 h. Les larves sont immobilisées en raison de l'asphyxie.
    2. Mettre un côté dorsal des larves dans une goutte de PBS sur un enduit de siliciumplat, avec sa face dorsale vers le haut.
      REMARQUE: La face dorsale a 2 tubes trachéaux étendant longitudinalement.
    3. Sous un microscope à dissection, insérer une broche d'insectes dans l'extrémité antérieure de la chenille en utilisant une pince. Étirer le corps de la larve de la face postérieure et mettre une deuxième broche dans l'extrémité postérieure de la larve.
      NOTE: En plus des broches d' insectes, une aiguille faite d'un fil de tungstène peut être utile 21. Une aiguille peut être incorporée dans une pointe de pipette par chauffage destiné à être utilisé comme une aiguille de dissection.
    4. Sous un microscope de dissection, faire une petite incision près de la queue avec des micro ciseaux. De l'incision, couper la cuticule dorsale longitudinalement le long de la ligne médiane dorsale vers la tête. Veillez à ne pas endommager les tissus sous la cuticule.
    5. Étirer la cuticule de paroi corporelle de chaque côté et placer 4 broches à chaque coin de la paroi de corps disséqué.
    6. Retirer une partie de corps antérieure en matière grasse avec une pince, afin d'exposer le cerveau-RG complex être exposé à la surface. Retirer une paire de glandes salivaires, le cas échéant.
  4. Fixation et coloration des tissus avec immunohistochimie
    1. Mettre le tiers antérieur du corps de larves (étape 1.2.2) dans un microtube de 1,5 ml rempli avec 500 ul de la solution de correction (4% de paraformaldehyde dans du PBS). Fixer moins de 20 échantillons en même temps, sinon PBS jointe aux échantillons fixes peuvent provoquer une dilution défavorable du fixateur. Pour la dissection de filet, retirer une goutte de PBS, puis ajouter une goutte de solution de solution.
      REMARQUE: Pour une solution de solution, soit 3,7% de formaldéhyde ou 4% paraformaldéhyde peuvent être utilisés.
    2. Incuber les tissus disséqués dans la solution de solution pendant 30 min à température ambiante (RT) ou aussi pendant 2 h à 4 ° C.
    3. Remplacer la solution de solution avec 500 ul de PBS et rincer rapidement les échantillons 3 fois. Laver pendant 15 min sur une bascule à R échantillons avec 500 uL de 0,3% PBT (PBS + 0,3% d'éthoxylate d'octylphénol)T. Pour la dissection de filet, enlever les broches d'insectes et de transférer les échantillons dans un microtube de 1,5 ml.
      NOTE: Pour augmenter la perméabilité des anticorps dans les tissus, les échantillons sont traités avec 500 ul de 2,0% PBT pendant 1-2 h sur une bascule à la température ambiante.
    4. Remplacer PBT avec 500 ul de solution de blocage (2% d'albumine de sérum bovin en PBT). Incuber les échantillons pendant 1,5 h sur une bascule à la température ambiante.
    5. Remplacer la solution de blocage avec 50 ul de la solution d'anticorps primaire, anticorps -à- dire dilué dans la solution de blocage.
    6. Incuber les échantillons pendant une nuit sur une bascule à 4 ° C.
    7. Remplacer la solution d'anticorps primaire avec 500 uL de 0,3% PBT et rincer rapidement les échantillons 5 fois. Laver les échantillons 3 fois avec 500 uL de 0,3% PBT pendant 15 minutes à chaque fois sur une bascule à la température ambiante.
    8. Remplacer PBT 0,3% avec 50 ul de la solution d'anticorps secondaire (anticorps conjugué à un colorant dilué dans la solution de blocage). Pour la coloration nucléaire, 0,5 pi 4' , 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, solution mère 0,1 mg / ml) est ajouté à une solution de 50 ul. Incuber les échantillons sur un balancier pendant 2 h à la température ambiante ou bien à 4 ° C pendant une nuit.
      REMARQUE: Conservez les échantillons dans l'obscurité.
    9. Remplacer la solution d'anticorps avec 500 ul de 0,3% PBT et rincer 5 fois. Laver les échantillons 3 fois avec 500 uL de 0,3% PBT pendant 15 minutes à chaque fois à la température ambiante.
  5. Dissection fine du complexe cerveau-RG contenant le PG et le montage
    1. Utiliser une pipette jetable pour transférer les échantillons immunocolorées à un plat rempli avec 0,3% de PBT.
      REMARQUE: Pour éviter des bulles gênantes lors de la dissection et de montage, 0,3% PBT peut être remplacé par du PBS.
    2. Sous un microscope à dissection, maintenir le crochet de cuticule ou de la bouche avec une paire de forceps. En utilisant une aiguille 27 G attachée à une seringue de 1 ml comme un « couteau », couper l'extrémité antérieure de l'œsophage et des disques oculaires pour éliminer le complexe de disque cerveau-RG-oeil de la cuticule du corps.
    3. Sepaévaluer l'oesophage et de l'intestin du complexe disque cerveau-RG yeux avec des pinces. Depuis l'œsophage passe à travers le cerveau au-dessus du cordon nerveux ventral (VNC), retirer l'intestin du côté postérieur.
      REMARQUE: Pour retirer les disques imaginaux supplémentaires à partir des échantillons, couper les liens entre le cerveau, les disques des yeux et des disques de la jambe avec un couteau à aiguille.
    4. Répétez les étapes 1.5.1-1.5.4 pour d'autres échantillons.
      Remarque: Pour éviter les débris de tissu de coller aux échantillons, transférer chaque échantillon rempli à un plat propre différent rempli avec 0,3% de PBT ou de PBS.
    5. Transférer les échantillons au centre d'une lame de verre propre avec une micropipette.
      NOTE: Pour 2 ème ou 3 ème stade larvaire, devrait être tronqué la fin d'une pointe de micropipette avec une lame de rasoir.
    6. Sous un microscope à dissection, aligner des échantillons individuels avec leur face dorsale par l'aide de pinces.
      NOTE: Le RG est situé sur la face dorsale du cerveau (figure 2A). Cet alignement facilite la spécification des échantillons individuels au cours de l'imagerie.
    7. Inclinaison vers une lame de verre et essuyer autant que possible l'excès de PBT. Mettre une goutte de réactif de montage sur un côté de la glissière. Placez le bord d'un glissement de couverture de l'autre côté de la goutte et mettre la lamelle sur les échantillons lentement avec des pinces.
      NOTE: Cette procédure empêche les échantillons de se déplacer à l'extérieur du glissement de couverture.
    8. Stocker les échantillons à 4 ° C. Gardez les échantillons dans l'obscurité.

2. Le Dissection du Ovaire en Femmes adultes

  1. Préparation des femelles adultes
    1. Alimentation mouches femelles avec de la nourriture à la mouche levure / semoule de maïs standard pour 3-4 jours pour engraisser l'ovaire. Maintenir à 25 ° C.
  2. Dissection de l'ovaire chez les femmes adultes
    1. Anesthésier mouches femelles avec du gaz CO 2 et de couper la tête.
    2. Transfert des corps de mouche à un plat de 3 cmrempli de PBS.
    3. Sous un microscope à dissection, tenir le thorax du côté dorsal en utilisant une pince. Saisir le segment abdominal A5 ou A6 avec les autres pinces et décoller la cuticule abdominale vers le côté postérieur. Essuyez la cuticule collante de la pointe de la pince.
    4. Pincez un oviducte et prendre l'ovaire du corps.
    5. Peigne et diffuser les conseils de l'ovaire avec une pince.
      REMARQUE: Cette opération améliore l'efficacité de l'immunocoloration.
  3. Dissection du cerveau des femmes adultes, VNC et les organes reproducteurs.
    NOTE: Cette méthode permet l'innervation de l'ovaire à conserver intacte.
    1. Anesthésier mouches femelles avec du gaz CO 2 et de les transférer à un plat siliconé rempli avec du PBS.
    2. Sous un microscope de dissection, tenir les rostre et éplucher la cuticule de la tête pour exposer le cerveau avec une pince. Retirer la trachée attachée au cerveau.
      NOTE: Le Brain est une structure blanche et arrondie. Le cerveau se connecte à VNC dans le thorax.
    3. Tenir le thorax sur la face dorsale et couper les pattes et les ailes avec une paire de forceps. Utilisation de l'autre paire de forceps, décoller le thorax ventral cuticule de la base des jambes. Une fois que le VNC est exposé, enlever la cuticule dorsale résiduelle et les muscles attachés à la pince à l'aide de VNC. Veillez à ne pas endommager la connexion entre le cerveau et le VNC.
    4. Utilisez une pince pour peler la cuticule abdominale et d'exposer l'ovaire et de leurs organes interactifs, y compris les neurones, la culture, l'intestin, l'oviducte, l'utérus et la glande accessary.
    5. Retirez les tissus résiduels, y compris la trachée et le corps de graisse à l'aide des pinces.
  4. Fixation et coloration des tissus avec immunohistochimie
    1. Transférer environ 8-10 paires des ovaires dans un microtube de 1,5 ml rempli avec 250 ul de la solution de correction (4% paraformaldehyde dans du PBS) et incuber les échantillons pendant 30 min à température ambiante.
    2. Remplacer la solution de solution avec 500 ul de PBS et rincer rapidement les échantillons 3 fois.
    3. Laver les échantillons 2 fois avec 500 uL de 0,1% PBT pendant 5 min chacun à TA.
    4. Remplacer PBT avec une solution de blocage de 50 ul. Incuber les échantillons pendant 1 heure sur une bascule à la température ambiante.
    5. Remplacer la solution de blocage avec 50 ul de la solution d'anticorps primaire.
    6. Incuber les échantillons pendant une nuit sur une bascule à 4 ° C.
    7. Remplacer la solution d'anticorps primaire avec 500 uL de 0,1% PBT. Laver les échantillons 3 fois avec 500 uL PBT 0,1% pendant 15 minutes chacun sur une bascule à la température ambiante.
    8. Remplacer PBT de 0,1% avec une solution d'anticorps secondaire de 50 ul. Pour la coloration nucléaire, ajouter 0,5 ul DAPI à 50 ul de la solution. Incuber les échantillons pendant 2 heures sur une bascule à la température ambiante.
    9. Remplacer la solution d'anticorps secondaire avec 500 uL de 0,1% PBT. Laver les échantillons 3 fois avec 500 uL de 0,1% PBT pendant 15 min chacun sur une bascule à la température ambiante.
      REMARQUE: La procédure de lavage peut se faire à 4 ° C pendant la nuit. Gardez les échantillons dans l'obscurité.
  5. Montage des échantillons sur des lames de verre
    1. Transférer les échantillons sur une lame de verre avec 0,1% de PBT en utilisant une micropipette.
      Remarque: Pour éviter les bulles gênantes lors de la dissection et de montage, PBT 0,1% peut être remplacée par du PBS.
    2. Pour l'ovaire, séparer les chaînes des ovarioles de l'autre avec des pinces au microscope de dissection. Ne pas blesser les conseils des ovarioles contenant les germaria. Pour l'organe reproducteur-VNC complexe du cerveau, enlever la cuticule résiduelle et organiser la position sur une lame de verre.
    3. Essuyez le plus excès PBT que possible et mettre une goutte de réactif de montage au centre des échantillons. Placez une lamelle lentement à l'aide des pinces.
    4. Stocker les échantillons à 4 ° C. Gardez les échantillons dans l'obscurité.
« > 3. Imagerie avec un balayage laser microscope confocal

  1. Observez les échantillons au microscope et amener les organes stéroïdogenèse dans le champ de vision. Une fois que le point de vue est fixe, changer le système d'imagerie dans le mode d'acquisition d'image.
    REMARQUE: Les lentilles sont utilisées objectifs 10-20x pour obtenir les images du complexe cerveau-RG ou de l'ovaire entier. En variante, les lentilles d'objectif 40-63X (eau ou immersion dans l'huile) sont utilisés pour la visualisation de la localisation subcellulaire des protéines dans les CSS ou l'innervation des neurones du PG et de l'ovaire.
  2. Mettre en place les paramètres d'acquisition d'image sur le logiciel ci-joint. Sélectionnez la combinaison de fluorescence (par exemple GFP et DP). En procédure de balayage rapide, régler la puissance du laser, la sensibilité des détecteurs (Gain / Offset), et la taille du trou d'épingle.
    REMARQUE: Pour obtenir des images à haute qualité, doivent être optimisés la puissance du laser à balayage et la sensibilité du détecteur (gain) pour chaque échantillon. Pour définir la formedes tissus, une image de lumière transmise peut être prise en plus d'une image fluorescente.
  3. Prenez des piles Z des images. Lors d'une analyse rapide continue, déplacer le plan focal avec le lecteur de mise au point du microscope et définir la position de départ et la position finale. Le nombre de tranches et la distance entre les tranches d'intervalle sont ajustées en conséquence.
  4. Sélectionnez la vitesse de balayage, la méthode de balayage et le mode de balayage bidirectionnel.
  5. « Démarrer les vrais scans » pour l'acquisition d'images.
  6. Enregistrez l'image avec le format du logiciel ci-joint.
    REMARQUE: Les fichiers d'image d'origine contient les informations des paramètres d'acquisition d'image et échelles. Les images exportées peuvent être traitées à l' aide d' un logiciel de traitement d'images sur l'ordinateur 22.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons utilisé les protocoles ci - dessus pour visualiser les organes stéroïdogenèse et leurs organes interactifs larves de D. melanogaster et les femelles adultes. Le schéma d' ensemble des protocoles est illustré à la figure 1.

Le RG, y compris le PG (Figure 2D), est plus petit et plus transparent que le cerveau et est situé au niveau du côté antérieur-dorsale du cerveau (figure 2A-C et 3A-E). Pour marquer les cellules PG, plusieurs groupes ont produi...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons étudié la biosynthèse ecdystéroïde et son mécanisme de réglementation D. melanogaster, et a élaboré un protocole de dissection et immunomarquage. Le moment de la biosynthèse ecdystéroïde est affectée par des facteurs environnementaux à travers les entrées de neurones 33, il est donc essentiel de maintenir l'innervation des organes ecdysteroidogenic ainsi que le cerveau, VNC, et d' autres tissus lors de la dissection.

Comme décrit ci - dessu...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions Reiko Kise et Tomotsune Ameku pour leur soutien technique pour ce travail. Nous sommes également reconnaissants envers Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko koto, Masayuki Miura, le Stock Center drosophile Bloomington, KYOTO Stock Center (DGRC), et les études de développement Hybridome Banque pour les stocks et réactifs. Ce travail a été soutenu par des subventions à YSN de JSPS KAKENHI Grant Numéro 16K20945, La Fondation Naito et Inoue Prix scientifique de la recherche; et par une subvention à RN de MEXT KAKENHI Grant Numéro 16H04792.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
collecte d’œufs forts
culture tissulaire (55 mm)AS ONE1-8549-02  ; pour assiettes d’agar au jus de raisin
tasse de collecteHIKARI KAGAKU
pâtede levure Levure sèche orientale, Tokyo
100 % jus de raisinWelch Food Inc.
élevées
petites fioles (12ml, 40&fois ; 23,5 mm, PS)SARSTEDT58.487
boucle jetableAS ONE6-488-01
nourriture standard pour mouches  ; le recepi us sur le site web du centre de stock Blooington.
Microscope dissection fort>
Carl ZeissStemi 2000-C
Microscope de dissectionLeicaS8 AP0
Boîte de culture tissulaire (35 x 10 mm, non traitée)IWAKI1000-035
SylgardTORAYsilicone coarting à l’intérieur des boîtes
Aiguille Terumo (27G, 0,40 x 19 mm)  ;TERUMONN-2719SUn « couteau » pour couper les pinces à tissus
, Inox, #5Dumont, Suisse
épingle à insectes (0,18 mm de diamètre)Marquepour dissection de filets
micro ciseauxNATSUME SEISAKUSHO CO LTD.  ;MB-50-10
fixation
eau ultrapureMerck Millipore
phosphate salin tamponné (PBS)
FormaldéhydeNacalai tesque16222-65
ParaformaldéhydeNacalai tesque02890-45
Triton-X100Nacalai tesque35501-15
microtubes (1,5 ml)INA OPTIKACF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker)As oneTM-300rocker
Bovine Serum AlbuminSIGMA9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (cobaye), 1:1000
anti-GFP (lapin), 1:1000Sondes moléculairesA6455Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mAb de souris, GF200), 1:100Nakarai tesque04363-66
anti-5HT (lapin), 1:500SIGMAS5545
anti-Hts 1B1 (souris)Banque d’hybridomes d’études développementales (DSHB)1B1
anti-DE-cadhérine (rat), 1:20DSHBDCAD2
anti-nc82 (souris), 1:50DSHBnc82
secondary antibody
goat anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire, Alexa Fluor 488 conjuguéLife TechnologiesA-11008
Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, conjugué Alexa Fluor 488TechnologiesA-11001
Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, conjugué Alexa Fluor 546Life TechnologiesA-11081
Anticorps secondaire IgG (H+L) anti-cobaye de chèvre, conjugué Alexa Fluor 555 LifeTechnologiesA-21435
Alexa Fluor 546 phalloïdine conjuguée à un colorantLife TechnologiesA-22283
Réactifs de montage
slide glassMatsunami Glass Ind.,Ltd.SS7213
Verre de couverture de microscope carréMatsunami Glass Ind., Ltd.
Réactif FluorSave (Réactif de montage)Calbiochem345789
Pipette de transfert 1 ml (Compte-gouttes jetable)WATSON5660-222-1S
imaging
LSM700 Système de microscope laser à balayageZeissinversé Axio Observer. Z1 SP gauche
traitement d’image
LSM700 ZENCarl Zeiss Il s’agitd’une interface utilisateur spéciale basée sur le système d’exploitation 64 bits de Microsoft Windows7
ImageJ
Fly stocks
w ; GMR45C06-GAL4  ; du Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS&ndash ; GFP ; UAS&ndash ; mCD8 ::GFPdons de K. Ito, Université de Tokyo.
w[1118]
w ; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w ; UAS-mCD8 ::GFP ; TRH-GAL4voir dans Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w ; UAS-mCD8 ::GFP  ; du Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw ;; nSyb-GAL4  ; du Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)
Shiga Life Micro C218181 Carl

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
  2. Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
  3. Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
  4. Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
  5. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
  6. Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
  7. Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
  8. Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
  9. Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
  10. Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
  11. Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32(2015).
  12. Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123(2016).
  13. Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
  14. Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O'Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
  15. Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O'Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
  16. Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
  17. Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
  18. Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
  19. McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
  20. Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778(2014).
  21. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  22. Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
  23. Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
  24. Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
  25. Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
  26. Parvy, J. -P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
  27. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  28. Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
  29. Li, H. -H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
  30. Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806(2010).
  31. Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
  32. Song, X., Zhu, C. -H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
  33. Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
  34. Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
  35. Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
  36. Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712(2015).
  37. Yamanaka, N., Marqués, G., O'Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
  38. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  39. Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211(2015).

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