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Article de méthode

Racine Dorsale Ganglion Injection et Racine Dorsale Crush blessures comme modèle pour la régénération sensorielle Axon

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⸱

DOI :

10.3791/55535

⸱

3 mai 2017

 ,  , 
1John van Geest Center for Brain Repair, University of Cambridge, 2School of Medicine, University of St. Andrews, 3Department of Biological Sciences, University of Southampton

Dans cet article

Résumé

Ce protocole présente l’utilisation d’une injection de ganglion de la racine dorsale (DRG) avec un vecteur viral et d’une lésion concomitante par écrasement de la racine dorsale chez un rat adulte comme modèle pour étudier la régénération sensorielle des axones. Ce modèle convient à l’étude de l’utilisation de la thérapie génique pour favoriser la régénération sensorielle des axones.

Résumé

Réaliser la régénération axonale après une lésion du système nerveux est une tâche difficile. Étant donné que les différentes parties du système nerveux central (SNC) diffèrent les unes des autres sur le plan anatomique, il est important d’identifier un modèle approprié à utiliser pour l’étude de la régénération axonale. En utilisant un modèle approprié, nous pouvons formuler un traitement spécifique en fonction de la gravité de la blessure, du type de cellule neuronale d’intérêt et du tractus rachidien souhaité pour évaluer la régénération. Dans la voie sensorielle, les neurones DRG sont responsables de la transmission des informations sensorielles de la périphérie vers le SNC. Nous présentons ici un protocole qui utilise une injection de DRG avec un vecteur viral et une lésion concomitante par écrasement de la racine dorsale dans la moelle épinière cervicale inférieure d’un rat adulte comme modèle pour étudier la régénération sensorielle des axones. Comme démontré à l’aide d’un virus témoin, AAV5-GFP, nous montrons l’efficacité d’une injection directe de DRG dans la transduction des neurones DRG et le traçage des axones sensoriels dans la moelle épinière. Nous montrons également l’efficacité de la blessure par écrasement de la racine dorsale dans la dénervation de la patte avant en tant que modèle de blessure pour évaluer la régénération axonale. Malgré la nécessité d’une formation spécialisée pour effectuer cette procédure chirurgicale invasive, le protocole est flexible et les utilisateurs potentiels peuvent modifier de nombreuses pièces pour répondre à leurs exigences expérimentales. Il est important de noter qu’il peut servir de base pour ceux qui sont à la recherche d’un modèle animal approprié pour leurs études. Nous pensons que cet article aidera les nouveaux utilisateurs à apprendre la procédure de manière très efficace et efficiente.

Introduction

La réalisation de la régénération axonale après une lésion du système nerveux est une tâche difficile 1. Pour étudier l'échec de la régénération axonale dans le système nerveux central (SNC), les chercheurs ont utilisé une pléthore de modèles de lésions nerveuses. Comme les régions du système nerveux central diffèrent, il est important d'utiliser un modèle anatomique approprié pour étudier la régénération des axones. En utilisant le modèle approprié, les chercheurs peuvent formuler un traitement spécifique en fonction de la gravité des blessures, le type d'intérêt des cellules neuronales, et les voies de la colonne vertébrale souhaitée pour l'évaluation de la régénération, par opposition à un « un pour tous » stratégie de traitement.

Dans lésion de la moelle épinière, par exemple, les symptômes les plus débilitants proviennent de la perte de la sensation et de la locomotion. La perte de sensation est causée par des dommages aux voies sensorielles ascendant, alors que la perte de locomotion est causée par des dommages aux voies motrices descendantes. En raison des différences cellulaires et anatomiques entre ces two les voies, de nombreuses études de régénération des axones ciblées se concentrent uniquement sur l'un ou l'autre voie, la raison d'être que la reprise réussie des deux serait un avantage énorme pour les patients. Dans cet article, nous présentons un protocole qui utilise une injection ganglions de la racine dorsale directe (DRG) avec un vecteur viral et une lésion par écrasement simultané de la racine dorsale dans la moelle épinière cervicale inférieure d'un rat adulte en tant que modèle pour étudier la régénération des axones sensoriels.

DRG neurones sensoriels sont responsables de la transmission de l'information sensorielle, comme sensation tactile et la douleur, de la périphérie vers le système nerveux central. Les longues projections axonales de neurones sensoriels de la moelle épinière constituent un bon modèle pour étudier la régénération axonale à longue distance. En outre, comme les rongeurs peuvent survivre à une lésion de la voie sensorielle comme une blessure à l'écrasement de la racine dorsale avec des complications de protection minimales, les chercheurs peuvent étudier du système nerveux central la régénération des axones sans la nécessité de lésion complètement la moelle épinière. Un quadruple C5 - C8 (l cervicalEvel 5 - 8) racine lésion par écrasement dorsale a été démontré être un modèle utile pour forepaw déafférentation 2. En outre, une blessure à l'écrasement de la racine dorsale fournit un « plus propre » modèle pour étudier la régénération axonale qu'une lésion de la moelle épinière directe car il est simple par d'autres facteurs tels que la formation de cicatrice gliale.

L'utilisation de la thérapie génique virale neurones dans un reprogrammez état de régénération a été de plus en plus considéré comme une stratégie thérapeutique prometteuse pour de nombreuses affections neurologiques 3. Des études ont montré l'application d'un vecteur portant le transgène d'une protéine favorisant la croissance de virus adéno-associé (AAV) peut réaliser la régénération des axones robuste avec récupération comportementale 4, 5, 6. La pathogénicité apparemment faible de l'AAV pour induire une réponse immunitaire et la capacité de transduire des cellules non en division, telles que les neurones, faitesil le vecteur optimal pour la thérapie génique. De plus, la forme de AAV recombinant est utilisé pour la thérapie. Sous cette forme, il est incapable d'intégrer son génome viral dans le génome hôte 7, ce qui réduit le risque de mutagenèse insertionnelle par rapport à d' autres vecteurs viraux, tels que lentivirus. Cela rend AAV un choix sûr pour les applications de thérapie génique.

En tant que DRG contient les corps cellulaires des neurones sensoriels, il est la cible anatomique la plus appropriée pour l'administration du virus pour la thérapie génique pour étudier et / ou favoriser la régénération axonale sensorielle. Dans une étude comparant différents sérotypes d'AAV et des lentivirus, sérotype AAV 5 (AAV5) a été représenté pour être le plus efficace dans la transduction neurones DRG sur un parcours de temps d'au moins 12 semaines lorsqu'il est injecté directement dans le DRG 8. De plus, l'AAV peut atteindre plus de 40% l'efficacité de transduction, tous les sous-types de neurones transduction DRG, tels que le grand diamètre neurofilament 200 kDa(NF200) -positif neurones et le petit diamètre de la calcitonine gene-related peptide (CGRP) - ou isolectine B4 (IB4) -positif neurones 4, 8.

Comme la procédure chirurgicale d'injection DRG et la racine lésion par écrasement dorsale est extrêmement envahissante et délicate, nous pensons que cet article vous aidera les nouveaux utilisateurs à apprendre la procédure d'une manière très efficace. Dans cet article, nous montrons des résultats représentatifs de rats adultes quatre semaines après l'injection d'un virus de contrôle AAV5-GFP (protéine fluorescente verte) en C6 - C7 DRG avec une C5 concurrente - C8 racine lésion par écrasement dorsale. Ce modèle est particulièrement adapté pour les chercheurs qui enquêtent sur l'utilisation de la thérapie génique virale pour favoriser la régénération axonale sensorielle.

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Protocole

Toutes les procédures animales suivantes ont été menées conformément au Royaume-Uni Animaux (Procédures scientifiques) de la Loi sur 1986. Si vous ne connaissez ces procédures, s'il vous plaît vérifier avec les réglementations locales / nationales et consulter un vétérinaire avant de commencer le protocole.

1. Choisir une souche appropriée des animaux

NOTE: Un des résultats de la racine dorsale de blessure à l'écrasement de la perte de la sensation et la patte déafférentation. Les effets indésirables fréquents de forepaw déafférentation peuvent inclure plus-toilettage, l'auto-mutilation, et la patte autotomie.

  1. Obtenir des animaux pour la procédure.
    NOTE: Pour les rats, les souches plus actives, comme Lister-capuche et Wistar, ont une incidence plus élevée de la patte autotomie après déafférentation par rapport aux souches les plus dociles, comme Lewis et Sprague-Dawley. Si possible, la souche la plus docile, Lewis, doit toujours être considéré comme premier. Au cas où une souche particulièrement active nécessaire pour l'expérience en raison de m génétiqueodification ou exigences d'évaluation du comportement spécifiques, un traitement vétérinaire devraient être mises en place pour contrer les effets défavorables attendus.

2. Préparation du virus pour injection

ATTENTION: Manipuler tous les virus conformément à la réglementation de sécurité biologique et de laboratoire.

  1. Diluer ou concentrer le virus à un titre de 2 x 10 12 copies de génome (GC) / ml en suivant des protocoles de conditionnement de virus individuel 9.
    REMARQUE: Ici, le virus a été dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (D-PBS) avec 5% de saccharose. Le titre peut être optimisé en fonction du type de virus, promoteur, calculer la taille et le type de cellule ciblée.
  2. Facultatif: ajoutez 1% de colorant de couleur (par exemple, vert rapide) à la solution de virus pour faciliter la visualisation de l'injection plus tard. Mélanger très doucement la solution.
  3. Conserver la solution sur de la glace pour une utilisation immédiate (dans les 4 h) ou dans un congélateur -80 ° C à longstockage à long terme.

3. Effectuer la préparation pré-opératoire de l'animal

NOTE: En raison de l'extrême invasivité de la chirurgie, les techniques d'asepsie doivent être utilisées à tout moment.

  1. Préparer et stériliser tous les instruments chirurgicaux et le cadre stéréotaxique de la colonne vertébrale avant de commencer l'opération. Par exemple, stériliser les outils dans un autoclave à 134 ° C. Utilisez un jeu d'outils stérilisés pour chaque animal.
  2. Anesthésier l'animal. Confirmez insensibilisation correcte en pinçant la patte pour tester le réflexe de retrait ou en touchant la cornée pour le réflexe des paupières.
    1. Pour les rats adultes à l'aide de l'anesthésie par inhalation tels que l'isoflurane, utiliser isoflurane 4% dans 2,0 L / min d'oxygène pour l'induction. Pour l'entretien tout au long de l'intervention chirurgicale, en utilisant 2-3% d'isoflurane dans 1,5 L / min d'oxygène, en faisant varier la concentration d'isoflurane selon le modèle de respiration de l'animal pour éviter sur- ou sous-dosage.
  3. SurcE l'animal est d'abord anesthésié, enregistrer le poids pré-opératoire de l'animal.
  4. Pour l'injection de DRG cervical, raser la fourrure sur le col d'entre les oreilles juste en aval de la scapula. Désinfecter la zone rasée avec un produit antiseptique.
  5. Injecter 2 ml de sérum physiologique par voie sous- cutanée dans le flanc de l'animal, avec une dose appropriée d'analgésique (par exemple, 5 mg / kg carprofène) et un antibiotique (par exemple, 5 mg / kg d' enrofloxacine).
  6. Appliquer une pommade oculaire à la fois les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée au cours de la procédure.
  7. Procéder à une intervention chirurgicale sur un cadre stéréotaxique de la colonne vertébrale avec un coussin chauffant à 37 ° C placé au-dessous de l'animal.

4. Injecter DRG et la réalisation d'une blessure Crush Racine Dorsale

NOTE: Ceci est une opération extrêmement délicate. Il est conseillé de pratiquer sur quelques animaux morts d'abord de se familiariser avec l'anatomie avant de passer à vivre la chirurgie animale.

  1. Locate proéminents C2 et T2 apophyses épineuses sur la peau. Faire une incision de la peau entre les C2 et T2 processus épineux avec une lame de scalpel n ° 10 (une fois que la peau est ouvert, une ligne médiane blanc, fibreux du tissu doit être visible sur la première couche de muscle, la première couche de muscle a un " comme de la gelée » texture).
  2. Faire une incision de taille similaire sur la première couche de muscle le long de la ligne médiane blanche en utilisant une lame de scalpel. Ne pas aller au-delà du T2 important processus épineux, car il y a une importante branche artérielle de l'aorte descendante située près de là.
    NOTE: Des saignements abondants peut se produire n'importe où à partir de cette étape en avant. Toujours arrêter le saignement et retirer le sang en utilisant des cotons tiges stérilisées ou des éponges chirurgicales absorbables pour permettre une visualisation claire en tout temps. En procédant à la procédure « à l'aveugle » peut entraîner des dommages indésirables à la moelle épinière, DRG, ou la racine dorsale, entraînant des effets indésirables inattendus chez l'animal plus tard.
  3. Rentrez lapremière couche de muscle en utilisant deux enrouleurs, l'un placé rostrale et une caudale; la seconde couche de muscle, avec une apparence striée, doit être visible.
  4. Localiser la ligne médiane de la deuxième couche de muscle (où on peut observer deux muscles longitudinaux reliés par un tissu membraneux mince). On dissèque le tissu membraneux en utilisant une paire de microciseaux pour séparer les deux muscles longitudinaux. Évitez d'utiliser une lame de scalpel si possible, car cela pourrait entraîner des dommages musculaires inutiles et des saignements.
  5. Ajuster les écarteurs en conséquence pour exposer la troisième couche de muscle mince recouvrant la colonne vertébrale. Les apophyses peuvent se faire sentir en touchant légèrement avec une paire de pinces sur la troisième couche de muscle.
  6. Faire une petite incision sur la troisième couche de muscles en utilisant microciseaux et gratter délicatement le muscle de l'os à l'aide d'une curette ou scalpel d'une manière sideway d'exposer clairement les vertèbres. Si nécessaire, couper une partie du muscle ou d'un tendon loin de faire l'Laminectomy plus facile.
  7. Pour exposer la gauche C5 - C8 DRG, effectuer un hémi-laminectomie sur la gauche C4 - vertèbres T1 en enlevant soigneusement une partie de la lamina et de pédicule en utilisant une paire de pinces-gouges fines. Le DRG est situé à proximité du foramen transverses des vertèbres.
    NOTE: C3 - C7 vertèbres n'ont pas un processus important spinous. Le C5 DRG est situé entre les vertèbres C4 et C5, C6 DRG est entre les vertèbres C5 et C6, et ainsi de suite, tandis que le C8 DRG est entre les vertèbres C7 et T1. Il n'y a pas vertèbre C8, en dépit de la présence d'un DRG C8 et un segment de la moelle épinière C8.
  8. Une fois que suffisamment de DRG a été exposé pour l'injection, préparer la seringue en plaçant la seringue microlitre rempli virus muni d'une mesure, aiguille émoussée de calibre 33 sur le porte-seringue stéréotaxique. Avant injection, utiliser une aiguille de calibre 30 en biseau pour faire une petite ouverture superficielle sur chacun des DRG ciblée pour aider à l'insertion de l'aiguille d'injection.
  9. Insérez le 33-gaiguille auge dans le centre du DRG en tournant les boutons doucement pour ajuster les coordonnées stéréotaxiques. Ne pas trop insérer l'aiguille, car cela pourrait provoquer une fuite de liquide à partir de la face ventrale du DRG. En cas de fuite, ajuster immédiatement la position de l'aiguille.
    REMARQUE: Les coordonnées stéréotaxiques numériques ne sont pas utilisés; Cependant, il est utile d'utiliser le cadre pour maintenir l'aiguille pour l'injection.
  10. Injecter 1 ul de virus dans chaque DRG à 0,2 ul / min en utilisant une pompe seringue de perfusion. Attendre pendant trois minutes supplémentaires avant de retirer l'aiguille. Lors de l'injection, le DRG changera lentement la couleur si la solution de virus contient un colorant.
  11. Pour effectuer une C5 simultané - C8 lésion par écrasement de la racine dorsale, écraser chaque racine trois fois pour chaque 10 s en utilisant une paire de pinces à pointe fine (Bonn Micro), les extrémités opposées de la pince complètement; une ligne blanche dans le tissu doit apparaître sur le site d'écrasement. Ne pas aller plus loin que nécessaire avec le forcEPS, car cela peut causer des dommages à la racine ventrale.
  12. Après l'injection et / ou écraser, assurez-vous qu'il n'y a pas de saignement ou de petits morceaux de fragments d'os laissés sur le site d'incision avant de fermer l'animal. Si l'on préfère, placer un petit morceau d'éponge absorbable chirurgicale sur le dessus de la moelle épinière exposée et DRG.
  13. Laisser la troisième couche du muscle se rétracter naturellement sur la colonne vertébrale sans suturer. suturer sans serrer les deux muscles longitudinaux sur la seconde couche (≈ 3 sutures interrompues) avec un matériau absorbable 6-0 de suture. Suturer la première couche de muscle (≈ 5 sutures interrompues) avec un matériau absorbable 6-0 de suture.
  14. Suturer la peau avec 5-0 absorbable matériau de suture (10 ≈ interrompu sutures).
    REMARQUE: Assurez-vous que les points de suture ne sont pas trop serrés. Bombement de la peau est un signe de serrage trop fort et peut causer de l'inconfort à l'animal.
  15. Si des saignements abondants survenue pendant la chirurgie, injection sous-cutanée 1 - 2ml de solution saline pour reconstituer la perte de liquide de l'animal tel que permis par la réglementation locale.
  16. Fournir un gel hydratant comestible et permettre à l'animal de récupérer pleinement de l'anesthésie, d'effectuer un suivi régulier pendant au moins 1 h avant de retourner l'animal vers la zone de maintien.
  17. Gardez l'animal pendant au moins 3 semaines pour une expression optimale du transgène pour évaluer la régénération axonale sensorielle.

5. Effectuer les soins post-opératoires de l'animal

  1. Fournir purée alimentaire et une literie de coton doux pour l'animal au cours de la première semaine après la chirurgie. Si nécessaire, administrer des doses supplémentaires d'analgésiques et d'antibiotiques pour aider à la récupération conformément aux réglementations locales / nationales et des conseils vétérinaires.
  2. Retirer les sutures sur la peau après 7 - 10 jours.
    NOTE: Les effets indésirables fréquents de la chirurgie comprennent la formation de sérome ou hématome au site d'incision, gratter les marques sur la peau en raison de la démangeaison causée parles sutures absorbables internes, subtils déficits sensoriels ou locomotion, et des signes d'auto-mutilation sur la patte déafférenté après la blessure à l'écrasement de la racine dorsale. Pour tous les problèmes de bien-être qui sont beaucoup plus graves que prévu, demander des conseils vétérinaires immédiats.

6. Exécution d'une injection antérograde pour PFE axonale Tracing

NOTE: Il est recommandé d'effectuer la sous-unité B de la toxine du choléra (PFE) axonale tracer une semaine avant la collecte des tissus.

  1. Préparer une solution PFE 1% selon les instructions du fabricant.
  2. Facultatif: ajoutez 1% de colorant de couleur à la solution pour faciliter la visualisation de l'injection plus tard. Mélanger très doucement la solution.
  3. Anesthésier l'animal (voir étape 3.2.1) et stabiliser la gauche forepaw en collant le membre à la table.
  4. Manuellement et injecter lentement 1 pi de 1% CTB sous-cutanée dans le centre du coussinet plantaire glabre et quatre chiffres à l'aide d'une seringue équipée wi microlitresTh A mesure, aiguille de calibre 33 court.
    REMARQUE: Avant l'injection, il aide à utiliser d'abord une 30 aiguille de calibre biseautés pour faire une petite ouverture superficielle sur la peau, qui aide à l'insertion de l'aiguille d'injection.
  5. Laisser l'animal se remettre complètement de l'anesthésie avant de retourner l'animal dans la zone de maintien.

7. Collecte des tissus

  1. Pour récupérer le DRG injecté le virus et la moelle épinière pour l'immunohistochimie, administrer une surdose d'anesthésique et transcardiaque perfuser l'animal avec une solution saline tamponnée au phosphate froid suivi par 4% de paraformaldehyde. effectuer soigneusement une laminectomie complète sur la colonne vertébrale pour recueillir le tissu fixé au microscope. Procéder à la préparation de tissu, de sectionnement et de traitement tel que requis pour l' analyse 4, 5, 6.
    NOTE: Le site d'incision récupéré doit être apparente, comme l'a constaté la présence de stissu de voiture.
  2. En variante, pour recueillir le DRG injecté le virus de la culture in vitro, sacrifier l'animal avec humanité avec une méthode approuvée, telle qu'une concentration croissante de dioxyde de carbone. Soigneusement disséquer le DRG au microscope, assurant des conditions aseptiques chaque fois que possible. Procéder à la culture de tissus comme souhaité 4, 5, 6, 10.

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Résultats

En tant que représentation, est présentée une section de la moelle épinière transversale avec le DRG attaché à montrer l'efficacité de ce protocole dans la transduction neurones DRG et le traçage des axones sensoriels de la moelle épinière quatre semaines après l'injection d'un virus de commande, AAV5-GFP, directement dans le C7 DRG sans une blessure à l'écrasement de la racine dorsale (figure 1A). Axones dans les deux la colonne dorsale et la corne dorsa...

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Discussion

Dans cet article, nous présentons un guide étape par étape pour effectuer une injection de DRG et la racine lésion par écrasement dorsale de la moelle épinière cervicale inférieure d'un rat adulte. Comme il est une chirurgie très invasive et délicate, nous recommandons vivement que tous les utilisateurs potentiels obtiennent une formation suffisante et pratique avant de passer à vivre la chirurgie animale. Les utilisateurs doivent se familiariser non seulement avec l'anatomie de la moelle épinière, mais aussi av...

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Déclarations de divulgation

James Fawcett est consultant rémunéré pour Acorda Therapeutics et Novartis.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Christopher et Dana Reeve Foundation, le Conseil de recherches médicales, le Conseil européen de la recherche ECMneuro et le Centre de recherche biomédicale Cambridge NHMRC. Nous tenons à exprimer notre profonde gratitude à Heleen Merel van « t Spijker et Justyna Barratt pour leur assistance technique pendant le tournage. Nous tenons à remercier le Dr Elizabeth Moloney et le professeur Joost Verhaagen (Institut néerlandais des neurosciences) pour aider à la production d'AAV.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Vert rapide Colorant FCFSigma-AldrichF7258Pour la visualisation d’une solution incolore. Concentration recommandée : 1 %
Sous-unité de la toxine B du choléraListe Laboratoires biologiques104Pour le traçage axonal antérograde. Concentration recommandée : 1 %
IsoFloZoetis115095Anesthésique par inhalation (principe actif : isoflurane)
Baytril 2,5 % injectableBayer05032756093017Antibiotique (principe actif : enrofloxacine). Posologie recommandée par le fabricant : 10 mg/kg
de Carprieve 5,0 % p/vNorbrook02000/4229(matière active : carprofène). Dosage recommandé par le fabricant : 4 mg/kg
Lacri-LubeAllerganPL 00426/0041Pommade pour
les yeux Olsen-Hegar Porte-aiguilleOutils pour les sciences finesFST 12502-12
Friedman Pearson Rongeur Tasse incurvée de 0,7 mmOutils pour les sciences finesFST 16121-14
Bonn Micro ForcepsOutils pour les sciences finesFST 11083-07Pour effectuer l’écrasement de la racine dorsale
Ciseaux de séparation des tissusOutils de science fineFST 14072-10
Ciseaux finsOutils de science fineFST 14058-11
Pince Micro-AdsonOutils de science fineFST 11018-12
Écarteur GoldsteinOutils de science fineFST 17003-03
Ciseaux à ressort Vannas (droits)Outilsde science fineFST 15018-10
SURGIFOAM Éponge résorbable en gélatineEthicon1972Pour le contrôle des saignements
Seringue Microliter RN701 (10 &mu ; L)Hamilton80330
Aiguille amovible sur mesure (pour injection DRG)Hamilton7803-05Calibre 33, 38 mm, pointe 3
Aiguille amovible sur mesure (pour injection CTB)Hamilton7803-05Calibre 33, 10 mm, pointe 3
UltraMicroPump avec contrôleur SYS-Micro4World Precision InstrumentsUMP3-1
d’analgésique

Références

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